Vật liệu và phương pháp trồng cây cọc rào

Vật liệu – Phương pháp  Trang 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Thiết bị ™ Một số thiết bị trong phòng nuôi cây - Phòng nuôi cây được trang bị một số kệ nuôi, mỗi kệ gồm 5 tầng, mỗi tầng lắp đặt 3 bóng đèn huỳnh quang 1,2m (công ty Điện Quang Tp. Hồ Chí Minh) với cường độ chiếu sáng 2500-3000lux. - Ngòai ra, phòng còn được trang bị máy điều hòa nhiệt độ (Dakin, Nhật) để duy trì nhiệt độ phòng nuôi 27 ± 20C, độ ẩm 70%. 27 ± 20C, độ ẩm 70%. Ảnh 2.1: Hệ thống kệ trong phòng nuôi cây ™ Các thiết bị khác - Kính hiển vi quang học - Máy đo pH Presia pH90 - Nồi hấp Hirayama, dung tích 0.0987 m3 (Nhật) - Cân phân tích Toredo, độ chính xác d = 0.0001g (Đức) - Tủ cấy vô trùng Esco, Model AHC-4R1 (Pháp) Vật liệu – Phương pháp  Trang 29 Ảnh 2.2: Một số thiết bị dùng trong thí nghiệm 2.1.2. Dụng cụ Một số dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm: - Dao, kẹp, giấy pelure, giấy cấy, giấy bạc, giấy lọc, đèn cồn - Bình thuỷ tinh hình tam giác 370 ml - Chai nước biển 100 ml và 500 ml - Ống đong 10 ml, 100 ml và 1000 ml - Erlen, phễu thủy tinh, bình lóng 125 ml, chày, cối sứ - Đĩa petri, lam, lamelle,... 2.1.3. Hóa chất Một số hóa chất sử dụng trong thí nghiệm: - Cồn 960, 700 - Javel (natri hypoclorid – NaOCl) (Cơ sở sản xuất Javel Vân Phương, Tp.HCM) Cân phân tích Máy đo PH Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Vật liệu – Phương pháp  Trang 30 - Agar (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh) - Xà phòng Net (công ty cổ phần bột giặt Net, Đồng Nai) - Thuốc chống nấm DITAN M45 - Các hóa chất pha môi trường (xem phần Phụ lục) - Phẩm nhuộm hai màu đỏ carmin – xanh iod (xem phần Phụ lục) - IAA (1mg/l), ABA (1mg/l), Zeatin (1mg/l), GA3 (10mg/l) tinh khiết - Metanol, butanol, ete, cloroform, acid acetic,… 2.1.4. Vật liệu 2.1.4.1. Vật liệu sử dụng trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro Các chồi ngọn và chồi bên (chồi nách) của cây JCL 3 – 6 tháng tuổi có nguồn gốc từ Ấn Độ được trồng tại vườn ươm của Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh. Ảnh 2.3: Cây JCL tại Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh 2.1.4.2. Vật liệu sử dụng trong các thí nghiệm phát sinh hình thái từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Cây Jatropha curcas L. in vitro được nuôi cấy từ các chồi đã khử trùng theo thí nghiệm trên. Thí nghiệm này được khảo sát với loại mô cấy là lớp mỏng tế bào lá. 2.1.4.3. Vật liệu dùng trong sinh trắc nghiệm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) Đoạn diệp tiêu lúa Oryza sativa L. (đối với auxin và acid abcisic) Vật liệu – Phương pháp  Trang 31 Tử diệp dưa chuột Cucumis sativus L. (đối với cytokinin) Cây mầm xà lách Lactuca sativa L. (đối với giberelin) 2.2. Phương pháp 2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro a) Mục đích thí nghiệm: Tìm nồng độ Javel và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng các chồi ngọn và chồi bên cây JCL trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy in vitro. b) Môi trường nuôi cấy: Môi trường được sử dụng để nuôi cấy các mẫu chồi sau khử trùng là môi trường cơ bản McCown Woody Plant (W) (xem Phụ lục), bổ sung vitamin, sucrose 20g/l; agar 7,5g/l và điều chỉnh pH 5,7 ± 0,5. Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C (1atm), trong 20 phút. c) Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được giữ trong phòng sáng (phòng nuôi cây) ở điều kiện nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ chiếu sáng 2500 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng là 14 giờ/ngày. d) Cách thực hiện: - Cây JCL trong vườn ươm được phun thuốc chống nấm DITAN M45 (250 mg/l) 2 ngày trước khi lấy mẫu. - Tiến hành cắt lấy đọan thân còn non mang các chồi ngọn và chồi bên, sau đó cắt bỏ lá và cho mẫu vào dung dịch Javel 50% (v/v) (Javel sau khi mua về được pha lõang bằng nước, Javel 