Vật liệu và phương pháp sinh trắc nghiệm sứ thái

Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Cây Sứ Thái (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) - Cây sứ Ánh Dương ("Red Multiflora clone") có hoa nở 5 cánh, màu đỏ tươi; có 7 – 8 hoa trên một cụm hoa (ảnh 2.1). - Cây sứ Ngọc Tú Cầu là cây đã được lai tạo tại Việt Nam, có hoa cánh kép (5 cánh ngoài to hơn 5 cánh trong), màu đỏ tươi (ảnh 2.2). Ảnh 2.1: Cây sứ Ánh Dương ("Red Multiflora clone") (trồng tại vườn Sứ Thái Q11, Tp. HCM) Ảnh 2.2: Cây Sứ Ngọc Tú Cầu (trồng tại vườn Sứ Thái Q11, Tp. HCM) Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 29 - Cây sứ Thần Tài (“Red Fairy”) có hoa nở rất lớn, 5 cánh hoa dày và màu đỏ tươi; dễ ra hoa và lâu tàn; lá láng mịn (ảnh 2.3). 2.1.2. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm Để đo hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong mẫu (chồi ngọn xuất hiện ở nách lá đài có các gân đỏ, trên các nhánh của cành Ghép và cành Tự ghép trên gốc sứ Ánh Dương): - Khúc cắt diệp tiêu Lúa (Oryza sativa L.) từ cây mầm 72 giờ tuổi, được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính auxin và acid abscisic. - Tử diệp cây mầm Dưa leo (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi, được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính cytokinin. - Trụ hạ diệp cây mầm Xà lách (Lactuca sativa L.) 18 giờ tuổi, được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính giberelin. Ảnh 2.3: Cây sứ Thần Tài ( “Red Fairy”) (trồng tại vườn Sứ Thái Q11, Tp. HCM) Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp ghép ngồi * Chọn giống để ghép Cành sứ giống mới dùng để ghép không cần lớn, đường kính khoảng 2 – 3 cm là tốt và không được quá non, hoặc quá già. Cây sứ giâm, chiết cành đem ghép tốt nếu cành để ghép vừa đủ già, vừa chuyển màu từ xanh lợt sang xanh xám và có lá non. Giống để ghép cần có các đặc điểm: hoa có màu sắc thật nổi bật so với các giống cũ trước đây; kết cấu hoa đẹp lạ, thời gian ra hoa sớm và lâu tàn, chu kì ra hoa nhanh, cây kháng được sâu bệnh. Gốc ghép là những cây không có hoa đẹp và sinh trưởng mạnh. Vì vậy, việc ghép sẽ giúp một cây không đặc sắc về hoa trở thành cây mang các cành có một hoặc nhiều loài hoa mới và đẹp hơn. Gốc ghép có thể dùng cây chiết, cây giâm cành; cây ươm hạt còn non hoặc cây lớn, cổ thụ. Cây sứ hạt sau 1 năm, đường kính củ trên 6 cm có thể ghép tốt (Hoàng Đức Khương, 2006). * Kĩ thuật ghép ngồi - Trước tiên cắt ngang gốc ghép chỗ định ghép, thao tác cắt thật dứt khoát, nhanh, gọn (vì nếu cứa thì dập thớ, xơ cành sứ) (ảnh 2.4). - Sau đó, cắt thêm một lát mỏng nữa thì gốc ghép ráo mủ, dễ ghép (ảnh 2.5). - Từ cành sứ giống cần ghép dài đã tước lá, cắt một đoạn cành sứ (có từ 1-3 mắt lá, dài 2 – 3 cm) (ảnh 2.6). - Sau đó vòng dây lên cành ghép để giữ cố định, Và cột giây để giữ chặt cành ghép trên gốc ghép (ảnh 2.7). - Trùm bao nylon giữ ẩm (ảnh 2.8). - Sau 7 -10 ngày tháo bao nylon ra để các chồi ghép phát triển bình thường. Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 31 Ảnh 2.4: Cành sứ trên gốc ghép vừa được cắt ngang Ảnh 2.5: Cành sứ trên gốc ghép được cắt ngang lần 2 để cho ráo mủ Ảnh 2.6: Thao tác cắt 1 đoạn trên cành ghép có từ 1-3 mắt lá, dài 2 – 3 cm. Ảnh 2.7: Thao tác cột dây giữ chặt cành ghép trên gốc ghép. Ảnh 2.8: Trùm bao ny lon giữ ẩm Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 32 2.2.2. Quan sát hình thái giải phẫu Quan sát sự biến đổi cấu trúc của vùng ghép, qua lát cắt dọc, theo các giai đoạn làm lành vết thương không xử lí và sau khi xử lí IAA 20 mg/l và 30 mg/l, và kết hợp IAA 20 mg/l và BA 20 mg/l tại vùng ghép. Quan sát sự biến đổi của mô phân sinh ở chồi ngọn, qua lát cắt dọc, theo các giai đoạn phát triển của hoa tự: mô phân sinh dinh dưỡng, mô phân sinh hoa tự hình thành và kéo dài mô phân sinh hoa tự thành trục phát hoa, dưới kính hiển vi quang học sau khi nhuộm hai màu đỏ carmine - xanh iod. 2.2.3. Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp Mẫu thực vật được đặt trong buồng kín. Việc đo dựa vào lượng khí O2 được tiêu thụ hay sản sinh ra trong buồng, phát hiện bằng điện cực kiểu Clark, khi bơm vào 1 ml không khí, được chiếu sáng (đo quang hợp) hay trong tối (đo hô hấp), trong thời gian nhất định. Đo bằng của máy Hansetech (ở 25oC, trong tối). Đo cường độ quang hợp của lá nằm ở vị trí thứ 3 tính từ chồi ngọn trở xuống và đo cường độ hô hấp của chồi ngọn trên các nhánh của cành Tự Ghép và Ghép. 2.2.4. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Auxin, cytokinin và giberelin được ly trích, phân đoạn trên bản mỏng sắc ký silicagel và đo hoạt tính nhờ các sinh trắc nghiệm (Meidner, 1984; Yokota et al., 1980; Bùi Trang Việt, 1992). * Ly trích Ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong khúc cắt chồi ngọn dài khoảng 2 – 4 mm trên các nhánh của cành Ghép và cành Tự ghép, vào giai đoạn lá đài xuất hiện các gân đỏ ở mặt dưới. Nghiền 1 g mẫu vật tươi trong 20 ml methanol 80%, ngâm 24 giờ. Lọc và rửa lại bã lọc hai lần với 10 ml methanol 80%. Dịch lọc được cô cạn, sau đó hòa với 5 ml nước cất. Sự ly trích và phân đoạn tiếp tục được thực hiện theo sơ đồ hình 2.1: Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 33 Nghiền 1g mẫu + 20ml Metanol 80% (Ngâm 24 giờ) Cô cạn dịch lọc còn ≈ 1ml Bình lóng, thêm 15ml Eter, lắc 20 phút Lắc, lọc dung dịch Thêm 5ml nước cất, chỉnh pH~ 2,5 (HCl 10 %) + 3ml NaHCO3 8% (3 lần) Dịch Eter Quạt cạn Dịch Eter (lớp trên) Sắc ký Sinh trắc nghiệm auxin, AAB và GA Chỉnh pH~ 7, Thêm 10ml n- Butanol bão hòa nước, lắc 15 phút ( 3 lần) Dịch nước (lớp dưới) Sinh trắc nghiệm cytokinin Dịch butanol + 3ml NaHCO3 8% (3 lần) Dịch butanol Quạt cạn Hình 2.1: Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 34 * Sắc ký: Bản mỏng silicagel F254 (20 x 20cm). Dùng micropipet chấm dịch eter đã quạt cạn ở trên thành một điểm (điểm gốc) cách mép dưới khoảng 2 cm. Chú ý, sau mỗi lần chấm, dùng máy sấy lạnh làm khô vị trí này và tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch eter. Chấm một điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn gồm Zea, AIA, ABA và GA3 tinh khiết có ồng độ 250mg/l cho mỗi chất. Đặt bản mỏng sắc ký vào thùng sắc ký và sửdụng dung môi di chuyển được chloroform: methanol: acid acetic = 80 : 15 : 5 (theo thể tích). Do mao dẫn, dung môi sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc ký và tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bảng sắc ký. Khi mức dung môi di chuyển còn cách thùng dung môi, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc khí này (chú ý giữ theo đúng chiều di chuyển dung môi). * Phát hiện và cô lập: Sử dụng đèn UV chiếu trên bản mỏng silicagel để phát hiện và xác định vị trí của AIA, AAB và giberelin trên bản sắc ký. Tương ứng các vị trí này của các chất chuẩn, hỗn hợp các chất nội sinh sẽ được phát hiện và cô lập riêng bằng cách dùng dao lam cạo lấy các hạt silic từng vùng trên bản sắc ký và cho vào các đĩa Petri để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính. * Sinh trắc nghiệm + Hoạt tính auxin và acid abscisic Hoạt tính auxin và acid abscisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được gieo trên bông gòn ẩm trong tối ở nhiệt độ 28oC ± 2oC, sau 3 ngày tách lấy diệp tiêu trong phòng tối. Khúc cắt diệp tiêu trong các sinh trắc nghiệm được để trong tối, nhiệt độ 28oC ± 2oC và đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn