Vật liệu và phương pháp xác định gen kháng ceftriaxone ở vi khuẩn shigella sonnei phân lập từ các mẫu bệnh phẩm

VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 2.1 Thieát bò - Caân phaân tích (AND) - Caân kyõ thuaät - Maùy ño pH (Jenway) - Tuû aám (SANYO) - Tuû saáy (SANYO) - Boàn uû nhieät (Techne) - Tuû -200C (Sanyo) - Tuû -800C (Sanyo) - Maùy ly taâm thöôøng vaø ly taâm laïnh (eppendorf) - Maùy vortex (Jencons) - Maùy ño quang phoå DNA (NanoDrop, Thermo Scientific) - Maùy PCR (Eppendorf) - Boä ñieän di DNA (Biorad) - Maùy chuïp hình gel (Biorad) - Multipipette caùc loaïi - Micropipette vaø ñaàu típ caùc loaïi - Eppendorf caùc loaïi - Maùy giaûi trình töï 3130X (Applied Biosystem) - Giaáy loïc Whatman – 3MM - Maùy laéc saøng (Luckham) - Maùy saáy khoâ DNA (ThermoSavant) - Maùy chieáu tia UV (Appligene) - Maøng loïc (Amersham) - Maùy huùt chaân khoâng (Biorad) - Hypercassette (Amersham) - Boàn uû nhieät duøng trong lai Southern Blot (Thermo) - Maùy ñieän bieán naïp (Biorad) 2.2 Hoùa chaát 2.2.1 Hoùa chaát taùch chieát DNA boä gen Boä kit taùch chieát DNA boä gen Wizard (Promega). Boä kít naøy goàm caùc thaønh phaàn: dung dòch ly giaûi maøng nhaân, dung dòch tuûa protein, RNase, isopropanol, ethanol 70% vaø dung dòch ñeäm TE. 2.2.2 Hoùa chaát taùch chieát DNA plasmid - Hoùa chaát vaø ñeäm duøng trong taùch chieát DNA plasmid cuûa vi khuaån baèng phöông phaùp cuûa Kado – Liu [7] o Dung dòch ñeäm E: 40mM Tris, 2mM EDTA, pH 7,9 o Dung dòch ñeäm ly giaûi: SDS 10%, 1M Tris, pH 12,6. Dung dòch naøy chæ ñöôïc söû duïng trong voøng 1 ngaøy sau khi pha. o Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25/24/1) (Sigma) - Boä kít taùch chieát plasmid NucleoBond (Macherey-Nagel). Boä kít naøy taùch chieát theo phöông phaùp SDS – kieàm. Boä kít naøy bao goàm dung dòch ly giaûi, dung dòch ñeäm trung hoøa, dung dòch dung giaûi DNA plasmid vaø coät silica. 2.2.3 Hoùa chaát duøng trong ñieän di DNA - Agarose vaø agarose coù ñoä noùng chaûy thaáp (Biorad) - Ñeäm TBE 1X duøng ñeå pha gel agarose vaø chaïy ñieän di coù thaønh phaàn: Tris 10,8 g Acid boric 55 g EDTA 0,5M 40 ml EDTA - Ñeäm naïp maãu (6X) coù thaønh phaàn: Orange G 0,25% (w/v) Glycerol 30% (v/v) - Dung dòch nhuoäm DNA treân agarose: Ethidium bromide 1% 2.2.4 Hoùa chaát duøng trong phaûn öùng PCR Hoùa chaát duøng trong phaûn öùng PCR nhö dung dòch ñeäm cho phaûn öùng PCR 10X, dNTP, MgCl2 ñöôïc cung caáp bôûi Biorad vaø Roche. Taq DNA polymerase ñöôïc cung caáp bôûi Bioline. Caùc caëp moài duøng trong phaûn öùng PCR ñöôïc lieät keâ trong baûng 2.3. Thaønh phaàn phaûn öùng nhö trong baûng 2.1 Baûng 2.1 Thaønh phaàn cuûa phaûn öùng PCR Thaønh phaàn Theå tích Noàng ñoä Ñeäm 10X 5 μl 1X dNTP (20 mM moãi loaïi) 0,5 μl 2 mM MgCl2 (50 mM) 2 μl 10 mM Moài xuoâi (10 μM) 1 μl 0,2 μM Moài ngöôïc (10 μM) 1 μl 0,2 μM