Vật liệu và phương pháp nghiên cứu phụ gia thực phẩm

Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 43 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất * Nguyên liệu Saccharomyces cerevisiae của công ty men thực phẩm Mauri La Ngà, Đồng Nai - Độ ẩm ( %): < = 6.0 - Tỷ lệ men sống (%): >= 95 - Số tế bào nấm men ( tỷ/g): >= 25-30 - Khả năng chịu cồn: 10-16% - Nhiệt độ bảo quản: 20 – 28oC - Màu: nâu vàng nhạt, chỉ có tế bào nấm men, không có phụ gia khác - Mùi: đặc trưng của nấm men * Chất ding dưỡng cho nấm men (NH4)2PO4 ; (NH2)2CO thương mại của Trung Quốc hoặc Merck (Đức) * Hóa chất - Ethanol 99% ( Trung Quốc) - NaCl tinh khiết 99% (Merck) - Chất chuẩn IMP, GMP (Sigma-Aldrich) - Cột sắc ký ( pha tĩnh) C-18 (Merck) - Formaldehyde solution (Merck) - NaOH rắn (Merck) - K2SO4 (Trung Quốc) - MgO (Trung Quốc) - HCl 0.1N (Trung Quốc) - Chỉ thị Phenolphthalein (Trung Quốc) - Acetonitril (Merck) Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 44 - Acid phosphoric 0.05% (Merck) - Dung dịch CCl3COOH 5 -10% (Merck) - Dung dịch NaOH 1N (Merck) - Dung dịch đệm ly giải L6 gồm: Guanidine thiocyanate (Fluka) 120g Tris, HCl 0.1M pH 6.4 100ml EDTA 0.2M pH 8.0 22ml Triton X-100 2.6ml - Ethanol 80% (Trung Quốc) * Enzyme Enzyme do hãng Amano Enzyme Inc. 2-7, 1-Chome, Nishiki, Naka-ku, Nagoya 460- 8630 Japan cung cấp bao gồm 4 loại: 1. Enzyme YL-ZL “ Amano” - Phân loại: protease trung tính - Màu: nâu đỏ nhạt - Trạng thái: lỏng - Hoạt tính: lớn hơn 350 units/ml - Tỷ trọng (g/ml): 1,20 - Sản xuất từ: Bacillus subtilis - Quá trình sản xuất: bằng cách lên men vi khuẩn Bacillus subtilis - Bảo quản: nơi khô thoáng 2. Enzyme Umamizyme - Phân loại: là enzyme protease kết hợp aminopeptidase - Màu: nâu nhạt - Trạng thái: bột - Hoạt tính: lớn hơn 70 units/g Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 45 - Tỷ trọng (g/ml): 1.25 - Sản xuất từ: Aspergillus oryzae - Quá trình sản xuất: từ quá trình lên men giống Aspergillus oryzae chọn lọc - Bảo quản: nơi khô mát 3. Enzyme RP-1G - Phân loại: là enzyme phosphodiesterase - Màu: trắng nâu - Trạng thái: bột mịn - Hoạt tính: lớn hơn 7000 units/g - Tỷ trọng (g/ml): 1,26 - Sản xuất từ: Penicilium citrinum - Quá trình sản xuất: bằng cách lên men Penicilium citrinum - Bảo quản: nơi khô thoáng và dưới 250C 4. Enzyme Deamizyme - 50 000G - Phân loại: là enzyme 5’-Adenylic Deaminase - Màu: nâu nhạt - Trạng thái: bột mịn - Hoạt tính: nhỏ hơn 50 000 units/mg - Tỷ trọng (g/ml): 1, 26 - Sản xuất từ: Aspergillus melleus - Quá trình sản xuất: bằng quá trình lên men nấm mốc Aspergillus melleus - Bảo quản: nơi khô mát 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ * Thiết bị Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 46 - Máy HPLC detector RF 10A XL và UV-Vis SPD 20A Shimazdu - Bộ cất đạm Kjeldahl bán tự động VAPODEST 30 Gerhardt - Máy đo mật độ quang học Spectro UV-Vis Auto USA - Máy đo pH EUTECH pH510 USA - Bể rửa siêu âm ELMASONIC S100H USA - Cân sấy ẩm SARTORIUS MA150 Germany - Cân phân tích 3 số lẻ OHAUS ADVENTURER AR3130 USA - Cân phân tích 4 số lẻ SARTORIUS CP 224S Germany - Tủ sấy ECOCELL 111 lít Germany - Tủ ấm ổn nhiệt INCUCELL 111 lít và 55 lít Germany - Tủ lạnh HITACHI JAPAN * Dụng cụ - Nhiệt kế thủy ngân 0 – 160oC - Bình hút ẩm - Bình định mức 50ml, 100ml, 500ml, 1000ml - Bếp đun - Oáng phá mẫu Velp 250 ml - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Oáng đong 30ml, 50ml, 100ml - Becher 50ml, 100ml, 250ml, 500ml - Que thử cảm quan mùi, muỗng thử cảm quan vị - Oáng nghiệm - Pipette Và các dụng cụ cơ bản khác trong phòng thí nghiệm Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 47 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 48 2.2.2 Qui trình thực hiện thí nghiệm sản xuất dịch chiết xuất nấm men 2.2.3 Xác định chất lượng nấm men Chất lượng nấm men được đánh giá dựa trên các yêu cầu: * Đánh giá cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 5104:90 Màu sắc: nấm men phải có màu kem đến vàng nhạt Trạng thái: nguyên vẹn dạng khối, không vụn nát Mùi: mùi đặc trưng của nấm men Nấm men bánh mì Rửa với nước vô khuẩn tách cặn Khảo sát tự phân bằng NaCl + ethanol Khảo sát các điều kiện sử dụng bổ sung bốn loại enzyme thương mại: YL-NL, Umamizyme, RP- 1G và Deamiazyme 50000G Ly tâm tách cặn không tan Kiểm tra đánh giá mùi, vị Bán thành phẩm dịch chiết xuất nấm men Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 49 * Kiểm tra tính chất hóa lý Độ ẩm theo: sấy đến khối lượng không đổi hoặc dùng cân sấy ẩm Hàm lượng protein: theo phương pháp Kejldahl 2.2.4 Xác định hàm lượng protein của các enzyme Các loại enzyme được xác định hàm lượng protein theo phương pháp kjeldahl. Các bước thực hiện được trình bày cụ thể ở mục 2.2.5.2 2.2.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu trong quá trình thí nghiệm 2.2.5.1 Phương pháp xác định khối lượng chất khô Nguyên tắc Trong thành phần cấu tạo của tế bào, mô, cơ quan, nước tồn tại dưới dạng tự do và liên kết với một tỉ lệ lớn hơn so với một số hợp chất hữu cơ khác. Vì thế, để xác định chính xác hàm lượng protein, saccharid, lipid…trong mẫu nguyên liệu thì phải xác định hàm lượng của chúng có trong nguyên liệu khô tuyệt đối. Do đó cần phải xác định khối lượng chất khô trước khi xác định các thành phần khác trong mẫu. Cách làm Xác định khối lượng vỏ hộp khô tuyệt đối Sấy hộp ở nhiệt độ 1050C trong 3h, để nguội trong bình hút ẩm, cân, xác định khối lượng vỏ hộp khô tuyệt đối. Xác định khối lượng khô tuyệt đối của mẫu: cho 3g mẫu (tế bào nấm men) vào hộp, đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ: 500 - 600C trong 30 phút. Sau đó nâng dần nhiệt độ đến 1050C và sấy trong 6 giờ. Để nguội hộp trong bình hút ẩm, cân. Tiếp tục sấy thêm 1 giờ ở nhiệt độ 1050C; để nguội trong bình hút ẩm, cân. Nếu khối lượng hộp có chứa mẫu không thay đổi, chứng tỏ mẫu khô tuyệt đối. Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 50 2.2.5.2 Xác định Nitơ tổng số theo Kjeldahl * Chuẩn bị mẫu Lấy 1ml hoặc1g mẫu nấm men cho vào ống phá mẫu. Cho 2 đến 3g xúc tác và 10 – 15 ml H2SO4 đậm đặc. Đặt mẫu vào giá phá mẫu, vận hành chương trình phá mẫu đã được cài đặt sẵn trong máy phá mẫu. Mẫu phá đến khi quan sát thấy trong suốt là được. * Tiến hành thử Cất đạm Lần lượt cho ống mẫu đã phá xong, thêm NaOH và MgO rồi đặt vào máy cất đạm bán tự động. Chuẩn bị sẵn các erlen chứa 20 ml H2SO4 0.1N với 3 giọt chất chỉ thị hỗn hợp Tashiro. Để vào vị trí hấp thu trong máy cất đạm. Vận hành chương trình cất đạm với nguyên tắc phản