50% = 50% Javel + 50% nước (v/v)). Việc cắt mẫu được thực hiện như sau: Vật liệu – Phương pháp  Trang 32 → → chồi non mắt mầm sau khi cắt bỏ lá mẫu cấy ở môi trường dinh dưỡng Ảnh 2.4: Cách cắt mẫu chồi non trưởng thành - Lấy mẫu ra khỏi dung dịch Javel và tiến hành khử trùng mẫu theo sơ đồ Hình 2.1. Mẫu (chồi ngọn và chồi bên) Ngâm và rửa mẫu trong xà phòng 30’ Đưa mẫu vào tủ cấy vô trùng Đặt mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ, 20 - 30’ Vật liệu – Phương pháp  Trang 33 Hình 2.1: Sơ đồ qui trình khử trùng các chồi ngọn và chồi bên cây JCL Mẫu được khử trùng bằng Javel theo các nghiệm thức trong bảng sau: Bảng 2.1: Bố trí các nghiệm thức khử trùng Vật liệu – Phương pháp  Trang 34 Nghiệm thức Nồng độ Javel ( v/v, % ) Thời gian khử trùng ( phút ) J25-10 25 10 J25-20 25 20 J25-30 25 30 J50-10 50 10 J50-20 50 20 J50-30 50 30 J100-10 100 10 J100-20 100 20 J100-30 100 30 - Mỗi nghiệm thức được thử nghiệm trên 10 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. e) Chỉ tiêu theo dõi Sau 7, 10 và 14 ngày nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: - Tỉ lệ nhiễm - Tỉ lệ nảy chồi - Tỉ lệ nảy chồi và không nhiễm 2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh các cơ quan chồi, rễ của mẫu cấy từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL in vitro a) Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng phát sinh các cơ quan chồi và rễ từ mô sẹo qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL in vitro. Tìm hiểu một số biến đổi về hình thái và sinh lý của mẫu cấy trong quá trình nuôi cấy. b) Môi trường nuôi cấy: Vật liệu – Phương pháp  Trang 35 Môi trường nuôi cấy được sử dụng để khảo sát sự phát sinh hình thái là McCown Woody Plant (W) có bổ sung vitamin; sucrose 20g/l; agar 7,5g/l cùng các chất ĐHSTTV riêng lẻ và tổ hợp giữa chúng ở một số nồng độ khác nhau. Môi trường được điều chỉnh pH 5,7 ± 0,5 và hấp khử trùng ở 1210C (1atm) trong 20 phút. c) Điều kiện nuôi cấy: (như thí nghiệm 1) Mẫu được giữ trong phòng sáng ở điều kiện nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ chiếu sáng 2500 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng là 14 giờ/ngày. d) Cách thực hiện: - Lá JCL in vitro được cắt ngang theo chiều rộng lá với kích thước 1mm x 5mm. - Mỗi nghiệm thức được thử nghiệm trên 12 mẫu cấy, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Vật liệu – Phương pháp  Trang 36 Mẫu cấy ở môi trường dinh dưỡng Chồi JCL in vitro Lá JCL in vitro được cắt lớp mỏng và cấy vào môi trường Ảnh 2.5: Các bước nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL in vitro e) Chỉ tiêu theo dõi Kết quả được đánh giá theo một số chỉ tiêu chính sau: (1) Quan sát và ghi nhận sự thay đổi và những phát sinh hình thái trên mẫu cấy thí nghiệm bằng mắt thường và bằng phương pháp giải phẫu mẫu cấy, nhuộm hai màu. Phương pháp gồm các bước sau đây: - Cắt ngang mẫu cần quan sát với độ dày 1-2 lớp tế bào; - Ngâm Javel trong 10 phút; - Rửa sạch Javel bằng nước cất; - Ngâm trong acid acetic 10% trong 10 phút; - Rửa sạch acid bằng nước cất; - Thấm khô mẫu, nhỏ lên mẫu một giọt thuốc nhuộm son phèn – lục iod, nhuộm trong 15 phút; Vật liệu – Phương pháp  Trang 37 - Rửa sạch thuốc nhuộm bằng nước cất. Đặt mẫu đã nhuộm lên lame, nhỏ lên mẫu một giọt glycerin, đậy lamelle và quan sát mẫu dưới kính hiển vi. (2) Khảo sát sự thay đổi hàm lượng các chất ĐHSTTV trong mô cấy bằng sinh trắc nghiệm (thí nghiệm 2.2.2.4). 