DNA baûn maãu 100 ng 2 ng/μl Nöôùc caát vöøa ñuû 50 μl 2.2.5 Hoùa chaát duøng ñeå tinh saïch saûn phaåm cuûa phaûn öùng PCR Boä kít QIAquick PCR purification (Qiagen) ñöôïc duøng ñeå tinh saïch saûn phaåm cuûa phaûn öùng PCR baèng coät haáp thu silica, goàm caùc thaønh phaàn: - Dung dòch ñeäm PB giuùp DNA baùm ñöôïc treân coät silica - Dung dòch ñeäm PE coù chöùa ethanol coù taùc duïng röûa troâi nhöõng thaønh phaàn khoâng caàn thieát (moài, Taq DNA polymerase, muoái…) ra khoûi coät. - Nöôùc caát voâ truøng - Caùc coät silica vaø oáng chöùa dung dòch bò röûa troâi 2.2.6 Hoùa chaát duøng trong giaûi trình töï Boä kít phaûn öùng PCR giaûi trình töï BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem), goàm caùc thaønh phaàn: - Dung dòch ñeäm cho phaûn öùng PCR giaûi trình töï - Dung dòch BigDye Terminator (chöùa ddNTP, enzyme DNA polymerase) 2.2.7 Hoùa chaát duøng trong lai Southern blot 2.2.7.1 Hoùa chaát ñaùnh daáu maãu doø DNA vaø hieän maøu Maãu doø DNA ñöôïc ñaùnh daáu baèng boä kít ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System (Amersham). Boä kít naøy goàm caùc thaønh phaàn: - Hoùa chaát ñaùnh daáu DNA - Glutaraldehyde - Nöôùc caát voâ truøng - Gold hybridization buffer (dung dòch ñeäm lai vaøng) - Hoùa chaát khoùa maøng - Hoùa chaát phaùt hieän ECL 1 vaø 2 2.2.7.2 Dung dòch laøm saïch (depurination solution) HCl 250 mM 2.2.7.3 Dung dòch bieán tính DNA NaCl 1,5 M NaOH 0,5 M 2.2.7.4 Dung dòch trung hoøa NaCl 1,5 M Tris – HCl 0,5 M pH 7,5 2.2.7.5 Dung dòch röûa 20X SSC Na3COOH.2H2O 0,3 M NaCl 3 M pH 7,0 2.2.7.6 Dung dòch tieàn lai NaCl 0,5 M Hoùa chaát khoùa maøng 5% (w/v) Boå sung gold hybridization buffer , khuaáy ôû nhieät ñoä 420C cho ñeán khi caùc chaát tan heát (khoaûng 1 giôø) 2.2.7.7 Dung dòch ñeäm röûa laàn 1 Urea 6 M SDS 0,4% (w/v) 0,5X SSC 2.2.7.8 Dung dòch ñeäm röûa laàn 2 1X SSC 2.2.7.9 Dung dòch lai: Dung dòch tieàn lai coù boå sung 10 μl maãu doø ñöôïc ñaùnh daáu 2.2.7.10 Hoùa chaát hieän phim X – ray developer (Fujifilm) X – ray fixer (Fujifilm) 2.2.8 Thang DNA Thang DNA 1kb plus (Invitrogen) coù kích thöôùc nhö hình 2.1 Hình 2.1 Kích thöôùc thang 1kb plus 2.3 Moâi tröôøng 2.3.1 Moâi tröôøng LB (Luria – Bertami) (trong 1 lít moâi tröôøng) Trypton 10 g Cao naám men 5 g NaCl 10 g 2.3.2 Moâi tröôøng LB Agar: thaønh phaàn töông töï moâi tröôøng LB coù boå sung theâm 2% agar. 2.3.3 Moâi tröôøng NA (Nutrient Agar) (trong 1 lít moâi tröôøng) Peptone 5 g Cao thòt 2 g NaCl 1 g Agar 20 g 2.3.4 Moâi tröôøng MH (Mueller – Hinton) (trong 1 lít moâi tröôøng) Cao thòt 2 g Casein thuûy giaûi 17,5 g Tinh boät 1,5 g Agar 17 g 2.3.5 Moâi tröôøng MC (MacConkey Agar) (trong 1 lít moâi tröôøng) Peptone 17 g Proteose Peptone 3 g Lactose 10 g Bile Salts No. 3 1,5 g NaCl 5 g Agar 13,5 g Neutral Red 0,03 g Tím tinh theå 0,001g 2.3.6 Moâi tröôøng XLD (xylose-lysine-deoxycholate agar) (trong 1 lít moâi tröôøng) Cao naám men 3 g L-lysine 5 g Xylose 3,75 g Lactose 7,5 g Sucrose 7,5 g Natri deoxycholate 1 g NaCl 5 g Natri thiosulfate 6,8 g Saét ammonium citrate 0,8 mg Phenol red 0,08 g Agar 12,5 g 2.3.7 Moâi tröôøng SB (Selenite Broth) (trong 1 lít moâi tröôøng) Peptone 5 g Lactose 4 g Na2HPO4 9,5 g NaH2PO4 10 g Sodium selenite 0,004 g 2.4 Phöông phaùp Quy trình thöïc hieän cuûa nghieân cöùu ñöôïc toùm taét trong sô ñoà 2.1. Sô ñoà 2.1 Quy trình thöïc hieän nghieân cöùu 2.4.1 Phaân laäp vaø ñònh danh S. sonnei [1]: Maãu phaân ñöôïc laáy tröïc tieáp töø beänh nhaân, giöõ trong loï voâ truøng. Duøng que caáy caáy maãu beänh phaåm leân moâi tröôøng choïn loïc MC, XLD, vaø cho khoaûng 2 gam phaân töôi vaøo moâi tröôøng taêng sinh SB. UÛ vi khuaån ôû 37oC trong 18 ñeán 24 giôø. Ngaøy 2: choïn nhöõng khuaån laïc trong, khoâng maøu (do khoâng leân men lactose) treân moâi tröôøng MC, XLD ñeå tieán haønh caùc phaûn öùng sinh hoùa ñònh Xaùc ñònh khaû naêng sinh enzyme ESBL cuûaS. Taïo doøng vi khuaån E. coli mang gen khaùng ceftriaxone Xaùc ñònh gen maõ hoùa enzyme ESBL baèng phöông phaùp PCR Giaûi trình töï vaø so saùnh vôùi cô sôû döõ lieäu NCBI Xaùc ñònh plasmid mang gen khaùng ceftriaxone Maãu beänh phaåm Phaân laäp vaø ñònh danh Shigella sonnei Xaùc ñònh khaùng sinh ñoà vaø MIC cuûaS. sonnei CroR danh Shigella. Song song ñoù, caùc khuaån laïc naøy cuõng ñöôïc caáy treân moâi tröôøng NA ñeå kieåm tra ñoä thuaàn. Beân caïnh ñoù, beänh phaåm sau khi taêng sinh trong moâi tröôøng SB cuõng ñöôïc caáy treân moâi tröôøng MC vaø XLD ñeå tìm Shigella spp. - Thöû nghieäm KIA (Kliger’s iron agar): ñaây laø moâi tröôøng thaïch nghieâng coù chöùa dextrose vaø lactose, vaø chaát chæ thò maøu ñöôïc duøng laø phenol ñoû. Vi khuaån ñöôïc caáy thaúng xuoáng gaàn ñaùy oáng thaïch, caáy ria treân beà maët thaïch nghieâng, vaø uû ôû 370C trong 18 ñeán 24 giôø. Keát quaû ñöôïc theå hieän nhö sau: o Vi khuaån khoâng leân men: vi khuaån moïc treân beà maët thaïch nghieâng nhôø phaân huûy caùc thaønh phaàn protein trong moâi tröôøng thaønh caùc saûn phaåm kieàm. Beà maët vaø phaàn ñaùy thaïch nghieâng vaãn coù maøu ñoû. o Vi khuaån leân men dextrose vaø khoâng leân men lactose: trong voøng 12 giôø sau khi uû, vi khuaån leân men dextrose vaø taïo caùc saûn phaåm coù tính acid, laøm moâi tröôøng vaø maët thaïch coù maøu vaøng. Tuy nhieân, sau 12 giôø, dextrose söû duïng heát, vi khuaån treân beà maët thaïch tieáp tuïc taêng tröôûng baèng phaân huûy caùc thaønh phaàn protein trong moâi tröôøng. Khoaûng töø 18 ñeán 24 giôø sau, saûn phaåm kieàm taïo ra laøm moâi tröôøng treân beà maët thaïch laïi trôû neân ñoû. o Vi khuaån leân men caû dextrose vaø lactose: beà maët thaïch nghieâng vaø phaàn ñaùy moâi tröôøng coù maøu vaøng. o Moâi tröôøng KIA