Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc

TCNCYH 115 (6) - 2018 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 18/9/2018 Ngày được chấp thuận: 11/10/2018 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN MỘT SỐ EXON TRỌNG ĐIỂM CỦA GEN RB1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÕNG MẠC Vũ Đức Anh1, Trần Huy Thịnh1, Phạm Trọng Văn1,2, Phạm Hồng Vân2, Tạ Thành Văn1, Trần Vân Khánh1 1Trường Đại học Y Hà Nội; 2Bệnh viện Mắt Trung ương Ung thư võng mạc là một trong những khối u ác tính thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, bệnh gây nên do đột biến gen RB1 làm mất hoặc giảm chức năng của protein RB1. Ở nước đang phát triển như Việt Nam, phần lớn các trường hợp đều phát hiện muộn và trẻ thường phải khoét bỏ nhãn cầu, thậm chí đe dọa tính mạng của trẻ. Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon 10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để xác định đột biến điểm trên exon 10, 14 và 20. 5/49 (10,2%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, trong đó 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trên exon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14, và 1 bệnh nhân phát hiện 2 đột biến: p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14. Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 trên exon 10. Tất cả các đột biến đều là đột biến dị hợp và là đột biến chưa từng được công bố. Từ khóa: Ung thư võng mạc, gen RB1, đột biến gen I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư võng mạc là một bệnh lý ác tính thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, với tần suất thường gặp từ 1/15.000- 1/18.000 trẻ được sinh ra, bệnh liên quan tới đột biến ở gen RB1 [1 - 3]. Đột biến gây bệnh trên gen RB1 làm giảm hoặc thậm chí mất chức năng của protein pRB, từ đó dẫn tới mất kiểm soát quá trình nhân lên của tế bào, dẫn tới mất khả năng kiểm soát phân bào và hình thành khối u tại võng mạc [4]. Các nghiên cứu đã công bố có trên 900 đột biến gen RB1 là cơ sở dữ liệu quan trọng cho tư vấn di truyền và cho biết đặc điểm giữa mối quan hệ kiểu gen và kiểu hình của bệnh. Gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và tập trung tại 16 điểm bao gồm 12 đột biến vô nghĩa (nonsense), 02 đột biến sai nghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing). Những đột biến còn lại nằm rải rác dọc gen RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon 9, 10, 14, 17, 18, 20 và 23 [2 - 6]. Việc phát hiện ra đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc phát triển và triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, đồng thời quản lý tốt những người mang gen nhằm giảm tỷ lệ biến chứng và tỷ lệ tử vong ở trẻ [7 - 9]. Ung thư võng mạc là một bệnh lý hiếm gặp, tuy nhiên số lượng bệnh nhân tới khám và điều trị tại Bệnh viện Mắt Trung ương ngày càng tăng. Năm 2005 chỉ có 14 bệnh nhân được phát hiện và chẩn đoán trong vòng 1 năm, tuy nhiên tới năm 2013 con số đó đã tăng lên 52 trẻ tới khám và điều trị [10]. 2 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến ung thư võng mạc còn rất ít, chủ yếu là các nghiên cứu về lĩnh vực lâm sàng nên các nghiên cứu về gen liên quan tới ung thư võng mạc còn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 49 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư võng mạc tại Bệnh viện Mắt Trung ương dựa trên lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh hoặc có kết quả giải phẫu bệnh là ung thư võng mạc, bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu. 2. Phương pháp - Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA. - Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần bằng phenol-chloroform-isopropanol (25:24:1). - Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để khuếch đại exon 10, 14 và 20 của gen RB1 với 3 cặp mồi được thiết kế. - Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20µl) gồm: nước cất PCR 11,9 µl; buffer 10X 2,0 µl; 2,5 mM dNTP, 0,5 µM mồi xuôi và ngược, 0,5U Taq polymerase, 3,0µl DNA. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/30 giây, 55oC/30 giây, 72oC/30 giây], 72oC/5 phút. Bảo quản mẫu ở 10oC. Kỹ thuật giải trình tự gen: các sản phẩm PCR sẽ được tiến hành giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI. Trình tự được so sánh trên ngân hàng gen: DNA (NG_009009.1) bằng phần mềm CLC. 3. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân và gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia. Bệnh nhân và gia đình được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả xác định khuếch đại exon 10, 14 và 20 của gen RB1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 10, 14 và 20 của gen RB1 để khuếch đại DNA sau tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Hình 1 là hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 10 của gen RB1. Sản phẩm PCR thu được chỉ có 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 291 bp không có sản phẩm phụ. Sản phẩm khuếch đại PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theo để phát hiện đột biến điểm (hình 1). TCNCYH 115 (6) - 2018 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 của gen RB1 (+) mẫu đối chứng dương; (-) mẫu chứng âm; (1-9) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker (100bp). 2. Kết quả xác định đột biến gen RB1 Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để xác định đột biến. Kết quả cho thấy 5/49 (10,2%) bệnh nhân phát hiện đột biến, trong đó 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trên exon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14 và 1 bệnh nhân khác phát hiện 2 đột biến p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14. Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 trên exon 10. Bảng 1. Kết quả xác định đột biến trên 3 exon 10, 14, 20 gen RB1 MK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) (-) 291 bp Mã bệnh nhân Đột biến Thay đổi protein Thể đột biến Exon Loại đột biến Chú thích RB29 c.2041 G > T p.Trp680Cys Dị hợp 20 Missense New RB53 c.1357 A > T p.Tyr452Phe Dị hợp 14 Missense New RB57 c.1357 A > T c.1366 T > A p.Tyr452Phe p.Val455Glu Dị hợp Dị hợp 14 14 Missense Missense New New RB68 c.2077_2079 AAC > TTA p.Glu692Val_ Leu693Ile Dị hợp 20 Missense New RB79 c.1033delCT p.Thr345Arg frameshift X6 Dị hợp 10 Deletion New Missense: đột biến sai nghĩa; Deletion: đột biến mất nucleotid; New: đột biến mới chưa được công bố. 4 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 2. Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 của bệnh nhân mã số RB57 Kết quả trên cho thấy bệnh nhân RB57 phát hiện 02 đột biến dị hợp tử trên cùng exon 14. Cả 02 đột biến này đều là dạng đột biến sai nghĩa. Đột biến tại vị trí c.1357 A > T làm biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành Phenylalanin, đột biến tại vị trí c.1366 T > A làm thay đổi acid amin Valin vị trí 455 thành Glutamat. Hình 3. Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 của bệnh nhân mã số RB79 Giải trình tự phát hiện bệnh nhân RB79 có đột biến mất đoạn c.1033delCT làm mất 2 nucleotid C và T. Đột biến tại vị trí này làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau 6 codon kế tiếp. c.1357A c.1357A > T p.Tyr452Phe Người bình thường Bệnh nhân RB57 c.1366T c.1366T > A p.Val455Glu Người bình thường Bệnh nhân RB57 Người bình thường Bệnh nhân RB79 c.1033 C c.1033del CT p.Thr345ArgframeshiftX6 IV. BÀN LUẬN Ung thư võng mạc là một bênh lý di truyền hiếm gặp, bệnh thường để