ứng như sau: (NH4)2SO4 + 2NaOH ---------> Na2SO4 + 2NH3 +H2O 2NH3 + H2O +H2SO4 ---------> (NH4)2SO4 + H2O 2NaOH + H2SO4 ---------> Na2SO4 + H2O Sau đó chuẩn độ lượng acid dư trong bình erlen bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu chỉ thị hay dung dịch chuyển sang màu xanh ngọc. Tiến hành song song các bước trên với một mẫu trắng. * Tính kết quả Hàm lượng nitơ toàn phần tính bằng g/l theo công thức Đạm N toàn phần (g/l) = ( V0 – V1) x N NaOH x 14 V Mẫu Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 51 V0 : thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng (ml) V1 : thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn mẫu thử (ml) 14 : đương lượng gram nitơ Vmẫu : thể tích mẫu nguyên đã lấy để vô cơ hóa (ml) Nếu muốn tính ra lượng Protein, ta nhân với hệ số 6.25 rồi qui đổi ra % 2.2.5.3 Xác định hàm lượng acid glutamic bằng phương pháp sắc ký HPLC theo AOAC 2006 (994.12) * Định nghĩa Sắc ký là kỹ thuật tách riêng các hợp chất, đã được Tswett (1903) lần đầu tiên sử dụng để tách các chất màu trong cây cỏ. Từ ngữ “chromatography” xuất xứ từ chữ “chroma” trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu. Ngày nay, sắc ký được sử dụng để tách tất cả mọi hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. * Nguyên tắc Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống. Hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh. Một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào một hệ thống gồm có 2 pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh hoặc yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất. Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 52 * Chuẩn bị mẫu Hút 1ml dịch chiết xuất nấm men cho vào bình định mức 25ml thêm nước cất 2 lần đến vạch, lắc đều, sau đó lọc mẫu bằng giấy lọc PTFE 0.45μm để loại tạp chất không hòa tan. Đặt mẫu vào máy sắc ký. * Tiến hành đo Đo bằng máy sắc ký HPLC Pha tĩnh : cột RP18 ( 4 μm) Pha động : 30% Acetonitril và 70% ACN trong dung dịch đệm sodium acetate pH 4,2 Vận tốc dòng : 1,5ml/phút Detection : Fluorescence 260 -310 nm Nhiệt độ : 350C Thể tích hút: 10 μm 2.2.5.4 Xác định hàm lượng acid Nucleic bằng cách đo mật độ quang * Nguyên tắc [5] Người ta có thể tính nồng độ các phân tử vật chất trong môi trường lỏng dựa vào mức hấp thụ ánh sáng của chúng. Sự hấp thụ ánh sáng này tuân theo định luật Beer-Lambert IgIo/I = εdc Trong đó: Io là cường độ tia tới Ig là cường độ tia ló d là bề dày của môi trường lỏng mà ánh sáng truyền qua, trong thực tế d=1cm ( bề dày của cuvette quang phổ) c là nồng độ chất trong môi trường lỏng Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 53 ε là hệ số tắt ( extinction coefficient) đặc trưng cho từng loại phân tử vật chất, phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và nhiệt độ. Đại lượng A, được gọi là mật độ quang học, được tính theo công thức: A = IgIo/I = εdc Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ ( tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các nucleic acid là 260nm trong vùng tử ngoại. Sự hấp thụ này là do tương tác giữa các photon với các electron của vòng purin và pirimidine. Sự hấp thụ ở đây được tính bằng đơn vị OD ( optical density). Một đơn vị OD tương ứng với 50μg/ml DNA sợi đôi 40 μg/ml DNA sợi đơn hay RNA 20 μg/ml oligonucleotide sợi đơn Từ giá trị OD đo được, người ta có thể suy ra được nồng độ nucleic acid của dung dịch. Bên cạnh đó, người ta còn tính tỉ lệ OD260/OD280 để ước tính độ tinh sạch của dung dịch acid nucleic. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch nucleic acid được xem là sạch. * Các bước thực hiện Tách chiết và xác định acid nucleic của nấm men và dịch tự phân giai đoạn đầu. Gồm 3 bước: Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Vortex 10g mẫu dịch chiết nấm men với chất làm biến tính protein mạnh guanidium thiocyanate trong dung dịch L6. Hỗn hợp này sẽ phá vỡ hoàn toàn màng tế bào và màng nhân, phóng thích acid nucleic ra môi trường, đồng thời phân hủy các protein còn liên kết với ADN hoặc ARN Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 54 Bước 2: Loại bỏ protein và các thành phần không mong muốn trong mẫu Thêm 20ml dung dịch phenol: chloroform tỉ lệ 1:1và 9ml isoamylalcohol để giảm bọt. Vortex thật kỹ trong 20-30 phút. Ly tâm 5000v/p trong 10 phút. Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước, sau khi ly tâm sẽ kết tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic sẽ được thu lấy và chuyển vào một ống nghiệm sạch khác. Đo mật độ quang học ở bước sóng 260nm để xác định hàm lượng acid nucleic hoặc tủa acid nucleic để bảo quản. Bước 3: Làm kết tủa acid nucleic ( nếu cần) Mục đích của việc kết tủa là thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Tủa mẫu trong isopropanol với tỉ lệ isopropanol:mẫu là 1:1 Ly tâm 7000v/p trong 10-15 phút thu nhận phần tủa là acid nucleic. Sau đó rửa tủa trong etanol 70% để loại bỏ vết isopropanol còn dính trong mẫu. Acid nucleic có thể bảo quản được 1 năm dưới dạng tủa trong dung dịch ethanol. 2.2.5.5 Xác định hàm lượng Inosine Monophosphate và Guanosine Monophosphate bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) * Chuẩn bị mẫu Hút 1ml dịch chiết xuất nấm men cho vào bình định mức 100ml, lắc đều. Sau đó lọc mẫu để loại tạp chất không hòa tan. Đặt mẫu vào máy sắc ký. * Tiến hành đo Vận hành chương trình trên máy sắc ký HPLC, đầu dò UV-Vis với các thông số kỹ thuật sau: Bước sóng λ = 248nm Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 55 Pha tĩnh : cột C18 không phân cực Pha động : hỗn hợp dung môi không phân cực acetonitril / nước cất 2 lần với tỉ lệ 5 / 95 và dung dịch đệm acid phosphoric 0.05% 2.2.5.6 Xác định độ pH Đặt điện cực vào dung dịch mẫu thử và hiệu chỉnh hệ thống đặt nhiệt độ của pH meter cho phù hợp với nhiệt độ của dung dịch mẫu. Nếu pH meter không có hệ thống hiệu chỉnh nhiệt độ thì phải duy trì nhiệt độ dung dịch mẫu trong khoảng 20oC đến 220C. Khuấy mẫu bằng máy khuấy từ, đo giá trị pH theo đúng hướng dẫn kèm theo máy. Đọc giá trị pH chính xác khi giá trị không thay đổi. 2.2.5.7 Phương pháp rửa sinh khối tế bào nấm men Nấm men bánh mì dạng men tươi của nhà cung cấp Mauri La Ngà sau khi được đánh giá chất lượng cảm quan và tính chất hóa lý đạt yêu cầu, được huyền phù với nước vô khuẩn với tỉ lệ nấm men:nước là 1:3 (w/w). Để lắng trong 90 phút, gạn bỏ phần nước và tạp chất nổi. Tiếp tục rửa lần thứ 2 với nước vô khuẩn, gạn bớt phần nước bên trên, sau đó ly tâm 2000v/phút trong 15 phút để thu nhận lại