Vật liệu và phương pháp nghiên cứu xạ khuẩn

Trang 18 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP Trang 19 2.1. Vật liệu 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ a. Thiết bị - Tủ cấy vô trùng Skan (Đức) - Tủ ấm vi sinh vật Memmert (Đức) - Tủ ấm 28oC (Heraeus, Đức) - Tủ sấy Memmert (Đức) - Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY) - Tủ lạnh -30oC (Sanyo) - Tủ mát 2-13oC (Sanyo) - Cân phân tích - Cân kỹ thuật - Máy lắc ổn nhiệt (Stuart Scientific) - Máy đo quang phổ Ultrospec 2000 - Máy đo pH (Orion, Anh) - Máy ly tâm lạnh MIKRO 22R (Hettich Zentrifugen, Đức) - Máy ly tâm Rotina 35 (Hettich Zentrifugen, Đức) - Máy vortex IKA-VIBRAZ-VXR (Mỹ) - Bộ điện di Hoefer, bộ nguồn (Amersham Biosciences) - Nhiệt kế - Hộp đèn soi tia tử ngoại Hoefer (UVTM-19-230V) - Kính hiển vi Zeiss Axioskop (Đức) nối với DSP Colour Camera - Máy PCR (Biorad) b. Dụng cụ - Đĩa petri đường kính 120mm, 100mm, 50mm - Bộ pipetman 10, 20, 100, 200, 1000, 5000µl và các loại đầu tip tương ứng - Các loại eppendorf 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2,0ml - Ống nghiệm 15ml - Giá đỡ ống nghiệm Trang 20 - Erlen 100ml, 250ml, 500ml - Ống đong - Bercher - Đèn cồn - Que cấy thẳng, que cấy vòng, que trãi - Lưỡi dao và dao cắt thạch - Bình tia đựng cồn, nước cất - Chày và cối thủy tinh - Bộ chén nung mẫu - Ray lọc 2.1.2. Hóa chất a. Kháng sinh - Ampicillin 100µg/ml (giữ -30oC) - Nalixidic acid 25mg/l - Cyclohexamide 50mg/l - Terbinafin 1mg/l b. Dung dịch vi lượng CaCl2.2H2O 4gr ZnSO4.7H2O 2gr Na2B4O7.10H2O 0,1gr FeSO4.7H2O 5gr KI 0,05gr CoCl2.6H2O 0,5gr CuSO4.5H2O 0,2gr MnCl2.4H2O 2gr Na2MoO4.2H2O 0,05gr H2SO4 95-97% 1ml Nước cất hai lần đủ 1000ml c. Dung dịch vitamin mix A1 Trang 21 p-aminobenzoic acid 50mg Calcium pantothenate 50mg Inositol 50mg Niacin 50mg Pyridoxin HCl 50mg Riboflavin 50mg Thiamine HCl 50mg Biotin 50mg Nước cất đủ 100ml Lọc vô trùng dung dịch trước khi sử dụng d. Dung dịch để quan sát tiêu bản mẫu - Dung dịch lactophenol blue - Dầu soi e. Hóa chất dùng để điều chỉnh pH - Dung dịch NaOH 1N - Dung dịch HCl 1N f. Hóa chất dùng để tách chiết genome xạ khuẩn - Dung dịch ly giải : Tris -HCl pH 7,4 100mM EDTA pH 8,0 20mM NaCl 250mM SDS 2% Lysozyme 1mg/ml MiliQ (nước cất hai lần vô trùng) đủ 100ml - RNAase 50mg/ml (giữ ở -20oC) - Proteinase K 20mg/ml (giữ ở -20oC) - Chloroform - Phenol bão hòa trong TE (chỉnh pH 8,0 bằng TE) - Ethanol 99% (giữ ở -20oC) Trang 22 - NaCl có nồng độ cuối cùng 150mM - Ethanol 70% (giữ ở -20oC) - Dung dịch TE Tris-HCl pH 7,4 10mM EDTA pH 8,0 1mM g. Hóa chất cho phản ứng PCR - Dung dịch MgCl2, MgSO4 25mM (Fermentas, Đức) - dNTP 2mM mỗi loại (Fermentas, Đức) - Buffer Pfu DNA polymerase 10X (+MgCl2) hay Buffer Taq DNA polymerase (-MgCl2) 10X (Fermentas, Đức) - Mồi 10pmol - Nước cất hai lần - Taq DNA polymerase hay Pfu DNA polymerase (Fermentas, Đức) h. Hóa chất cho tinh chế sản phẩm PCR Sử dụng bộ kit EZ-100 Spin Column gồm - Binding Buffer I - Wash Solution - Elution Buffer i. Hóa chất dùng để pha gel agarose và chạy điện di - Agarose - Đệm TAE 1X gồm: Tris-HCl 4,84g Na2EDTA 0,5M pH 8,0 2ml Glacial acetic acid 1,14ml Nước cất đủ 1000ml - Đệm nạp mẫu có thành phần như sau Brommophenol blue 15mg TE 1X 50ml Glycerol 50ml Trang 23 - Dung dịch