Vật liệu và phương pháp xác định sự hoạt hóa của phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-kinase (pip5k) a và c661 trên dòng tế bào hela chuyển gene

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chương 2: Vật liệu và phương pháp  18 2.1.VẬT LIỆU 2.1.1.Dụng cụ - Thiết bị 2.1.1.1.Dụng cụ • Micropipette các loại • Đầu tip các loại • Eppendorf các loại • Ống Falcon (BD) • Đĩa petri • Ống nghiệm nhựa. • Đĩa 12 giếng • Coverslip 2.1.1.2.Thiết bị • Tủ cấy vô trùng (Nuaire) • Máy ly tâm lạnh (Hettich) • Máy đo quang phổ (Biorad) • Máy luân nhiệt (Biorad) • Máy lắc ổn nhiệt (Amerex) • Máy vortex • Máy khuấy từ • Bộ điện di DNA • Tủ ấm (Heraeus) • Tủ mát 40C • Tủ lạnh -200C • Nồi hấp vô trùng (Hirayama) • Cân phân tích (Sartorius) • Máy đo pH (Eutech) • Bể ổn nhiệt (Memmert) • Kính hiển vi huỳnh quang (Zeiss) 2.1.2.Hóa chất – Môi trường 2.1.2.1.Hóa chất ™ Hóa chất dùng cho phản ứng PCR - Polymerase PrimeSTAR (TAKARA) - dNTP 10 mM - Dung dịch đệm PrimeSTAR 5X - Cặp mồi dùng để nhân bản cDNA của KIF 2A-GD: Mồi xuôi KIF2A-01F: 5’-TACTCGAGACCATGGTAACATCTTTAAATG- 3’. Mồi ngược KIF2A-02B: 5’-CAGAATTCGGATCTGCTGTTGTTAGG-3’. - Cặp mồi dùng để nhân bản cDNA của β2-Adaptin-ear: Chương 2: Vật liệu và phương pháp  19 Mồi xuôi Adaptin_01F: 5’-AACTCGAGACCATGATAGGCATGGCACCTG GTG-3’. Mồi ngược Adaptin_02B: 5’-AAGAATTCGGGTTTTTCAAAATGCTGTCG-3’. - Mồi dùng cho giải trình tự pEGFP #F: 5’-CGCCCCATTGACGCAAATGG- 3’ ™ Thang DNA - Thang 1kb (New England Biolabs) ™ Hóa chất điện di DNA trên gel agarose - Dung dịch điện di TAE 1X - Dung dịch nạp mẫu - Agarose - Ethidium bromide (EtBr) ™ Hóa chất dùng trong phản ứng cắt hạn chế - Enzyme XhoI và EcoRI (TAKARA) - Dung dịch đệm H 10X - Dung dịch BSA 10X ™ Bộ kit dùng cho tinh sạch sản phẩm cắt (Gel M-kit) Các thành phần bộ kit: - Dung dịch làm tan gel GEX - Dung dịch rửa cột WF và WS Chương 2: Vật liệu và phương pháp  20 - Dung dich hòa DNA ™ Hóa chất dùng trong phản ứng nối - Ligation mix (TAKARA) ™ Hóa chất tạo tế bào khả nạp DH5α - Dung dịch CaCl2 100 mM (bảo quản ở 40C). ™ Hóa chất tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn - Dung dịch P1: Dung dịch Tris HCl pH 8,0 (1M) 5 ml Dung dịch EDTA 0,5M 2 ml Bổ sung thêm dH2O Đủ 100 ml Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm - Dung dịch P2: Sodium hydroxide NaOH 0,8 g SDS 1 g Bổ sung thêm dH2O Đủ 100 ml Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm - Dung dịch P3: Potacium acetate 29,4 g Acid acetic 11,5 ml Bổ sung thêm dH2O Đủ 100 ml Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm ™ Bộ kit tách chiết plasmid (Midiprep- Quiagen) Các thành phần của bộ kit bao gồm [47]: - Dung dịch RES: bổ sung RNase A vào dung dịch để đạt nồng độ cuối là 60µg/ml. Bảo quản ở 40C - Dung dịch ly giải tế bào LYS – Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Dung dịch Equilibration - Dung dịch Neutralization - Dung dịch rửa cột Wash Chương 2: Vật liệu và phương pháp  21 - Dung dịch Elution ™ Hóa chất chuyển DNA vào tế bào động vật - Lipofectamine 2000 (Invitrogen) - Poly-L-lysine (nồng độ cuối: 500 µg/ml) - PBS-4% PFA: dung dịch cố định tế bào, có nồng độ paraformaldehyde cuối cùng là 4%. - Dung dịch PBS 1X (-) có thành phần gồm: NaCl 4g Na2HPO4.12 H2O 1,45 g KCl 0,1 g KH2PO4 0,1 g Bổ sung thêm dH2O Đủ 500 ml Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm ™ Mounting medium (Vectashield): hóa chất dùng trong việc cố định lamella trên phiến kính khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, môi trường này giúp bảo vệ tín hiệu huỳnh quang trong thời gian dài. Bảo quản ở 40C [45]. 