2.2.2.1. Nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL 2.2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL ™ Tiến hành: Khảo sát sơ bộ hoạt tính của một số loại auxin khác nhau lên sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL. Mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường W có bổ sung: IBA (0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l); 2,4-D (0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l); IAA (0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l); TDZ (0,1; 0,3; 0,5; 1,0 mg/l). Sau đó tiến hành khảo sát rõ hơn về ảnh hưởng của 2,4-D và IBA lên khả năng hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá. Các mẫu cấy được nuôi trên môi trường W có bổ sung riêng lẻ 2,4-D và IBA ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l. Dụng cụ nuôi cấy là đĩa petri. ™ Điều kiện nuôi cấy: Sau khi cấy, mẫu được đặt trong phòng sáng, ở nhiệt độ 27 ± 20C và được giữ trong điều kiện tối hòan tòan trong 7 – 10 ngày đầu tiên để cảm ứng sự hình thành sẹo. ™ Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự thay đổi của mẫu cấy sau 7, 14, 28 và 56 ngày bằng mắt thường và ghi nhận các kết quả: - Sự gia tăng trọng lượng tươi - % mẫu cấy hình thành mô sẹo 2.2.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL Các tổ hợp chất ĐHSTTV được khảo sát bao gồm: - Tổ hợp 2,4-D (0,1mg/l) và BA (1,0mg/l) - Tổ hợp IBA (0,1mg/l) và BA (1,0mg/l) Vật liệu – Phương pháp  Trang 38 ™ Tiến hành: Mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá JCL được nuôi trên môi trường W + 0,1mg/l 2,4- D (hoặc 0,1mg/l IBA) + 1,0mg/l BA. Dụng cụ nuôi cấy là đĩa petri. ™ Điều kiện nuôi cấy: Sau khi cấy, mẫu được đặt trong phòng sáng, ở nhiệt độ 27 ± 20C và được giữ trong điều kiện tối hòan tòan trong 7 – 10 ngày đầu tiên để cảm ứng sự hình thành sẹo. ™ Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự thay đổi của mẫu cấy sau 7, 14, 28 và 56 ngày nuôi cấy bằng mắt thường và hình thái cấu trúc giải phẫu dưới kính hiển vi quang học và ghi nhận các kết quả: - Sự gia tăng trọng lượng tươi - % mẫu cấy hình thành mô sẹo - Khảo sát sự biến đổi hình thái qua giải phẫu các mẫu cấy 2.2.2.2. Nghiên cứu sự tạo chồi từ mô sẹo tế bào lá cây JCL ™ Tiến hành: Sau 4 tuần, các mô sẹo trên môi trường có bổ sung các tổ hợp 2,4-D (0,1 mg/l) + BA (1,0 mg/l) và IBA (0,1 mg/l) + BA (1,0 mg/l) được cấy chuyền sang môi trường tái sinh để cảm ứng sự tạo chồi. Môi trường tái sinh được sử dụng là môi trường W có bổ sung BA ở các nồng độ 1,0; 3,0 và 5,0 mg/l hoặc không có BA. ™ Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được giữ trong phòng sáng ở điều kiện nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ chiếu sáng 2500 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng là 14 giờ/ngày và được cấy chuyển 2 tuần/lần. ™ Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự thay đổi của mẫu cấy sau 7, 14, 28, 56 ngày nuôi cấy bằng mắt thường và cấu trúc giải phẫu dưới kính hiển vi quang học và ghi nhận các kết quả: - % mẫu cấy hình thành chồi - Số chồi đếm được tái sinh trên một mẫu - Khảo sát sự biến đổi hình thái bằng giải phẫu mẫu cấy 2.2.2.3. Nghiên cứu sự tạo rễ từ mô sẹo tế bào lá cây JCL Vật liệu – Phương pháp  Trang 39 ™ Tiến hành: Sau khỏang 6 tuần nuôi cấy trên môi trường cảm tạo sẹo có bổ sung IBA (0,1 mg/l) và BA (1,0 mg/l), các mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường cảm ứng sự tạo rễ. Môi trường tái sinh được sử dụng là môi trường W không có chất ĐHSTTV hoặc có bổ sung riêng lẻ: - IBA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 3,0 và 5,0 mg/l - NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l ™ Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được giữ trong phòng sáng ở điều kiện nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ chiếu sáng 2500 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng là 14 giờ/ngày và được cấy chuyển 2 tuần/lần. ™ Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự thay đổi của mẫu cấy sau 7, 14, 28 ngày nuôi cấy bằng mắt thường và cấu trúc giải phẫu dưới kính hiển vi quang học và ghi nhận các kết quả: - % mẫu cấy hình thành rễ - Số rễ đếm được tái sinh trên một mẫu - Chiều dài trung bình của rễ - Khảo sát sự biến đổi hình thái bằng giải phẫu mẫu cấy 2.2.2.4. Khảo sát hoạt tính một số chất ĐHSTTV ở các mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo và tái sinh Khảo sát hoạt tính các chất ĐHSTTV nội sinh bao gồm auxin, cytokinin, acid abscisic và giberelin ở các mẫu cấy trên các môi trường: - W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA sau 0, 14, 28, 56 ngày nuôi cấy. - W + 1,0 mg/l BA sau 14, 28 ngày nuôi cấy. * Ly trích các chất ĐHSTTV nội sinh trong mô cấy Cân và nghiền 1g mẫu tươi trong 20ml methanol 80%, ngâm trong 24 giờ. Lọc và rửa bã, lọc 2 lần với 20ml methanol 80%. Cô cạn dịch lọc, hòa tan với 20ml nước cất. Ly trích phân đoạn tiếp tục theo sơ đồ tóm tắt sau: Vật liệu – Phương pháp  Trang 40 Hình 2.2: Sơ đồ li trích và phân đọan các chất ĐHSTTV Nghiền 1g mẫu + 20ml methanol 80% Lọc với 20ml methanol 80% (2 lần) Dịch tan trong nước Dịch trích ete Sắc ký Sinh trắc nghiệm: Auxin, Acid Abscisic, Giberelin Dịch nước Dịch trích ete Sắc ký Sinh trắc nghiệm: Cytokinin Ngâm 24 giờ Cô cạn Thêm 10ml nước pH = 2,5; trích ete (3 lần) Cô cạn pH = 7; trích n- butanol bão hòa Vật liệu – Phương pháp  Trang 41 * Sắc ký Dùng phương pháp sắc ký trên bản mỏng Silicagel F254 (mã số 1.0554 Merk) để phân tách các chất ĐHSTTV. Dung môi di chuyển là cloroform : methanol : acid acetic theo tỷ lệ thể tích 80 : 15 : 5, thực hiện ở nhiệt độ 300C. Nhận diện vị trí các chất ĐHSTTV trên bản sắc ký dưới tia UV 254 và so với chuẩn là IAA, ABA, Zeatin. Riêng đối với GA, phun hỗn hợp acid sulfuric-ethanol theo tỷ lệ 5-95, sấy 1100C trong 10 phút trước khi quan sát dưới tia UV so với chuẩn GA3 sau khi chạy sắc ký, cắt dọc bản sắc ký theo chiều dung môi di chuyển với chiều rộng 2cm, sau đó chia các bản này thành 10 băng theo chiều dọc. Hoạt tính các chất ĐHSTTV được đo ở các Rf tương ứng với vị trí chất chuẩn. Hoạt tính tổng cộng là tổng hoạt tính của các băng. * Sinh trắc nghiệm Đo hoạt tính các chất ĐHSTTV dựa trên các sinh trắc nghiệm. Hoạt tính của auxin và acid abcisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được gieo trên bông ẩm trong tối ở nhiệt độ 30 ± 20C trong khoảng 5 ngày, sau đó tách lấy diệp tiêu trong phòng tối. Khúc cắt diệp tiêu trong sinh trắc nghiệm được để trong tối, nhiệt độ 30 ± 20C và đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với chiều dài sai biệt của khúc cắt diệp tiêu; ngược lại, hoạt tính acid abcisic tỷ lệ nghịch với chiều dài sai biệt của khúc cắt diệp tiêu. So sánh sự sai biệt này với chất chuẩn là IAA tinh khiết 1mg/l và ABA tinh khiết 1mg/l để xác định được hoạt tính auxin và acid abcisic tương đương trong mẫu. Hoạt tính của giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Gieo hạt xà lách trong bông ẩm, ở nhiệt độ 30 ± 20C; sau 1 ngày, chọn các hạt có rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ. Cây mầm xà lách trong sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 30 ± 20C, đo chiều dài sai biệt sau 72 giờ. Hoạt tính giberelin tỷ lệ thuận với chiều dài sai biệt trụ hạ diệp cây mầm so với chuẩn là nước cất và GA3 tinh khiết 10mg/l. Đo hoạt tính cytokinin dựa trên sự gia tăng trọng lượng của tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.). Hạt dưa chuột được gieo trong tối trên bông ẩm, nhiệt độ 30 ± 20C; khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ hạt thì tiến hành thu các tử diệp. Tử diệp dưa chuột trong sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 ± 500 lux, nhiệt độ Vật liệu – Phương pháp  Trang 42 30 ± 20C, đo trọng lượng sai biệt sau 48 giờ. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa chuột trên các dung dịch đo so với chuẩn là nước cất và Zeatin tinh khiết 1mg/l. **Phương pháp phân tích thống kê và vẽ đồ thị Số liệu thí nghiệm được phân tích thô bằng Microsoft Office Excel và phân tích thống kê theo ANOVA 1 và trắc nghiệm phân hạng LSD (Least Significant Difference Test) bằng phần mềm MSTATC, Đại học Michigan, Hoa Kỳ. Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 vẽ đồ thị cột biểu diễn các kết quả thống kê của các chỉ tiêu nghiên cứu.