nhuộm DNA trên gel: 1% Ethidium bromide j. Hóa chất cho tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS-Kiềm - Dung dịch I Glucose 50mM Tris-HCl pH 8,0 25mM EDTA pH 8,0 10mM - Dung dịch II (pha trước khi sử dụng) (1ml) Nước cất 800 µl SDS 10% 160 µl NaOH 5N 40 µl - Dung dịch III (KOAc) pH 4,8 Glacial acetic acid 0,2N Potassium acetate 0,2N - Dung dịch TE Tris-HCl pH 8,0 10mM EDTA 1mM - RNAase 1mg/ml (giữ ở -20oC) - Phenol bão hòa trong TE (chỉnh pH 8,0 bằng TE) - Chloroform - Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC) - Dung dịch Ethanol 70%, 99% (giữ ở -20oC) k. Hóa chất cho phản ứng cắt - Dung dịch đệm EcoRV 10X (Fermentas, Đức) - Các enzyme cắt EcoRV (Fermentas, Đức) l. Hóa chất dùng cho phản ứng nối - Buffer T4 DNA liagse 10X - Enzyme T4 DNA ligase (Fermentas, Đức) m. Hóa chất dùng để tủa sản phẩm - PCI (Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol) Trang 24 n. Hóa chất dùng cho phản ứng loại bỏ nhóm phosphat - Buffer CIAP 10X (Fermentas, Đức) - Enzyme CIAP (1u/µl) (Fermentas, Đức) o. Hóa chất dùng để chuẩn bị tế bào khả nạp - Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng (giữ ở 4oC) - Dung dịch MgCl2 80mM, CaCl2 20mM vô trùng (giữ ở 4oC) - Dung dịch Glycerol 80% vô trùng (giữ ở 4oC) - Nước cất vô trùng (giữ ở 4oC) 2.1.3. Môi trường - Môi trường ISP-2 (International Streptomyces Project) Yeast extract 4,0 g Malt extract 10,0 g Dextrose 4,0g Agar 20,0g Nước cất đủ 1000ml - Môi trường Humic acid agar Humic acid (hòa tan trong 10ml 0,2N NaOH) 1g Yeast extract 50mg Casamino acids Na 20mg Na2HPO4 0,2g KCl 1,7g MgSO4.7H2O 50mg CaCl2 10mg Dung dịch vi lượng 0,2ml Agar 18g Nước cất đủ 1000ml Sau khi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và bổ sung dung dịch vitamin mix A1. Trang 25 - Môi trường A9 (soil extract medium) CaSO4.2H2O 0,5g Ca(NO3)2.4H2O 0,25g MgSO4.7H2O 0,05g K2SO4 0,03g KH2PO4 0,02g NaHCO3 0,1g Dung dịch vi lượng 0,3ml CaCl2.2H2O 0,02g Yeast extract 0,1g Casamino acids 0,1g Glucose 0,2g Soil extract 100ml Agar 18g Nước cất đủ 1000ml Sau khi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và bổ sung dung dịch vitamin mix A1. - Chuẩn bị dịch chiết đất Đất mùn 1000g Nước cất 1000ml Hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, lọc, hấp vô trùng lại và trữ ở 4oC. - Môi trường Glycerol Agar Casamino acid 2g Gycerol 5g K2HPO4 0,3g MgSO4.7H2O 0,5g NaCl 0,3g Agar 20g Dung dịch vi lượng 0,3ml Trang 26 Nước cất đủ 1000ml Sau khi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và bổ sung dung dịch vitamin mix A1. - Môi trường Bennett’s agar Beef extract 1g Glucose 10g N-Z amine A 2g Yeast extract 1g Agar 15g Nước cất đủ 1000ml - Môi trường ISP-2 M (ISP-2 modification agar) Yeast extract 1g Malt extract 2,5g Dextrose 0,5g Soluble starch 0,5g KH2PO4 50mg MgSO4.7H2O 10mg Dung dịch vi lượng 0,2ml Agar 18g Nước cất đủ 1000ml Sau khi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và bổ sung dung dịch vitamin mix A1. - Môi trường A9 M (Soil extract modification agar) Soil extract 100ml Yeast extract 0,1g Casamino acid 0,1g Glucose 1g Starch 1g KH2PO4 50mg Trang 27 MgSO4.7H2O 20mg CaSO4.2H2O 100mg Ca(NO3)2.4H2O 100mg Dung dịch vi lượng 0,2ml Agar 18g Nước cất đủ 1000ml Sau khi hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và