2.1.2.2.Môi trường ™ Môi trường Luria-Bertani (LB): Cân 12,5 g bột môi trường LB hòa tan trong dH2O, , thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp khử trùng ở 121oC, 1at trong 30 phút ™ Môi trường LB + kanamycin: môi trường LB thêm agar 15 g/l, bổ sung kanamycin để đạt nồng độ cuối 30 µg/ml. ™ Môi trường SOB: Bacto tryptone 5 g Yeast extract 1,25 g NaCl 0,125 g NaOH 10 N 25 µl Bổ sung thêm dH2O Đủ 250 ml Hấp khử trùng 1210C, 1 at Chương 2: Vật liệu và phương pháp  22 ™ Môi trường SOC: SOB 10 ml MgCl2 1 M 100 µl Glucose 1 M 100 µl ™ Môi trường D’MEM 10% FBS nuôi cấy tế bào HeLa và tế bào COS-7: môi trường D’MEM lỏng (Gibco) 450ml; bổ sung thêm 50ml FBS (Biowest) và 5ml penicillin G : Streptomycin (Gibco). ™ Môi trường Opti-MEM (Invitrogen): thành phần giống với môi trường D’MEM nhưng lượng huyết thanh giảm một nửa. 2.1.3.Nguyên vật liệu 2.1.3.1.Tế bào ™ Tế bào HeLa là dòng tế bào ung thư cổ tử cung, do viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ (National Institute Cancer-NCI) cung cấp, được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng tế bào HeLa clone 3 là dòng tế bào HeLa được chuyển gene ổn định mã hóa cho protein ARF6 dạng hoang dại. ™ Tế bào COS-7 là dòng tế bào, do viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ (National Institute Cancer-NCI) cung cấp, được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản. 2.1.3.2.Chủng vi sinh vật ™ Chủng Escherichia coli DH5α (F – endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi λ – recA1 gyrA96 ΔlacU169 (φ80 lacZ ΔM15)) (Promega) dùng để dòng hóa 2.1.3.3. Các plasmid sử dụng trong luận văn Chương 2: Vật liệu và phương pháp  23 Bảng 2.1. Đặc điểm các plasmid sử dụng trong luận văn Plasmid Đặc điểm Nguồn pVenus (1-173) C1- PIP5KA Gene PIP5KA được dòng hóa vào đầu C của mảnh Venus (gồm aa 1 đến aa 173) Đại học Tsukuba pVenus (155-238) C1- PIP5KA Gene PIP5KA được dòng hóa vào đầu C của mảnh Venus (gồm aa 155 đến aa 238) pVenus (1-173) C1- PIP5KC Gene PIP5KC được dòng hóa vào đầu C của mảnh Venus (gồm aa 1 đến aa 173) pVenus (155-238) C1- PIP5KC Gene PIP5KC được dòng hóa vào đầu C của mảnh Venus (gồm aa 155 đến aa238) pcDNA3-HA-ARF6 QL Gene mã hóa cho protein ARF6 QL được dòng hóa vào vector pcDNA3 pVenus (1-173) N1 – KIF2A-GD cDNA của KIF2A-GD được dòng hóa vào đầu N của mảnh Venus (gồm aa 1 đến aa 173) Trong đề tài này pVenus (155-238) N1 - KIF2A-GD cDNA của KIF2A-GD được dòng hóa vào đầu N của mảnh Venus (gồm aa 155 đến aa 238) pVenus (1-173)- β2- Adaptin-ear cDNA của KIF2A-GD được dòng hóa vào đầu N của mảnh Venus (gồm aa 1 đến aa 173) pVenus (155-238)- β2- Adaptin-ear cDNA của β2-Adaptin-ear được dòng hóa vào đầu N của mảnh Venus (gồm aa 155 đến aa 238) Chương 2: Vật liệu và phương pháp  24 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng PCR 2.2.1.1. Đặc điểm cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR Bảng 2.2. Đặc tính của cặp mồi KIF2A-01F và KIF2A-02B Đặc tính Mồi KIF2A-01F Mồi KIF2A-02B Trình tự 5’- TACTCGAGACCATG GTAACATCTTTAAA TG-3’ 5’- CAGAATTCGGATCT GCTGTTGTTAGG-3’ Chiều dài (nucleotide) 