cuõng chöùa natri thiosulfate (Na2S2O3) vaø saét sulfate (FeSO4) laøm chaát chæ thò cho vieäc taïo H2S. Keát quaû döông tính khi xung quanh moâi tröôøng xuaát hieän tuûa maøu ñen. - Thöû nghieäm Urease: xaùc ñònh khaû naêng phaân giaûi urea cuûa vi sinh vaät do taùc duïng cuûa enzyme urease. (NH2)2CO + 2H2O + urease → CO2 + H2O + 2NH3 ↔ (NH4)2CO3 - Thöû nghieäm citrate: nhaèm xaùc ñònh khaû naêng söû duïng citrate vaø muoái ammonium nhö nguoàn carbon vaø nitô duy nhaát cuûa vi khuaån. Vi khuaån bieán döôõng citrate duøng muoái ammonium taïo ammonia vaø laøm kieàm hoùa moâi tröôøng. Chaát chæ thò söû duïng trong thöû nghieäm naøy laø bromthymol blue (trung tính: maøu xanh laù caây, pH>7,6: maøu xanh thaãm). - Thöû nghieäm indole: nhaèm xaùc ñònh khaû naêng thuûy giaûi tryptophan nhôø enzyme tryptophanase thaønh indole cuûa vi sinh vaät. Indole taïo thaønh ñöôïc phaùt hieän baèng phaûn öùng vôùi dung dòch Kovac (para- dimethylaminobenzaldehyde trong coàn) taïo thaønh phöùc chaát daïng quinine maøu ñoû tía. - Thöû nghieäm ñoû methyl: ñaây laø thöû nghieäm ñònh tính veà khaû naêng moät vi khuaån leân men glucose thaønh nhöõng saûn phaåm coù tính acid cao hay thaønh nhöõng saûn phaåm ít tính acid nhö ethanol hay butanediol. Thöû nghieäm naøy duøng ñoû methyl laøm chaát chæ thò pH (coù maøu ñoû khi ñoä pH cuûa moâi tröôøng thaáp hôn 4,4). Ngaøy 3: ñoïc keát quaû caùc phaûn öùng sinh hoùa. Vi khuaån ñöôïc xaùc ñònh laø Shigella spp. khi coù keát quaû sinh hoùa nhö sau: coù theå phaân giaûi glucose nhöng khoâng phaân giaûi lactose, khoâng sinh hôi, khoâng sinh H2S, khoâng di ñoäng, khoâng sinh indole, khoâng phaân giaûi urea, khoâng phaân giaûi nitrate, coù phaûn öùng ñoû methyl döông tính. Thöïc hieän phaûn öùng ngöng keát khaùng nguyeân ñeå xaùc ñònh tyùp huyeát thanh cho töøng loaïi vi khuaån. Trong tröôøng hôïp keát quaû thöû nghieäm baèng moät soá phaûn öùng sinh hoùa vaø keát quaû phaûn öùng huyeát thanh nhö treân khoâng roõ raøng, vi khuaån ñöôïc ñònh danh baèng boä kít API20E. Boä kít naøy laø heä thoáng ñònh danh ñöôïc chuaån hoùa ñoái vôùi nhoùm Enterobacteriaceae söû duïng 21 phaûn öùng sinh hoùa vaø phaân tích keát quaû döïa treân phaàn meàm vi tính. Caùc böôùc ñöôïc tieán haønh theo höôùng daãn cuûa nhaø saûn xuaát vaø keát quaû thu nhaän ñöôïc seõ ñöôïc tra vôùi cô sôû döõ lieäu ñeå ñònh danh vi khuaån. Tuy nhieân, boä kít chæ ñònh danh chính xaùc ñöôïc Shigella sonnei, nhöõng Shigella khaùc ñöôïc ghi nhaän vôùi keát quaû Shigella spp. Vì vaäy, khi coù keát quaû API20E laø Shigella spp., thöû nghieäm laïi baèng phaûn öùng huyeát thanh ñeå ñònh danh nhöõng loaøi khaùc thuoäc hoï Shigella. Caùc böôùc ñònh danh vi khuaån S. sonnei ñöôïc toùm taét trong sô ñoà 2.2. Sô ñoà 2.2 Sô ñoà ñònh danh Shigella sonnei Maãu beänh phaåm (maãu phaân) Caáy treân moâi tröôøng