bổ sung dung dịch vitamin mix A1. - Môi trường L4 Mannitol 20g Soy meal 20g Dung dịch vi lượng 0,25ml Nước cất đủ 1000ml Hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và bổ sung dung dịch vitamin mix A1. - Môi trường LB (Luria-Bertani) Trypton wasser có sẵn muối 15g Cao nấm men 5g Nước cất đủ 1000ml - Môi trường LB-Agar: thành phần cũng tương tự môi trường LB, có bổ sung thêm agar 2%. - Môi trường LB-Agar-Amp: thành phần tương tự môi trường LB-Agar, bổ sung thêm Ampicillin nồng độ cuối cùng 10µg/ml. - Môi trường LB-Amp: thành phần tương tự môi trường LB, bổ sung thêm Ampicillin nồng độ cuối cùng 10µg/ml. - Môi trường LB-Agar-Amp-Xgal: thành phần tương tự môi trường LB-Agar- Amp và có bổ sung thêm X-gal 40mg/ml. - Chuẩn bị môi trường Mueller-Hinton Agar (Merck) Mueller-Hinton Agar là môi trường tổng hợp có thành phần (g/L) như sau: Trang 28 Meat infusion 2g Casein hydrolysate 17,5g Starch 1,5g Agar 17g Hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, để môi trường nguội ở 50oC và đổ môi trường ra đĩa petri với 25ml môi trường cho đĩa petri đường kính 100mm. Để đĩa thạch môi trường nguội ở nhiệt độ phòng và cất giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8oC và tốt nhất là sử dụng các đĩa thạch này trong vòng bảy ngày kể từ ngày đổ đĩa. Lấy một vài đĩa thạch môi trường Muller-Hinton Agar ủ trong tủ ấm ở 35oC trong vòng 24 giờ hoặc lâu hơn để kiểm tra độ vô trùng của lô đĩa mới đổ. - Chuẩn bị môi trường Potato Dextrose Agar (Merck) Potato Dextrose Agar là môi trường tổng hợp với thành phần g/L như sau: Potato infusion 4g D(+) glucose 20g Agar 15g Môi trường được pha theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Cân 39g trong 1000ml nước cất và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm nguội bình tam giác môi trường trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 45-50oC. Đổ môi trường ra đĩa petri với 25ml môi trường cho đĩa petri đường kính 100mm. 2.1.4. Vật liệu sinh học - Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất Vườn quốc gia Cát Tiên. - Chủng chủ E.coli DH5α [F-, f80lacZDM15, recA1, endA1, hsdR17 (rk -, mk +), phoA, supE44, l-, thi-1, gyrA96, relA1] được dùng để dòng hóa các gene (Takara). Trang 29 - Plasmid pGEM Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc plasmid pGEM - Các mồi được dùng để tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự đều dựa trên các bài báo và được đặt tổng hợp bởi công ty IDT (Mỹ). Bảng 2.1 Các mồi sử dụng trong đề tài. Tên mồi Mục đích Trình tự các nucleotide theo chiều 5' -> 3' 27f Khuếch đại đoạn 16S rDNA 5'-Phosphat/ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492r Khuếch đại đoạn 16S rDNA 5'-Phosphat/ GGTTACCTTACGACTT T7 promoter Giải trình tự 5'-TAATACGACTCACTATAGGG SP6 promoter Giải trình tự 5'-ATTTAGGTGACACTATAG Trang 30 - Thang DNA 1kb (Fermentas, Đức) Thang DNA 1kb gồm 14 phân đoạn (bp): 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250. 2.1.5. Địa điểm tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu các Hợp chất Tự nhiên có Hoạt tính sinh học (RCBNP), phòng thí nghiệm Công nghệ Gen-Vi Sinh thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp. HCM cơ sở Linh Trung-Thủ Đức. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Thu và chuẩn bị mẫu Mẫu đất được thu nhận từ tầng mặt ở những vị trí xác định để khảo sát sự phân bố nếu có của chủng xạ khuẩn Streptosporangium. Các mẫu đất được cho vào túi nhựa kín ghi ký hiệu mẫu và có phiếu mẫu ghi ký hiệu mẫu, địa điểm, ngày và người lấy mẫu, … Các mẫu được mang về phòng thí nghiệm và được hong khô ngay bằng cách trải đều trên khay nhựa sạch, và để khô tự nhiên trong phòng có quạt thông gió trong thời gian 7 ngày. Ghi lại trọng lượng mẫu. Đất khô được nhặt kỹ sỏi, đá và xác hữu cơ nếu có. Sau đó mẫu đất được nghiền trong cối thủy tinh và được rây với đường kính lỗ 2mm. Mẫu đất đã nghiền và rây được bảo quản trong các túi nhựa kín, đặt trong hộp nhựa trong phòng sạch, khô ráo. Trang 31 Cân 20g đất mịn khô cho vào bình tam giác có dung tích 100ml miệng rộng. Thêm 50ml dung dịch nước cất. Lắc xoáy bằng tay cho phân tán đất và tiếp tục lắc trên máy 30 phút. Để yên 2 giờ. Lắc xoáy lại 2-3 lần bằng tay cho phân tán huyền phù. Sau đó đo ngay bằng máy đo pH điện cực thủy tinh. Vị trí bầu điện cực ở vị trí trung tâm và trung điểm độ sâu của dung dịch trong huyền phù. Đọc số đo sau khi kim chỉ ổn định 30 giây. 2.2.2. Xác định hàm lượng hữu cơ Hàm lượng hữu cơ của mẫu đất được xác định bằng phương pháp bán định lượng dựa vào phương pháp đốt (loss-on-ignition, LOI). Cân khoảng 2g mẫu đất vào trong chén nung và nung ở nhiệt độ 370oC qua đêm. Mẫu sau đó được làm nguội trong bình làm khô và cân (sử dụng cân phân tích). Hàm lượng chất hữu cơ được tính bằng công thức sau đây: Chất hữu cơ (%) = (trọng lượng mẫu lúc đầu-trọng lượng mẫu sau nung)x100% trọng lượng mẫu lúc đầu 2.2.3. Phương pháp phân lập xạ khuẩn Streptosporangium Việc phân lập xạ khuẩn hiếm Streptosporangium được thực hiện bằng phương pháp trãi đĩa. - Phân lập từ mẫu đất không xử lý nhiệt Cân 2,25g đất khô đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác 100ml chứa 25ml dung dịch sodium lauryl sulfate 0,1%. Lắc đều mẫu khoảng 30 phút trong máy lắc. Đây là dịch huyền phù có độ pha loãng 10-1. Pha dịch huyền phù có độ pha loãng 10-2 bằng cách hút 1ml dịch huyền phù trên cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch sodium lauryl sulfate 0,1% và lắc đều. Tiếp tục pha loãng như trên thành các dung dịch huyền phù có độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5. Sau đó, hút 0,2ml ở các nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 và chuyển vào các đĩa môi trường ISP-2 và môi trường Humic acid chứa các kháng sinh nalicidic acid (25mg/l), cycloheximide (50mg/l) và terbinafin (1mg/l) để ức chế vi khuẩn và nấm mốc. Tiến hành trãi đĩa với que trãi vô Trang 32 trùng. Lặp lại 3 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng và mỗi môi trường sử dụng. Ủ các đĩa ở 28oC khoảng hai tuần đến bốn tuần và kiểm tra đĩa thường xuyên. - Phân lập từ mẫu đất xử lý nhiệt Mẫu đất khô được xử lý ở nhiệt độ 100oC trong một giờ. Sau đó thực hiện cân mẫu, pha loãng mẫu và trãi đĩa tương tự như trường hợp đất không xử lý nhiệt nhưng với các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Ủ đĩa ở 28oC khoảng hai tuần đến bốn tuần và kiểm tra đĩa thường xuyên. - Cấy chuyền và làm thuần Quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường Humic acid trực tiếp dưới kính hiển vi với vật kính dài (long distance objective), dựa vào các đặc điểm hình thái hiển vi của Streptosporangium từ tài liệu tham khảo chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là Streptosporangium. Thực hiện làm thuần bằng cách sử dụng que cấy thẳng để chấm điểm hay sử dụng que cấy vòng để cấy khuẩn lạc nghi ngờ theo đường zigzag lên môi trường ISP-2 và môi trường Humic acid chứa kháng sinh. Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có sinh hệ sợi, vì vậy khuẩn lạc xạ khuẩn phát triển trong môi trường thạch trong khi các vi khuẩn đơn bào phát triển trên bề mặt thạch. Ủ đĩa ở 28oC trong 10-14 ngày. Xác định mức độ thuần của chủng phân lập được bằng việc quan sát hình thái thô đại các khuẩn lạc trong đĩa thạch môi trường hoặc sử dụng kính hiển vi. 2.2.4. Làm tiêu bản mẫu và chụp hình dưới kính hiển vi Dùng dao vô trùng cắt một miếng thạch xạ khuẩn trên môi trường Humic acid, đặt trên phiến kính, phủ lớp dung dịch lactophenol blue và đậy lại bằng lá kính. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X40 và vật kính dầu X100 để chụp ảnh. Tiến hành làm tiêu bản phòng ẩm để quan sát và chụp ảnh hiển vi như sau. Đặt vào đáy hộp petri một tờ giấy thấm, sau đó là một phiến kính rồi đậy lại, gói giấy và đem khử trùng. Đun chảy môi trường dinh dưỡng đã khử trùng trong ống thạch. Mở hé nắp petri ở gần ngọn lửa của đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên phiến kính sao cho thạch chảy dài một nửa bên của phiến kính. Khi thạch trên phiến kính đã đặc lại, bổ sung nước cất vô trùng đổ vào phần giấy thấm, để cho Trang 33 nước thấm đều tờ giấy. Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc xạ khuẩn rồi chấm lên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm. Gói cả hộp lại và nuôi ủ ở nhiệt độ 28oC trong 1 tuần. Sau đó quan sát và chụp ảnh như trên. 2.2.5. Thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn Streptosporangium phân lập Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập được xác định bằng cách sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy xạ khuẩn và sử dụng dịch ly trích bằng dung môi sinh khối và dịch lên men của xạ khuẩn. - Chuẩn bị dịch nuôi cấy xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trong 30ml môi trường lỏng ISP-2 và L6 trong bình tam giác 250ml. Ủ ở 28oC, tốc độ lắc 250 vòng/phút trong thời gian 7 ngày. Dịch nuôi cấy này được sử dụng trực tiếp để thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn nuôi cấy. - Chuẩn bị dịch ly trích xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trong 100ml môi trường lỏng ISP-2 và L6 trong bình tam giác 500ml, ở 28oC, tốc độ lắc 250 vòng/phút trong thời gian 7 ngày và 14 ngày . Dịch lên men được ly trích theo qui trình ở Bảng 2.1. - Chuẩn bị đĩa giấy tẩm dịch nuôi cấy xạ khuẩn Sử dụng đĩa giấy lọc Whatman có ký hiệu CAT No. 2017006, loại AA đường kính 6mm. Đặt các đĩa giấy này vào đĩa petri và sấy vô trùng ở 100oC trong khoảng 1 giờ. Nhúng chìm các đĩa giấy này vào dịch nuôi cấy xạ khuẩn khoảng 30 phút. Sau đó dùng que gắp vô trùng chuyển chúng lên bề mặt giấy nhôm và làm khô trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Cất vào trong lọ thủy tinh. - Chuẩn bị đĩa giấy tẩm dịch tách chiết xạ khuẩn Sử dụng đĩa giấy lọc Whatman của hãng Merck có ký