30 26 %GC 36,67 46, 15 Tm (oC) 65,3 65,6 Giá trị ΔG nhỏ nhất của cấu trúc kẹp tóc (kcal/mol) -2,04 -1,12 Giá trị ΔG nhỏ nhất của cấu trúc homodimer (kcal/mol) -14,2 -8,51 Giá trị ΔG nhỏ nhất của cấu trúc heterodimer (kcal/mol) -6,2 Kích thước sản phẩm nhân bản bằng PCR 586 bp Chương 2: Vật liệu và phương pháp  25 Bảng 2.3. Đặc tính của cặp mồi Adaptin -01F và Adaptin -02B Đặc tính Mồi Adaptin-01F Mồi Adaptin-02B Trình tự 5’- AACTCGAGACCATG ATAGGCATGGCACC TG GTG -3’ 5’- AAGAATTCGGGTTT TTCAAAATGCTGTC G -3’ Chiều dài (nucleotide) 33 29 %GC 54,5 37,9 Tm (oC) 74 67,5 Giá trị ΔG nhỏ nhất của cấu trúc kẹp tóc (kcal/mol) -4,92 -0,4 Giá trị ΔG nhỏ nhất của cấu trúc homodimer (kcal/mol) -9,96 -8,51 Giá trị ΔG nhỏ nhất của cấu trúc heterodimer (kcal/mol) -6,57 Kích thước sản phẩm nhân bản bằng PCR 733 bp 2.2.1.2. Phản ứng PCR Plasmid pCMV5-myc- Kif2a (full length) được sử dụng làm bản mẫu để nhân bản vùng hình cầu của KI2A. cDNA Kif2a được nhân bản từ cDNA của não chuột và tạo dòng vào vector pCMV5-Flag. ™ Thành phần phản ứng nhân bản cDNA của KIF2A-GD từ plasmid pCMV5- myc- Kif2a (full length) như sau: Chương 2: Vật liệu và phương pháp  26 cDNA Kif2a 1 µl dNTP 1 µl Mồi xuôi 1 µl Mồi ngược 1 µl Polymerase PrimeSTAR 0,5 µl Dung dịch đệm primeSTAR 5X 8 µl dH2O 27,5 µl Chu kì nhiệt phản ứng PCR như sau: Bước 1: 960 C trong 3 phút Bước 2: 960C trong 30 giây (lặp lại 30 lần) 630 C trong 30 giây 720 C trong 1,5 phút Bước 3: 720C trong 10 phút Sau khi tiến hành PCR, sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %. ™ Plasmid pcDNA3-flag-β2-Adaptin được sử dụng làm bản mẫu để tổng hợp vùng ear của β2-Adaptin. Tiểu phần β2-Adaptin được thu nhận bằng phương pháp PCR từ cDNA của tế bào HEK293T và sau đó dòng hóa vào vector pcDNA3-myc. Phản ứng nhân bản cDNA của β2-Adaptin-ear từ plasmid pcDNA3-flag-β2-Adaptin được tiến hành tương tự như cDNA của KIF2A-GD. 2.2.2.Tạo dòng trình tự mã hóa vùng hình cầu của protein KIF2A. 2.2.2.1.Xử lý sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và plasmid pVenus-N1 bằng enzyme XhoI và EcoRI Thiết lập phản ứng cắt sản phẩm PCR cDNA KIF2A-GD như sau: Sản phẩm PCR 20 µl Dung dịch đệm H 10X 4 µl Dung dịch BSA 10X 4 µl Chương 2: Vật liệu và phương pháp  27 Enzyme XhoI 1 µl Enzyme EcoRI 1 µl dH2O 10 µl Phản ứng cắt được tiến hành ở 370C trong 2 giờ, sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %. Thiết lập phản ứng cắt plasmid pVenus như sau: Plasmid pVenus-N1 2 µl Dung dịch đệm H 10X 4 µl Dung dịch BSA 10X 4 µl Enzyme XhoI 1 µl Enzyme EcoRI 1 µl dH2O 28 µl Phản ứng cắt được tiến hành ở 370C trong 2 giờ. Kết quả phản ứng cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %. 2.2.2.2.Tinh sạch sản phẩm cắt bằng bộ kit gel M (Viogene) [46] Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %, sau đó tiến hành tinh sạch qua gel bằng bộ kit gel M theo qui trình sau: - Cắt phần gel có chứa DNA cần tinh sạch, chuyển vào 1 eppendorf sạch. - Thêm 500 µl dung dịch làm tan gel GEX. - Ủ ở 600C trong 5 đến 10 phút cho đến khi gel tan hòa tan (đảo nhẹ eppendorf cứ mỗi 2 phút 1 lần). - Khi gel tan hoàn toàn, chờ nhiệt độ hỗn hợp gel xuống nhiệt độ phòng mới tiến hành các bước tiếp theo. - Tiến hành lắp cột Gel – M và chuyển nhẹ nhàng hỗn hợp gel trên vào cột (thể tích tối đa cho mỗi lần nạp cột là 700 µl). - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây. Loại