choïn loïc MC, XTD Caáy taêng sinh treân moâi tröôøng SB Choïn khuaån laïc trong, khoâng maøu (khoâng leân men lactose) Thöû nghieäm caùc phaûn öùng sinh hoùa Shigella spp. Ñònh danh baèng boä kit API20E Shigella sonnei Shigella spp. 2.4.2 Xaùc ñònh khaùng sinh ñoà vaø noàng ñoä öùc cheá toái thieåu (MIC) cuûa S. sonnei CroR ñoái vôùi moät soá khaùng sinh Chuûng thöïc hieän: 21 chuûng vi khuaån S. sonnei CroR phaân laäp ñöôïc töø caùc maãu beänh phaåm taïo Beänh vieän Beänh Nhieät ñôùi töø naêm 2006 ñeán naêm 2008. Caùch thöïc hieän: Huyeàn phuø moät khuaån laïc ñôn cuûa vi khuaån S. sonnei CroR trong 5 ml nöôùc caát, sau ñoù duøng taêm boâng caáy traûi treân moâi tröôøng MH. - Ñoái vôùi thöû nghieäm ñoä nhaïy khaùng sinh: Ñaët ñóa khaùng sinh leân ñóa moâi tröôøng MH ñaõ ñöôïc traûi vi khuaån, uû ñóa ôû 37oC. Sau 12-16 giôø, ño ñöôøng kính voøng voâ khuaån. - Ñoái vôùi thöû nghieäm xaùc ñònh noàng ñoä öùc cheá toái thieåu (MIC): Ñaët thanh Etest vôùi töøng loaïi khaùng sinh leân ñóa ñaõ ñöôïc caáy traûi. UÛ ñóa ôû 37oC vaø ñoïc keát quaû sau 12-16 giôø. Keát quaû nhaïy, trung gian vaø khaùng khaùng sinh ñöôïc ñoïc theo Vieän Caùc Tieâu Chuaån Trong Phoøng Thí Nghieäm vaø Laâm Saøng (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) (baûng 2. 2). Baûng 2.2 Tieâu chuaån veà 1 soá khaùng sinh cuûa hoï vi khuaån Enterobacteriaceae [1] Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Giaù trò MIC (μg/ml) Teân khaùng sinh Löôïng khaùng sinh Khaùng Trung gian Nhaïy Khaùng Nhaïy Ampicillin 10 µg ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 ≥ 32 ≤ 8 Trimethoprim - sulfamethoxazole 23,75 μg ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 ≥ 8/152 ≤ 2 / 38 Chloramphenicol 30 μg ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 ≥ 32 ≤ 8 Nalidixic acid 30 μg ≤ 14 14 - 18 ≥ 19 ≥ 32 ≤ 8 Tetracycline 30 μg ≤ 14 15 - 18 ≥ 19 ≥ 16 ≤ 4 Gentamicin 10 μg ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 ≥ 8 ≤ 4 Ofloxacin 5 μg ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 ≥ 4 ≤ 2 Ciprofloxacin 5 μg ≤ 15 16 - 20 ≥ 21 ≥ 4 ≤ 1 Gatifloxacin 5 μg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ≥ 8 ≤ 2 Ceftriazone 30 μg ≤ 13 14 - 20 ≥ 21 ≥ 64 ≤ 8 Ceftazidime 30 μg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ≥ 32 ≤ 8 2.4.3 Xaùc ñònh khaû naêng sinh ESBL cuûa S. sonnei khaùng ceftriaxone Caùc chuûng S. sonnei CroR sau khi xaùc ñònh khaùng sinh ñoà ñöôïc xaùc ñònh khaû naêng sinh ESBL baèng phöông phaùp ñóa ñoâi theo khuyeán caùo cuûa Toå chöùc Y teá Theá giôùi WHO. Caùch thöïc hieän nhö sau: huyeàn phuø moät khuaån laïc ñôn cuûa vi khuaån S. sonnei khaùng ceftriaxone trong 5 ml nöôùc caát, sau ñoù duøng taêm boâng caáy traûi treân moâi tröôøng MH. Hai caëp ñóa khaùng sinh cefotaxime (CTX), cefotaxime/clavulanate (CTX-CLA) vaø ceftazidime (CAZ), ceftazidime/clavulanate (CAZ-CLA) ñöôïc ñaët thaúng haøng theo töøng caëp, vôùi khoaûng caùch töø trung taâm ñóa naøy ñeán trung taâm ñóa kia laø 30 mm. Keát quaû döông tính khi voøng voâ khuaån quanh ñóa khaùng sinh coù keát hôïp vôùi clavulanate lôùn hôn voøng voâ khuaån quanh ñóa chæ chöùa khaùng sinh 5 mm (hình 2.2). Hình 2.2 Vò trí ñaët ñóa khaùng sinh vaø caùch ñoïc keát quaû kieåm tra ESBL 2.4.4 Taùch chieát vaät lieäu di truyeàn cuûa vi khuaån S. sonnei: 2.4.4.1 Taùch chieát DNA boä gen cuûa vi khuaån Chuyeån moät khuaån laïc ñôn S. sonnei CroR vaøo 5 ml moâi tröôøng LB, nuoâi caáy laéc qua ñeâm ôû 37oC, 150 voøng/phuùt. Thu sinh khoái vaø taùch chieát DNA boä gen cuûa vi khuaån baèng boä kít taùch chieát DNA boä gen Wizard (Promega)ø. DNA sau khi thu ñöôïc baèng boä kít naøy seõ ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä baèng maùy Nanodrop. 2.4.4.2 Taùch chieát plasmid baèng phöông phaùp cuûa Kado – Liu Nguyeân taéc: Vi khuaån seõ ñöôïc ly giaûi baèng SDS. Trong ñieàu kieän kieàm pH 12,6, DNA plasmid cuûa vi khuaån seõ khoâng bò aûnh höôûng vaø caáu truùc sô caáp cuûa DNA vi khuaån cuõng oån ñònh, caùc DNA giaøu guanine vaø cytocine seõ bò deproton hoùa cuûa caùc nhoùm guanine. Khi xöû lyù vôùi nhieät ñoä töø 50 – 95oC trong ñieàu kieän kieàm ESBL döông tính khi a1 ≥ b1 + 5 mm hoaëc / vaø a2 ≥ b2 + 5 mm a1, a2: ñöôøng kính voøng voâ khuaån quanh ñóa khaùng sinh CTX-CLA, CAZ-CLA b1, b2: ñöôøng kính voøng voâ khuaån quanh ñóa khaùng sinh CTX, CAZ pH 12,6, DNA plasmid khoâng bò aûnh höôûng trong 20 ñeán 30 phuùt, nhöng laøm bieán tính hoaøn toaøn vaø loaïi boû caáu truùc baäc hai cuûa DNA maïch thaúng. Khi xöû lyù vôùi Phenol/Chloroform, caùc xaùc voû vi khuaån, protein cuõng nhö DNA nhieãm saéc theå bò bieán tính, vaø ôû pha döôùi, trong khi DNA plasmid vaãn ôû caáu hình sieâu xoaén, vaø ôû pha treân. Caùch thöïc hieän: - Chuyeån moät khuaån laïc S. sonnei (khaùng hoaëc nhaïy vôùi ceftriaxone) vaøo 5 ml moâi tröôøng LB, nuoâi caáy laéc qua ñeâm ôû 37oC, 150 voøng/phuùt. Ly taâm thu sinh khoái ôû 13.200 voøng/ phuùt trong 3 phuùt taïi nhieät ñoä phoøng. - Huyeàn phuø sinh khoái thu ñöôïc sau khi ly taâm vaøo 150 μl dung dòch ñeäm E. - Boå sung 300 μl dung dòch ñeäm ly giaûi, ñaûo troän nheï nhaøng. - UÛ dòch huyeàn phuø taïi 55oC, 1 giôø. - Boå sung 600 μl Phenol/Chloroform (tæ leä 1:1), troän ñeàu cho ñeán khi dòch huyeàn phuø coù maøu traéng söõa. Sau ñoù, ly taâm 13,200 voøng/ phuùt trong 30 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng. - Thu 30 – 40 μl dòch noåi, boå sung 6 μl dung dòch ñeäm naïp maãu, chaïy ñieän di treân gel agarose 0,7%, 90 Volt, trong 3 giôø. - Nhuoäm gel agarose vôùi ethidium bromide, ñoïc keát quaû döôùi maùy chieáu UV. 2.4.4.3 Taùch chieát plasmid baèng kít cuûa NucleoBond DNA plasmid vi khuaån