hiệu có ký hiệu CAT No. 2017006, loại AA đường kính 6mm. Đặt các đĩa giấy này vào đĩa petri và sấy vô trùng ở 100oC trong khoảng 1 giờ. Mỗi đĩa giấy được tẩm 50µl dịch chiết xuất xạ khuẩn. Để đĩa giấy khô ở nhiệt độ phòng và cất giữ trong lọ thủy tinh. Trang 34 Bảng 2.2 Quy trình ly trích dịch lên men xạ khuẩn - Ly tâm (2 x 50 ml), 20 phút Sinh khối khuẩn ty - thêm 30ml MeOH, (để qua đêm ở nhiệt độ phòng) - Phá mẫu trong 5 phút - Ly tâm - Thu dịch lỏng - Cô quay/ MeOH Sinh khối (bỏ) Cô quay/ MeOH ( Sinh khối khuẩn ty = MC) Dịch lên men xạ khuẩn (100 ml) Dịch lên men - Thêm EtOAc ( tỷ lệ 1: 1) - lắc đều trong bình cầu 250ml - tạo 2 pha pha EtOAc ( Dịch lên men = CF ) Pha nước (bỏ) Cô quay/ EtOAc ( CF) - Chuẩn bị độ đục chuẩn cho dịch nuôi cấy vi sinh vật kiểm định Độ đục của dịch nuôi cấy trong thí nghiệm kháng sinh đồ được chuẩn hóa bằng dung dịch BaSO4 tương ứng với chuẩn 0,5 McFarland. Độ đục chuẩn BaSO4 0,5 McFarland được chuẩn bị như sau: hút 0,5ml dung dịch 0,048 mol/l BaCl2 (1,175% w/v BaCl2.2H2O) cho vào 99,5ml dung dịch 0,18mol/l H2SO4 (1% v/v) và lắc đều. Kiểm tra độ đục chính xác của dung dịch chuẩn này bằng máy đo quang phổ. Sự hấp thu ở bước sóng 625nm cho chỉ số 0,008 đến 0,10 sẽ tương ứng với độ đục 0,5 McFarland. - Danh sách các chủng vi sinh vật kiểm định: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus oryzae, Penicillium sp. Trang 35 - Nuôi cấy các vi sinh vật kiểm định Chuẩn bị dịch nuôi cấy bằng cách huyền phù hóa các khuẩn lạc của chủng kiểm định sau khi đã nuôi cấy 18 giờ đối với vi khuẩn (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli), 36 giờ đối với nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans) và khoảng 48-72 giờ đối với nấm mốc (Aspergillus oryzae, Penicillium sp) trong môi trường không chọn lọc Tryptic Soy Agar bằng 5ml dung dịch muối sinh lý. Dịch huyền phù này sẽ được điều chỉnh để tương ứng với độ đục chuẩn 0,5 McFarland. - Phương pháp khuyếch tán đĩa Nhúng que tăm bông vô trùng vào trong dịch huyền phù vi sinh vật kiểm định, xoay que tăm bông vài lần và nhấn mạnh vào thành trong của ống nghiệm để loại bỏ dịch thừa. Bôi đều đầu tăm bông lên bề mặt môi trường thạch Mueller-Hinton (trường hợp vi khuẩn) hoặc môi trường Potato Dextrose Agar (trường hợp nấm men và nấm mốc). Mở hé nắp đĩa thạch khoảng 5 phút trong tủ cấy vô trùng để loại bớt lượng độ ẩm dư thừa. Đặt các đĩa giấy lọc tẩm dịch tách chiết xạ khuẩn lên bề mặt thạch (không nên đặt quá 6 đĩa giấy đối với đĩa petri đường kính 100mm và cần ấn nhẹ đĩa giấy lên mặt thạch để đảm bảo tiếp xúc tốt). Ủ đĩa ở 35oC trong 18 giờ đến 24 giờ (trường hợp vi khuẩn), ở 28oC trong 48 giờ đối với nấm men và trong vòng 48 giờ đến 72 giờ đối với nấm mốc. Đo đường kính vòng ức chế nếu có (đơn vị mm). Các thí nghiệm được lặp lại hai lần. 2.2.6. Tách chiết bộ gen xạ khuẩn Nuôi cấy lắc chủng xạ khuẩn Streptosporangium trên môi trường lỏng ISP-2 ở 28oC trong 7 ngày. Thu hệ sợi bằng ly tâm lạnh 12.000 vòng trong 5 phút ở 4oC và rửa hệ sợi hai lần với nước cất vô trùng. Cân 200mg sinh khối hệ sợi trong một ống eppendorf. Bổ sung 800µl dung dịch ly giải (100mM Tris-HCl, pH 7,4; 20mM EDTA; 250mM NaCl; 2% SDS; 1mg/ml lysozyme; qsp 100ml H2O), vortex. Bổ sung 5µl RNAase (50mg/ml), lắc nhẹ. Ủ ở 37oC tro