AIA tinh khiết 1 mg/l. Hoạt tính acid abscisic tỷ lệ nghịch với Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 35 sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn AAB tinh khiết 1 mg/l. + Hoạt tính cytokinin Hoạt tính cytokinin được đo dựa trên sự tăng trọng lượng của tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.). Hạt dưa chuột được gieo trong tối trên bông ẩm, nhiệt độ 28oC ± 2oC, khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hạt, thu các tử diệp. Tử diệp dưa chuột trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 28oC ± 2oC, đo trọng lượng sai biệt sau 48 giờ. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa chuột so với chuẩn là nước cất và BA tinh khiết 1 mg/l. + Hoạt tính giberelin Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Gieo hạt xà lách trên bông gòn ẩm, ở nhiệt độ 28oC ± 2oC, sau 1 ngày chọn các hạt có rễ vừa lú ra khỏi vỏ. Cây mầm xà lách trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 28oC ± 2oC, đo chiều dài sai biệt sau 72 giờ. Hoạt tính giberelin tỷ lệ thuận với chiều dài sai biệt trụ hạ diệp cây mầm so với chuẩn là nước cất và GA3 tinh khiết 10 mg/l. 2.2.5. Quan sát sự ra hoa của các nhánh trên cành Không Ghép, Tự Ghép và Ghép (giữa 2 giống sứ Ngọc Tú Cầu và Ánh Dương) ngoài tự nhiên Tiến hành các thao tác ghép ngồi, các khúc cắt cành ghép Ngọc Tú Cầu và cành ghép Ánh Dương lên gốc ghép Ánh Dương vào lúc chiều tối (18 giờ 30 phút) ngày 18/8/2008. Thí nghiệm được thực hiện tại vườn Sứ Thái Q. 11, TP. HCM, trong điều kiện ánh sáng 21.300 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 2oC, ẩm độ 65 ± 2%. Gốc ghép Ánh Dương trước khi ghép có chiều cao trung bình là 75 cm và đang trong giai đoạn ra hoa. Gốc ghép Ánh Dương sau khi cắt bỏ các cành để ghép Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 36 có chiều cao trung bình là 35 cm. Khúc cắt cành ghép là một đoạn trên cành ghép có từ 1 – 3 mắt lá, dài 2 – 3 cm. Có 3 loại cành ghép trên gốc ghép Ánh Dương: + Cành Tự Ghép là khúc cắt cành ghép Ánh Dương (2 - 3 cm) trên gốc ghép Ánh Dương của chính nó. + Cành Ghép là khúc cắt cành ghép Ngọc Tú Cầu (2 - 3 cm) trên gốc ghép Ánh Dương. + Cành Không Ghép là cành trên gốc sứ Ánh Dương bị cắt bỏ một đoạn, nhưng không ghép. Tiền hành theo dõi và đo đạc sự kéo dài các nhánh sứ, đếm số nhánh ra hoa, số hoa trên một phát hoa và đo chiều dài nụ hoa của các nhánh trên các cành Không Ghép, Tự Ghép và Ghép trên gốc sứ Ánh Dương. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong thời gian từ tháng 08/2008 đến tháng 01/2009. Quan sát và đo đạc 4 lần (thời gian tính từ lúc bắt đầu ghép): + Lần 1 khi các nhánh trên cành Không Ghép và Tự Ghép xuất hiện nụ hoa đầu tiên trong lần ra hoa đợt 1 (75 ngày) Cành Ghép Cành Không Ghép Cành Tự Ghép Ảnh 2.9: Các cành Không Ghép, Tự Ghép và Ghép trên gốc ghép Ánh Dương (tháng 9/2008). Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 37 + Lần 2 khi các nhánh trên các cành Không Ghép, Tự Ghép và Ghép sinh trưởng kéo dài mạnh (90 ngày) + Lần 3 khi các nhánh trên cành Không Ghép và Tự Ghép ra hoa nhiều và các nhánh trên cành Ghép xuất hiện nụ hoa đầu tiên trong lần ra hoa đợt 1 (100 ngày). + Lần 4 khi các nhánh trên các cành Không Ghép và Tự Ghép xuất hiện nụ hoa đầu tiên trong lần ra hoa đợt 2 và các nhánh trên cành Ghép vẫn đang ra hoa nhiều trong lần ra hoa đợt 1 (130 ngày) 2.2.6. Xử lí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật * Xử lí IAA 20 mg/l và 30 mg/l, và kết hợp IAA 20 mg/l và BA 20 mg/l tại vùng ghép Sau khi cắt gốc ghép Ánh Dương và khúc cắt trên cành ghép Ngọc Tú Cầu, ta thao tác nhanh, dùng bông gòn có thấm dung dịch chất điều hòa tăng trưởng