Vật liệu và phương pháp trồng hướng dương

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 21 2.1. VẬT LIỆU - Hạt giống hoa hướng dương đa sắc TN 18 của công ty TNHH-TM Trang Nông. Hạt được khử trùng bằng cồn 70% (2 phút), tiếp theo bằng Javel 30% (25 phút), sau đó hạt được bóc vỏ và đặt trên môi trường MS không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật, nhằm tạo nguồn mẫu in vitro. - Chồi sinh dưỡng của cây in vitro 3 tuần tuổi (ảnh 2.1, 2.2). - Các khúc cắt của cây in vitro 3 tuần tuổi (ảnh 2.3). - Nụ hoa ở bốn giai đoạn đầu của cây trong vườn. - Nụ hoa ở bốn giai đoạn đầu của cây in vitro (ảnh 2.4): + Giai đoạn nụ non, tương ứng giai đoạn sinh sản R1. + Giai đoạn lá bắc đóng, tương ứng giai đoạn sinh sản R2. + Giai đoạn lá bắc mở, tương ứng giai đoạn sinh sản R3. + Giai đoạn hoa bìa xuất hiện, tương ứng giai đoạn sinh sản R4. Ảnh 2.1: Chồi sinh dưỡng của hướng dương in vitro 3 tuần tuổi Ảnh 2.2: Chồi sinh dưỡng của hướng dương in vitro 3 tuần tuổi dưới kính hiển vi Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 22 Ảnh 2.3: Khúc cắt của hướng dương in vitro 3 tuần tuổi Ảnh 2.4: Nụ hoa ở bốn giai đoạn đầu của hướng dương in vitro (A: Nụ non, B: Lá bắc đóng, C: Lá bắc mở, D: Hoa bìa xuất hiện) D C B A Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 23 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Quan sát sự phát triển của cây trong vườn Theo dõi cây trồng trong vườn ươm, quan sát sự phát triển của cây, sự hình thành và tăng trưởng của cụm hoa bằng mắt thường và thông qua hình thái giải phẫu bằng những lát cắt dọc được nhuộm với phẩm nhuộm hai màu (đỏ carmin và xanh iod) . 2.2.2. Đo cường độ hô hấp nụ hoa cây trong vườn, cây in vitro và cường độ quang hợp lá trưởng thành gần nhất bên dưới nụ hoa in vitro Cường độ hô hấp và quang hợp được đo bằng máy Hansatech. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động: Mẫu thực vật được đặt trong buồng kín. Việc đo dựa vào lượng khí O2 tiêu thụ (hô hấp) hay sản sinh ra (quang hợp) trong buồng, phát hiện bằng điện cực kiểu Clark, khi bơm vào 1 ml không khí, trong tối (hô hấp) hay dưới ánh sáng 10.000 lux (quang hợp), trong thời gian nhất định. Điện cực Clark gồm một cực cathode bằng bạch kim dài khoảng 2 mm và một cực anode bằng bạc được nối và nhấn chìm trong chất điện phân. Cả hai cực được đặt trong một đĩa plastic, cathode nằm giữa vòm và anode nằm quanh một rãnh chứa chất điện phân. Điện cực được bảo vệ bằng một miếng teflon mỏng hoặc màng polythene thấm được oxy và mục đích của vòm là kéo căng màng trên bề mặt của cực cathode. Màng được giữ ở vị trí ổn định nhờ một vòng O. Màng cũng được thấm một lớp mỏng chất điện phân (dung dịch KCl 3M) trên bề mặt điện cực. Một mảnh giấy ngăn thường được đặt phía dưới màng để tạo cho vùng chất điện phân giữa anode và cathode đồng nhất. Khi điện thế ở điện cực ở 600 – 700 mV, oxygen bị khử ở bề mặt cathode (Pt xúc tác) tạo ra H2O2 và O2 sẽ nhận e- phóng thích từ phản ứng anode. Dòng điện sinh ra sẽ được bộ phận Oxygraph nối với điện cực ghi nhận và số liệu sẽ được tự Phản ứng xảy ra ở Anode Ag → Ag+ + e- Ag+ + Cl- → AgCl Phản ứng xảy ra ở Cathode O2 + 2H2O + 2e- → H2O2 + OH- H2O2 + 2e- → 2OH- Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 24 động xử lý nhờ phần mềm Oxylab 32 trên máy tính. Phần mềm này sẽ thể hiện dạng biểu đồ thời gian thực) lượng O2 (µmol) có trong buồng đo theo thời gian (phút). Buồng đo LeafLad 2 của Hansatech là một hệ thống kín. Để cân bằng lượng CO2 trong buồng đo, đệm bicarbonate (KHNO3 hay NaHCO3) 1M được sử dụng. dung dịch này được cho vào một lớp vải xốp, dung dịch sẽ phân ly thành [HCO3] và [CO2] với tỉ lệ 90:1 và do đó làm ổn định lượng CO2 trong buồng đo. 2.2.3. Xác định hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nụ hoa in vitro và trong vườn Auxin, cytokinin và gibberellin được ly trích, phân đoạn trên bản mỏng sắc ký silicagel và đo hoạt tính nhờ các sinh trắc nghiệm (Meidner, 1984; Yokota và cs., 1980; Bùi Trang Việt, 1992).  