sinh khối nấm men. 2.3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH CÁC THÍ NGHIỆM 2.3.1 Thủy phân tế bào nấm men bổ sung enzyme * Nguyên tắc chung Huyền phù tế bào nấm men trong nước vô khuẩn, bổ sung enzyme ở nồng độ khảo sát, ủ ở các nhiệt độ, pH và thời gian khác nhau để thu được hỗn hợp có hàm lượng các chất sinh hóa học cao nhất. 2.3.1.1 Thủy phân tế bào nấm men bằng NaCl và ethanol Nguyên tắc Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 56 NaCl và ethanol hoạt hóa quá trình tự phân ở nấm men, làm ngắn lại quá trình thủy phân giúp cho sự tự phân xảy ra nhanh hơn. Chúng được thêm vào như là các tác nhân khởi động (trigger-agent), sau đó những enzyme khác nhau vốn có trong tế bào nấm men giúp cho quá trình tự phân tiếp tục xảy ra. * Tiến hành thí nghiệm Hỗn hợp gồm 50g nấm men + 5% NaCl, trộn đều và huyền phù trong 60ml ethanol với nồng độ tương ứng 1%, 2%, 3% và 4%. Hỗn hợp trên được làm nóng tại 400C trong 72h. Khuấy đều và để nguội ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 4000v/10 phút. Xác định hàm lượng protein và acid nucleic tạo thành. 2.3.1.2 Thủy phân tế bào nấm men bằng enzyme Dựa theo khuyến cáo hàm lượng sử dụng của nhà sản xuất, chúng tôi tiến hành thí nghiệm thêm các nồng độ thực tế sử dụng để chọn lọc lượng dùng có hiệu quả tối ưu. * Thủy phân tế bào nấm men bổ sung enzyme YL-NL Enzyme YL-NL thủy phân liên kết peptide trong đó nhóm - NH-CH-R được bao bọc bởi các gốc acid amin kỵ nước là alanine, valanine, isoleucine, norleucine, leucine, hoặc phenylalanine. Tốc độ thủy phân của enzyme gia tăng mạnh khi các gốc alanine, serine, threonine hoặc histidine chứa nhóm – COOH tạo nên liên kết peptide. Enzyme này cũng thủy phân liên kết chứa nhóm – COOH của proline. Nhiệt độ tối ưu để enzyme này hoạt động là 50oC đến 57oC, pH tối ưu 6.5 – 7.5 . Thời gian thủy phân enzyme YL-NL là khoảng 16h. Phần 2:Vật liệu và phương pháp nghiên cứu CBHD Tiến sĩ Hoàng Quốc Khánh Học viên Hoàng Thụy Phương Linh 57 Tiến hành Cho 50ml dung dịch enzyme 0,7%, 1% và 1,2% được cho vào 50g nấm men tươi. Lắc đều hỗn hợp, làm nóng tại 50oC. Sau các mốc thời gian từ khi cho enzyme vào 12h, 14h, 16h khuấy đều mẫu, lấy một lượng để nguội ở nhiệt độ phòng. Mẫu được xác định hàm lượng đạm tổng số và acid nucleic. * Thủy phân tế bào nấm men bằng enzyme RP-1G Enzyme RP-1G có bản chất là 5’phosphodiesterase, thủy phân RNA của tế bào nấm men thành các 5’Nucleotide, trong đó có GMP. Enzyme này có thể hoạt động trong khoảng pH 4 - 7, tuy nhiên hoạt động ở pH tối ưu là 5 và nhiệt độ tối ưu là 700C. Tiến hành Cân 50g nấm men bánh mì thêm vào 50ml RP-1G nồng độ 0.1%, 0.08% và 0.07%, khuấy đều hỗn hợp, điều chỉnh pH lên khoảng 6-7. Sau đó ủ hỗn hợp trong tủ ấm ở nhiệt độ 65oC – 70oC. Đánh giá cảm quan mùi sau mỗi 8h đến 16h, hỗn hợp sau thủy phân được đem xác định hàm lượng GMP tạo thành. * Thủy phân tế bào nấm men bằng enzyme Deamizyme 50000G Enzyme này có hoạt tính 5’-Adenylic Deaminase mạnh, chuyển hóa 5’- Adenylic acid (AMP) thành 5’Inosinic acid (IMP). Tiến hành Cho 50ml Deaminase 50000G 0.07%; 0.1% cho vào 50g nấm men bánh mì, khuấy đều, ủ ở 50oC – 55oC. Hỗn hợp sau thủy phân được đánh giá cảm quan mùi và xác định tính chất lý hóa sau mỗi 12h đến 24h. Hỗn hợp