thực vật (IAA 20 mg/l và 30 mg/l, kết hợp IAA 20 mg/l và BA 20 mg/l) bôi lên chỗ tiếp xúc giữa gốc ghép và cành ghép (vùng ghép). Sau đó, ta tiến hành ghép ngồi như đã trình bày ở trên. * Xử lí GA3 20 mg/l lên các nhánh trên các cành Không Ghép, Tự Ghép và Ghép (giữa 2 giống sứ Ánh Dương và Ngọc Tú Cầu) Thí nghiệm này cũng tiến hành ghép ngồi các cành ghép lên gốc ghép Ánh Dương như ở thí nghiệm trên, giữa 2 giống sứ Ánh Dương và Ngọc Tú Cầu, có 3 loại cành Tự Ghép, Ghép và Không Ghép. Sau khi các nhánh trên các cành ghép xuất hiện các lá đầu tiên (3 tuần sau khi ghép), ta phun lên lá của các nhánh sứ này, vào lúc chiều tối (khoảng 18 giờ đến 19 giờ) 1 lần/tuần, cho đến khi thấy xuất hiện nụ hoa đầu tiên thì dừng. Đối chứng là các nhánh trên cành ghép không xử lí GA3 20 mg/l. Tiền hành theo dõi và đo đạc sự kéo dài các nhánh sứ, đếm số nhánh ra hoa, số hoa trên một phát hoa và đo chiều dài nụ hoa của các nhánh trên các cành Không Ghép, Tự Ghép và Ghép trên gốc ghép Ánh Dương. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần từ tháng 10/2008 đến tháng 2/2009), tại vườn Sứ Thái Q. 11, TP. HCM. Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 38 Quan sát và đo đạc 4 lần (thời gian tính từ lúc bắt đầu ghép): + Lần 1 khi các nhánh trên cành Không Ghép xuất hiện nụ hoa đầu tiên trong lần ra hoa đợt 1 (33 ngày) + Lần 2 khi các nhành trên cành Ghép xuất hiện nụ hoa đầu tiên trong lần ra hoa đợt 1 (44 ngày). + Lần 3 khi các nhánh trên các cành Không Ghép và Tự Ghép xuất hiện nụ hoa đầu tiên trong lần ra hoa đợt 2 (75 ngày) + Lần 4 khi các nhánh trên cành Ghép đang ra hoa nhiều ở lần ra hoa đợt 1 (130 ngày) * Xử lí GA3 20 mg/l và 30 mg/l, và BA 20 mg/l lên các nhánh của cành ghép Thần Tài trên gốc ghép Ánh Dương Cành ghép Thần Tài trên gốc ghép Ánh Dương đã được 26 ngày tuổi kể từ lúc ghép, đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh. Lúc đó, ta phun lên lá các nhánh trên cành ghép Thần Tài, các chất GA3 20 mg/l và 30 mg/l, và BA 20 mg/l, vào lúc chiều tối (khoảng 18 giờ đến 19 giờ) 1 lần/tuần, cho đến khi thấy xuất hiện nụ hoa đầu tiên thì dừng. Đối chứng là các nhánh trên cành ghép Thần Tài đang sinh trưởng, được 26 ngày kể từ lúc ghép, không xử lí chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Sau khi xử lí GA3 20 mg/l và 30 mg/l, và BA 20 mg/l, ta theo dõi sự kéo dài các nhánh và sự ra hoa ở các nhánh trên các cành ghép Thần Tài. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần từ tháng 3/2009 đến tháng 4/2009, ), tại vườn Sứ Thái Q. 11, TP. HCM. * Xử lí GA3 20 mg/l và BA 20 mg/l lên nụ hoa dài nhất trên một phát hoa, ở các nhánh của các cành ghép Thần Tài trên gốc ghép Ánh Dương Phun 1 lần BA 20mg/l, GA3 20mg/l lên các nụ hoa dài nhất (7,0 – 8,0 cm), sắp nở hoa của các nhánh trên cành ghép Thần Tài đang ra hoa đợt 2, vào lúc chiều tối (khoảng 18 giờ đến 19 giờ). Đối chứng là các nhánh trên cành ghép Thần Tài đang ra hoa đợt 2, không xử lí chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Theo dõi và đo đạc sự gia tăng chiều dài và đường kính hoa nở của các nụ hoa dài nhất sau khi xử lí BA 20mg/l, GA3 20mg/l. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần vào tháng 3 năm 2009, tại vườn Sứ Thái Q. 11, TP. HCM. Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Trang Việt HV: Nguyễn Thái Từ Nghiêm Trang 39 2.2.7. Xử lí số liệu Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statiscal Program Scienttific System (SPSS) phiên bản 11.5 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p = 0,05 của giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau. T-Test được dùng để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p = 0,05 của hai giá trị.