bỏ dịch sau ly tâm. (Lặp lại 2 bước trên cho đến khi nạp hết hỗn hợp gel) Chương 2: Vật liệu và phương pháp  28 - Thêm 500 µl dung dịch rửa cột WF vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây. Loại bỏ dịch sau ly tâm. - Thêm 700 µl dung dịch WS vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch sau ly tâm - Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút để loại bỏ hết vết EtOH còn lại trong cột. - Thêm 20 µl dung dịch TE vào trong cột, để yên ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút. Dịch thu được sau ly tâm chứa DNA mong muốn. (Tất cả các qui trình trên được tiến hành ở nhiệt độ phòng). 2.2.2.3.Thiết lập phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp. Thành phẩn phản ứng nối bao gồm: Sản phẩm cắt plasmid pVenus 0,5 µl Sản phẩm cắt cDNA của KIF2A-GD 2,5 µl Ligation mix 3 µl Phản ứng nối được thực hiện ở 160C qua đêm. 2.2.2.4.Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α. ™ Tạo tế bào khả nạp DH5α. - Cấy chuyền các tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB. Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC. - Cấy 500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC trong 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 trong khoảng 0,3 - 0,6. - Tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào ở vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. - Hòa sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trên nước đá 30 phút - Ly tâm thu sinh khối tế bào với vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Chương 2: Vật liệu và phương pháp  29 - Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Giữ tế bào khả nạp trên đá nhằm chuẩn bị cho bước biến nạp. - Nếu chưa sử dụng, bảo quản tế bào khả nạp ở -800C ™ Biến nạp phản ứng nối vào tế bào E.coli DH5α - Cho 5 µl phản ứng nối vào 50 µl tế bào khả nạp DH5α. - Ủ hỗn hợp trên đá trong 20 phút. - Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút. - Chuyển sang ủ trên đá trong 1 phút. - Bổ sung 250 µl môi trường SOC và nuôi hoạt hóa ở 370C ít nhất 30 phút. - Trải dịch huyền phù vi khuẩn trên môi trường LB thạch có bổ sung Ampicilin và X-gal. - Ủ ở 370C, qua đêm. 2.2.2.5. Thu nhận dòng tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp pVenus-KIF2A- GD ™ Sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp: Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp mọc được trên môi trường LB có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml) vì plasmid pVenus có mang gene kháng Kanamycin. ™ Tách chiết plasmid từ những khuẩn lạc được dự đoán mang vector tái tổ hợp: - Nuôi cấy lắc những khuẩn lạc trắng trong 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml) ở 370C, 200 rpm, qua đêm. - Ly tâm dịch huyền phù vi khuẩn 6000 vòng/phút, trong 10 phút, ở 40C. Loại bỏ dịch nổi. - Huyền phù cặn trong 300 µl dung dịch P1. Có thể sử dụng máy lắc rung ở bước này. - Thêm 300 µl dung dịch P2, đảo nhẹ eppendorf. - Thêm 300 µl dung dịch P3, đảo nhẹ eppendorf. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Chương 2: Vật liệu và phương pháp  30 - Thu lấy dịch nổi, chuyển sang eppendorf mới. Thêm 560 µl dung dịch Isopropanol. Vortex nhẹ. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Hút bỏ dịch nổi. - Thêm 500 µl dung dịch Ethanol 70% để rửa tủa. Vortex nhẹ. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa. Để khô ở nhiệt độ phòng. - Hòa tủa trong 50 µl dung dịch nước cất 2 lần (có bổ sung thêm 1 µl enzyme Rnase nồng độ 10 mg/ml). - Bảo quản dung dịch DNA ở -200C. ™ Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pVenus-KIF2A-GD với cặp enzyme EcoRI/XhoI - Phản ứng cắt plasmid bao gồm các thành phần sau: Plasmid tái tổ hợp 2 µl Dung dịch đệm H 10X 1 µl EcoRI 0.5 µl XhoI 0.5 µl Dung dịch BSA 10X 1 µl dH2O 5 µl - Ủ phản ứng ở 370C, trong 2 giờ. - Kiểm tra phản ứng cắt bằng điện di trên gel agarose 1 % ™ Giải trình tự kiểm tra bằng mồi xuôi pEGFP #F trên plasmid. - Thành phần phản ứng PCR để thực hiện giải trình tự plasmid tái tổ hợp: Plasmid tái tổ hợp 1 µl Mồi pEGFP #F (10 µM) 1 µl Dung dịch đệm 5X 4 µl Enzyme BigDye Terminater 1 µl dH2O 13 µl Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR như sau: 960C Trong 30 giây 500C Trong 5 giây 600C Trong 4 phút Chương 2: Vật liệu và phương pháp  31 (Lặp lại 30 chu kì) - Chuyển sản phẩm PCR sang eppendorf 1,5 ml mới. Tiến hành tủa sản phẩm PCR bằng EtOH tuyệt đối lạnh trong sự hiện diện của muối NaCl: Sản phẩm PCR 25 µl Dung dịch NaCl 5M 1 µl Dung dịch EtOH tuyệt đối 50 µl - Vortex để trộn đều. Để hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút, ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dịch nổi. - Thêm 500 µl dung dịch EtOH 70% để rửa tủa. - Ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút, ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dịch nổi. - Làm khô cặn tủa ở nhiệt độ phòng. - Thêm 20 µl dung dịch HiDi formamide, huyền phù hòa tan tủa. - Ủ dung dịch ở 950C trong 5 phút. Nhanh chóng chuyển sang đá và ủ trong 4 phút. - Chuyển dung dịch sang ống dùng trong máy giải trình tự. Việc giải trình tự được thực hiện bằng máy AB Disk Sequencer. 2.2.3. Tạo dòng trình tự mã hóa vùng ear của protein β2-Adaptin-ear Qui trình tạo dòng mã hóa protein β2-Adaptin-ear gồm các bước như sau: Xử lí sản phẩm PCR và plasmid pVenus bằng cặp enzyme XhoI/EcoRI; thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp; sàng lọc plasmid mang trình tự mục tiêu trên môi trường LB có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml); tiến hành phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp và giải trình tự (tương tự mục 2.2.2). 2.2.4. Tách chiết lượng lớn plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit Midiprep (Quiagen) ™ Các plasmid tái tổ hợp thu được bao gồm: pVenus (1-173)-KIF2A-GD. pVenus (155-238)-KIF2A-GD. pVenus (1-173)-β2 Adaptin-ear pVenus (155-238)- β2 Adaptin-ear ™ Qui trình tách chiết theo hướng dẫn của bộ kit [47]: Chương 2: Vật liệu và phương pháp  32 - Nuôi cấy lắc khuẩn lạc trong 100 ml LB lỏng có bổ sung 100 µl Kanamycin nồng độ 50 mg/ml ở 370C, qua đêm. - Ly tâm dịch huyền phù vi khuẩn 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Loại bỏ dịch nổi. - Huyền phù cặn trong 8 ml dung dịch RES (đã bổ sung Rnase A). - Thêm 8 ml dung dịch ly giải tế bào LYS, đảo ống 5 lần. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Trong thời gian đó, tiến hành làm ướt cột bằng cách thêm 12 ml dung dịch EQU chảy dọc theo rìa cột. - Thêm 8 ml dung dịch NEU vào dịch ly giải tế bào. Đảo ống 10-15 lần. Không sử dụng vortex ở bước này. Chuyển hỗn hợp này vào cột. - Thêm 5 ml dung dịch EQU chảy dọc theo rìa cột để làm thấm cột và rửa phần dịch tế bào ở trong cột. - Sau khi hỗn hợp này chảy qua cột hết, bỏ phần giấy lọc trong cột. Thêm 8 ml dung dịch WASH để rửa cột. - Thêm 5 ml dung dịch ELU để hòa tan DNA trong cột. - Thêm 3,5 ml dung dịch Isopropanol vào dung dịch chứa DNA để tủa. Vortex kỹ. Để yên hỗn hợp này ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm với tốc độ tối đa trong 30 phút, ở 40C. Loại bỏ dịch nổi. - Rửa phần tủa trong 2 ml dung dịch Ethanol 70%. Ly tâm tốc độ tối đa trong 5 phút, ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi. - Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. - Hòa tan tủa trong dung dịch TE. Dung dịch thu được có chứa plasmid tái tổ hợp mong muốn. - Bảo quản DNA ở -200C. 2.2.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật. 2.2.5.1. Phương pháp cấy chuyền tế bào. - Kiểm tra chất lượng tế bào và sự ngoại nhiễm ở đĩa nuôi cấy bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược. Chương 2: Vật liệu và phương pháp  33 - Đổ bỏ nhẹ nhàng môi trường trong đĩa nuôi cấy và nhẹ nhàng rửa lớp tế bào bám ở đáy bình Roux 2 lần bằng PBS (-) 1X (3 ml PBS/1 lần). - Thêm 2 ml hỗn hợp Trypsin/EDTA vào bình Roux. Ủ đĩa tế bào ở 370C trong 1-5 phút. - Quan sát đĩa tế bào dưới kính hiển vi soi ngược cho đến khi thấy tế bào bắt đầu mất tính bám, có kiểu hình tròn. - Loại bỏ nhanh hỗn hợp Trypsin/EDTA, vỗ nhẹ bình. - Cho nhanh 1ml môi trường vào bình Roux để ức chế hoạt động của Trypsin. Dùng pipette Pasteur 1ml đã vô trùng hút sục nhiều lần để huyền phù đều tế bào trong bình nuôi cấy. - Cấy dịch huyền phù tế bào sang các bình Roux mới có chứa 5 ml môi trường. Từ một bình nuôi mọc đầy tế bào có thể cấy sang 3, 4 bình nuôi mới. - Đặt các bình nuôi vừa cấy vào tủ ấm CO2, sau 24 giờ hút bỏ môi trường cũ trong bình nuôi và cho môi trường mới vào để loại bỏ các tế bào chết trong quá trình cấy chuyền và trypsin còn lại trong môi trường. - Tế bào được cấy chuyền sau 3-5 ngày nuôi cấy. 2.2.5.2. Bảo quản tế bào nuôi cấy - Có thể duy trì nguồn tế bào sống trong một thời gian dài ở nhiệt độ thấp bằng cách thêm vào những chất bảo quản như dimethyl sulphoxide (DMSO) vào môi trường. Điểm quan trọng của phương pháp này là đông lạnh tế bào chậm, giữ chúng ở nhiệt độ dưới -700C khi đông lạnh và giải đông chúng đột ngột. Phương pháp này được thực hiện như sau: G Đông lạnh : - Chỉ sử dụng những tế bào khỏe mạnh để bảo quản. - Tách tế bào bằng trypsin-EDTA như mô tả ở trên. Sử dụng những bình nuôi cấy có mật độ tế bào 4.106 tế bào/ml. - Huyền phù tế bào vào môi trường, ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút. Chương 2: Vật liệu và phương pháp  34 - Loại bỏ dịch nổi và hòa tế bào vào môi trường có 10% DMSO. Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu và điều chỉnh sao cho mật độ đạt 4-8.106 tế bào/ml môi trường có DMSO. - Cho dịch tế bào vào các ống bảo quản 2 ml có thể chịu đựng được nhiệt độ trong nitơ lỏng. - Đông lạnh tế bào từ từ. Nhiệt độ giảm xuống 10C/ phút bằng cách đặt tế bào trong hộp polystyrene vách dầy khoảng 15 mm có lót bông gòn bên trong và cho vào tủ lạnh -700C qua đêm. - Cho tế bào vào bình nitơ lỏng có thể giữ được khả năng sống của tế bào trong vài năm. Nếu bảo quản ở điều kiện -800C thì có thể giữ tế bào từ 6 đến 12 tháng. G Giải đông : - Chuyển tế bào từ bình nitơ lỏng hay tủ đông -800C lập tức vào lọ nước