Ly trích Nghiền 1g mẫu vật tươi trong 20 ml methanol 80%, ngâm 24 giờ. Lọc và rửa lại bã lọc hai lần với 10 ml methanol 80%. Dịch lọc được cô cạn, sau đó hòa với 5 ml nước cất. Sự ly trích và phân đoạn tiếp tục được thực hiện theo sơ đồ (hình 2.1).  Sắc ký Dùng phương pháp sắc ký bản mỏng Silicagel F254 để phân tách các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, dung môi di chuyển là cloroform: metanol: acid acetic (tỷ lệ theo thể tích 80:15:5), thực hiện ở nhiệt độ 30oC.  Xác định vị trí và cô lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký Sử dụng đèn UV chiếu trên bản mỏng silicagel để phát hiện và xác định vị trí của IAA, ABA và gibberellin trên bản sắc ký. Tương ứng các vị trí này của các chất chuẩn, hỗn hợp các chất nội sinh sẽ được phát hiện và cô lập riêng bằng cách dùng dao lam cạo lấy các hạt silic từng vùng trên bản sắc ký và cho vào các đĩa petri để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính. Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 25  Sinh trắc nghiệm + Hoạt tính auxin và acid abscisic Hoạt tính auxin và acid abscisic được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được gieo trên bông gòn ẩm trong tối ở nhiệt độ 28oC  2oC, sau 3 ngày tách lấy diệp tiêu trong phòng tối. Khúc cắt diệp tiêu trong các sinh trắc nghiệm được để trong tối, nhiệt độ 28oC  2oC và đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn IAA tinh khiết 1 mg/L. Hoạt tính acid abscisic tỷ lệ nghịch với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn ABA tinh khiết 1 mg/L. + Hoạt tính cytokinin Hoạt tính cytokinin được đo dựa trên sự tăng trọng lượng của tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.). Hạt dưa chuột được gieo trong tối trên bông ẩm, nhiệt độ 28oC  2oC, khi rễ mầm vừa nhú ra khỏi vỏ hạt, thu các tử diệp. Tử diệp dưa chuột trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500  500 lux, nhiệt độ 28oC  2oC, đo trọng lượng sai biệt sau 48 giờ. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa chuột so với chuẩn là nước cất và BA tinh khiết 1 mg/L. + Hoạt tính gibberellin Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Gieo hạt xà lách trên bông gòn ẩm, ở nhiệt độ 28oC  2oC, sau 1 ngày chọn các hạt có rễ vừa lú ra khỏi vỏ. Cây mầm xà lách trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500  500 lux, nhiệt độ 28oC  2oC, đo chiều dài sai biệt sau 72 giờ. Hoạt tính gibberellin tỷ lệ thuận với chiều dài sai biệt trụ hạ diệp cây mầm so với chuẩn là nước cất và GA3 tinh khiết 10 mg/L. Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 26 Nghiền 1g mẫu + 20ml Metanol 80% (Ngâm 24 giờ) Cô cạn dịch lọc còn ≈ 1ml Bình lóng, thêm 15ml Eter, lắc 20 phút Lắc, lọc dung dịch Thêm 5ml nước cất, chỉnh pH~ 2,5 (HCl 10 %) + 3ml NaHCO3 8% (3 lần) Dịch Eter Quạt cạn Dịch Eter (lớp trên) Sắc ký Sinh trắc nghiệm auxin, AAB và GA Chỉnh pH~ 7, Thêm 10ml n- Butanol bão hòa nước, lắc 15 phút ( 3 lần) Dịch nước (lớp dưới) Sinh trắc nghiệm cytokinin Dịch butanol + 3ml NaHCO3 8% (3 lần) Dịch butanol Quạt cạn Hình 2.1: Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 27 2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng lên sự phát triển cụm hoa a) Chồi sinh dưỡng của cây 3 tuần tuổi được cấy lên các môi trường: - Môi trường MS ½ (khoáng đa lượng giảm đi hai lần) - Môi trường MS - Môi trường MS giảm NH4NO3 đi hai lần, tăng KH2PO4 lên hai lần. - Môi trường MS tăng KH2PO4 lên hai lần nhưng không giảm NH4NO3. Các môi trường đều được bổ sung 50 g/L sucrose và 0,5 g/L casein hydrolysate. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 mẫu và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi là số lượng chồi sinh sản hình thành trên một mẫu cấy ban đầu sau 3 tuần nuôi cấy. b) Chồi sinh sản ở giai đoạn nụ non vừa hình thành bên trên được cấy lên các môi trường tương tự giai đoạn cảm ứng tượng hoa để khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng lên giai đoạn tăng trưởng cụm hoa. Chỉ tiêu theo dõi là số lượng hoa bìa và hoa đĩa trên một cụm hoa. 2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lên sự phát triển cụm hoa Chồi sinh sản ở giai đoạn nụ non được cấy lên môi trường MS bổ sung 0,5 g/L casein hydrolysate và sucrose ở các nồng độ 30, 40, 50, 60 g/L. Mẫu được cấy chuyền sau mỗi 3 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 mẫu và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi là số lượng hoa bìa và hoa đĩa trên một cụm hoa. 2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý mẫu cấy lên sự phát triển cụm hoa Chồi sinh sản ở giai đoạn nụ non được cấy lên môi trường MS tăng KH2PO4 lên hai lần, bổ sung 50 g/L sucrose; 0,5 g/L casein hydrolysate và 1 mg/L IBA. - Cách 1: Cắt bỏ hết lá xung quanh chồi hoa và ở các đốt bên dưới. - Cách 2: Cắt bỏ bớt lá, chỉ để lại 2 – 4 lá gần chồi hoa nhất đồng thời cắt bỏ hoa phụ bên hông hoa chính và hoa ở các nhánh dưới khi các hoa này xuất hiện trong quá trình nuôi cấy. - Cách 3: Để lại toàn bộ lá. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 mẫu và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi là số lượng hoa bìa và hoa đĩa trên một cụm hoa. Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 28 2.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên sự phát triển cụm hoa 2.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên sự phát triển cụm hoa Chồi sinh sản ở giai đoạn nụ non được cấy lên môi trường MS bổ sung 50 g/L sucrose; 0,5 g/L casein hydrolysate và kinetin ở các nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2 mg/L. Môi trường MS không bổ sung kinetin là nghiệm thức đối chứng. Mẫu được cấy chuyền sau mỗi 3 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 mẫu và 3 lần lặp lại. 2.2.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự phát triển cụm hoa Chồi sinh sản ở giai đoạn nụ non được cấy lên môi trường MS bổ sung 50 g/L sucrose; 0,5 g/L casein hydrolysate và IBA ở các nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2 mg/L. Nghiệm thức đối chứng là môi trường không bổ sung IBA. Mẫu được cấy chuyền sau mỗi 3 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 mẫu và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi là số lượng hoa bìa và hoa đĩa trên một cụm hoa. 2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng PBZ lên sự sinh trưởng và hình thành hoa cũng như ảnh hưởng của PBZ trong giai đoạn sinh trưởng lên giai đoạn phát triển cụm hoa. a) Các khúc cắt và chồi sinh dưỡng của cây 3 tuần tuổi được cấy lên môi trường MS bổ sung 50 g/L sucrose; 0,5 g/L casein hydrolysate và PBZ ở các nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2 mg/L. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 mẫu và 3 lần lặp lại. Chỉ tiêu theo dõi là chiều cao trung bình của cây và số chồi sinh sản hình thành trên một mẫu cấy ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy. b) Các chồi sinh sản ở giai đoạn nụ non hình thành trên môi trường bổ sung 1 mg/L PBZ được cấy chuyển sang môi trường MS tăng KH2PO4 lên hai lần, bổ sung 50 g/L sucrose; 0,5 g/L casein hydrolysate và 1 mg/L IBA. 2.2.9. Điều kiện thí nghiệm - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày - Cường độ chiếu sáng: 2400 – 2500 lux - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 20C Luận văn Thạc sĩ GVHD: PGS. TS. Bùi Văn Lệ HV: Lê Thị Trang Nhã Trang 29 - Độ ẩm tương đối: 70 ± 2% Thời gian và địa điểm thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 9/2008 đến tháng 9 năm 2009 tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật và Chuyển hóa sinh học, khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM và phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.HCM. 2.2.10. Xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statiscal Program Scienttific System (SPSS) phiên bản 11.5 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p = 0,05 của giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau. T-Test được dùng để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất p = 0,05 của hai giá trị.