ñöôïc taùch chieát theo höôùng daãn cuûa nhaø saûn xuaát. Boä kít naøy taùch chieát vi khuaån qua caùc böôùc: ly taâm thu sinh khoái vi khuaån, hoøa tan vi khuaån vaøo dung dòch ñeäm, ly giaûi vi khuaån baèng dung dòch SDS – kieàm, trung hoøa SDS, gaén DNA plasmid leân coät silica, dung giaûi DNA plasmid vaøo dung dòch TE. 2.4.5 Taïo doøng gen khaùng ceftriaxone 2.4.5.1 Taïo vector mang gen khaùng ceftriaxone - Plasmid cuûa vi khuaån Shigella sonnei CroR sau khi taùch chieát ñöôïc caét ngaãu nhieân baèng enzyme caét giôùi haïn AluI trong 5 phuùt. Saûn phaåm caét ñöôïc chaïy ñieän di treân gel agarose coù ñoä noùng chaûy thaáp. Choïn nhöõng saûn phaåm caét coù kích thöôùc töø 500 bp ñeán 2000 bp, caét khoûi gel, vaø tinh cheá baèng enzyme AgarACE nhaèm phaân caét gel agarose coù ñoä noùng chaûy thaáp (caùc böôùc ñöôïc thöïc hieän theo höôùng daãn cuûa nhaø saûn xuaát). Sau khi xöû lyù baèng AgarACE, saûn phaåm caét ñöôïc loaïi boû protein baèng xöû lyù vôùi phenol-chloroform, vaø tuûa vôùi coàn laïnh. Saûn phaåm DNA sau ñoù ñöôïc hoøa tan vaøo nöôùc caát voâ truøng, vaø giöõ ôû -20oC cho ñeán khi söû duïng. - Plasmid pUC19 (2686bp, chöùa gen choïn loïc khaùng ampicillin vaø coù vuøng MCS – Multi-Cloning Site naèm trong vuøng maõ hoùa gen lacZ) ñöôïc caét vôùi enzyme SmaI [37]. - Noái DNA plasmid cuûa S. sonnei (sau khi xöû lyù vôùi AluI) vaøo plasmid pUC19 (sau khi xöû lyù vôùi SmaI) baèng enzyme T4 DNA ligase ôû 22oC trong 1 giôø. 2.4.5.2 Chuyeån vector mang gen vaøo teá baøo nhaän E. coli DH5α - Saûn phaåm noái sau ñoù ñöôïc loaïi protein baèng chloroform vaø tuûa baèng coàn laïnh ñeå loaïi boû caùc muoái. Sau ñoù saûn phaåm tuûa ñöôïc hoøa tan trong nöôùc caát voâ truøng. - Söû duïng ñieän bieán naïp ñeå chuyeån caùc vector mang gen töø S. sonnei vaøo E. coli DH5α. Thieát laäp chöông trình cho ñieän bieán naïp: hieäu ñieän theá 1800 V, cöôøng ñoä doøng ñieän 25 μF ñoái vôùi cuvette 1 cm. Ngay laäp töùc cho 1 ml dung dòch SOC (invitrogen) vaøo, vaø uû ôû 37oC trong 1 giôø. 2.4.5.3 Choïn loïc doøng mang gen khaùng ceftriaxone - Ñóa moâi tröôøng söû duïng trong choïn loïc: (1) moâi tröôøng LB raén chöùa ampicillin (100 mg/L), ñöôïc traûi 40 μl X-gal 2% tröôùc khi söû duïng (moâi tröôøng LB-Amp-X_gal); (2) LB raén chöùa ceftriaxone (6 mg/L) (moâi tröôøng LB-Cro). - 100 μl dòch khuaån trong SOC sau khi uû 1 giôø ñöôïc caáy traûi treân 2 ñóa moâi tröôøng treân. Treân moâi tröôøng (1), enzyme β-galactosidase (maõ hoùa bôûi gen lacZ) söû duïng X-gal laøm cô chaát vaø cho ra saûn phaåm chuyeån hoùa laøm teá baøo coù maøu xanh. Nhöõng teá baøo mang plasmid chöùa ñoaïn gen cheøn vaøo gen lacZ laøm baát hoaït gen, vaø teá baøo seõ coù maøu traéng. Nhöõng khuaån laïc maøu traéng sau ñoù ñöôïc caáy chuyeàn sang ñóa LB-Cro ñeå tìm khuaån laïc mang gen khaùng ceftriaxone. 2.4.6