lại nhiều biến chứng về mắt, phần lớn các trường hợp được phát hiện muộn, khi bệnh đã lan rộng hay di căn, phải loại bỏ nhãn cầu, nạo vét hốc mắt, làm mất thị lực và đe dọa đến tính mạng của trẻ. Đa phần các bệnh nhân đều đến khám TCNCYH 115 (6) - 2018 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC muộn với tình trạng biến chứng phải khoét bỏ nhãn cầu và tiên lượng tử vong cao gây hậu quả nặng nề cho gia đình và xã hội. Việc phát hiện ra đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc phát triển và triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, đồng thời quản lý tốt những người mang gen bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa và thương tật ở trẻ. Các nghiên cứu về các đột biến gene cũng đã và đang được tiến hành, cung cấp những thông tin dữ liệu cho ngân hàng gene RB1 ( và công bố có trên 900 đột biến gen RB1 là cơ sở dữ liệu quan trọng cho tư vấn di truyền và cho biết đặc điểm giữa mối quan hệ kiểu gen và kiểu hình của bệnh. Gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và tập trung tại 16 điểm bao gồm 12 đột biến vô nghĩa (nonsense), 02 đột biến sai nghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing). Những đột biến còn lại nằm rải rác dọc gen RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon 9, 10, 14, 17, 18, 20 và 23 [2; 3]. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên 3 trong số các exon có tỷ lệ gặp đột biến cao để xác định đột biến là exon 10, 14, 20. Tỷ lệ phát hiện đột biến trong nghiên cứu của chúng tôi trên 3 exon (exon 10, 14, 20) chiếm 10,2% (5/49) tương đồng với nghiên cứu tại Trung Quốc (8,2%, n = 85), hay nghiên cứu tại Tây Ban Nha, Colombia, Cuba (10,3%, n =107), tuy nhiên thấp hơn so với nghiên cứu tại Singapore năm 2017 là 23,7% (n = 59), có sự khác nhau đó có thể do sự khác biệt về địa lý và chủng tộc [11 - 13]. Hình 4. Phân bố đột biến phát hiện được ở 49 bệnh nhân trên toàn bộ 27 exon gen RB1 Nghiên cứu phát hiện một đột biến mất đoạn c.1033delCT dẫn tới lệch toàn bộ trình tự khung sau đột biến tại exon 10. Đột biến tại vị trí này làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau 6 codon kế tiếp. Đột biến điểm gây tạo mã kết thúc này xảy ra ngay tại vùng N-terminal, từ đó không thể tiếp tục dịch mã tạo thành các vùng có chức năng quan trọng của protein pRB. Tuy chưa tiến hành được các thử nghiệm RNA hay invivo để xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến tới khả năng gây bệnh, nhưng rất có thể đột biến c.1033delCT là đột biến tiềm năng gây ung thư võng mạc ở bệnh nhân RB79. Các đột biến còn lại chủ yếu là đột biến sai nghĩa (missense) chiếm tỷ lệ 5/6 (83,3%), trong đó có 03 đột biến dị hợp tử trên cùng exon 14. Đột biến tại vị trí c.1357 A > T làm biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành Phenylalanin gặp ở 2 bệnh nhân, 2 acid amin này đều thuộc nhóm acid amin chưa gốc nhân thơm, sự ảnh hưởng có thể không rõ và cần phải kiểm chứng thêm. Còn đột biến tại vị trí 6 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC c.1366 T > A làm thay đổi acid amin vị trí 455 Valin (không phân cực, kỵ nước) thành Glutamat (phân cực, tích điện âm). Sự thay đổi này có thể ảnh hưởng tới đặc tính của chuỗi protein, dẫn đến mất khả năng tương tác của vùng A domain và protein LXCXE, giống như một số thay đổi tương tự đã được công bố trước đó [11; 12]. Tương tự đột biến c.2041 G > T trên exon 20 ở bệnh nhân RB29 thay làm thay đổi bộ ba mã hóa cho acid amin Tryptophan (chứa nhân thơm) tại vị trí 680 trở thành bộ ba Cystein (phân cực, không tích điện) và đột biến trên exon 20 c.2077 - 2079 AAC > TTA làm thay đổi 2 acid amin liền kề: Glutamat (tích điện âm) thành Valin (không phân cực, kỵ nước) và Leucin thành Isoleucin (cùng nhóm) tại vị trí 692 và 693 tương ứng cũng có thể làm thay đổi sự tương tác của vùng B domain với protein LXCXE. Tuy nhiên nghiên cứu mới là bước đầu xác định đột biến trên ba exon, vẫn rất cần các thử nghiệm sâu hơn để xác định được chính xác mức độ gây bệnh của từng đột biến và cần thêm những nghiên cứu trên toàn bộ các exon còn lại với cỡ mẫu lớn hơn, từ đó có thể mở rộng tìm đột biến trên các thành viên gia đình của các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến. Đó cũng là điều kiện thuận lợi cho các tư vấn di truyền sau này. V. KẾT LUẬN Đã phát hiện 5/49 (10,2%) bệnh nhân được phát hiện có đột biến. Tất cả các đột biến đều là đột biến dị hợp và là đột biến chưa được công bố. Đặc biệt đã phát hiện được đột biến c.1033delCT (p.Thr345Arg frameshift X6) trên exon 10 làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) và đột biến c.2077- 2079 AAC>TTA trên exon 20 làm thay đổi 2 acid amin liền kề Glutamat thành Valin và Leucin thành Isoleucin tại vị trí 692 và 693 tương ứng. Lời cảm ơn Nghiên cứu được hỗ trợ với kinh phí của đề tài khoa học cấp Bộ Y tế ”Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư võng mạc và xác định yếu tố di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử” và sự giúp đỡ của cán bộ Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bishop JO, Madson EC (1975). Retino- blastoma: Review of the current status. Surv Ophthalmol, 19, 342 ‑ 66. 2. Mallipatna A, Marino M, Singh AD (2016). Genetics of Retinoblastoma. Asia Pac J Ophthalmol (Phila), 5(4), 260 - 264 3. Jose R.V (2005). RB1 gene mutation up -date, a meta-analysis based on 932 reported mutations available in a searchable database, BMC Genetics, 6, 53. 4. Sugano K, Yoshida T, Izumi H et al (2004). Outpatient clinic for genetic counseling and gene testing of retinoblastoma. Int J Clin Oncol. 9, 25 - 30. 5. Lohmann D.R, Brandt B, Hopping W et al (1996). The spectrum of RB1 germ-line mutations in hereditary retinoblastoma. Am J Hum Genet, 58, 940 - 949. 6. Alonso J, Frayle H, Menéndez I et al (2005). Indentification of 26 new constititional RB1 gene mutationsin Spanish, Colombian, and Cuban retinoblastoma patients. Hum Mu- tat, 25, 99. 7. Pradhan MA, Ng Y, Strickland A et al (2010). Role of genetic testing in retinoblasto- ma management at a tertiary referral centre. Clin Experiment Ophthalmol, 38, 231 - 236. TCNCYH 115 (6) - 2018 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 8. Sampieri K, Hadjistilianou T, Mari F et al (2006). Mutational screening of the RB1 gene in Italian patients with retinoblastoma reveals 11 novel mutations. J Hum Genet, 51, 209 - 216. 9. Rushlow D, Piovesan B, Zhang K et al (2009). Detection of mosaic RB1 mutations in families with retinoblastoma. Hum Mutat. 30, 842 - 851. 10. Nguyễn Ngân Hà, Phạm Trọng Văn, Phạm Thị Minh Châu và cộng sự (2016). Dịch tễ học lâm sàng u nguyên bào võng mạc ở miền bắc Việt Nam (2004 - 2013). Tạp chí Nghiên cứu y học, 102(4), 129 - 136. 11. Ming-yan He, Yu An, Yi-jin Gao et al (2013). Screening of RB1 gene mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype– phenotype correlations. Molecular Vision. 20, 545 - 552. 12. Alonso J, Frayle H, Menéndez I et al (2005). Identification of 26 New Constitutional RB1 Gene Mutations in Spanish, Colombian, and Cuban Retinoblastoma Patients. Hum Mutat, 25(1), 99. 13. Swati T, Raman S, Gangadhara S et al (2017). Mutation spectrum of RB1 muta- tions in retinoblastoma cases from Singapore with implications for genetic management and counselling. PLoS ONE. 12(6), e0178776. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178776. Summary MUTATION ANALYSIS IN KEY REGION OF RB1 GENE IN PATIENTS WITH RETINOBLASTOMA Retinoblastomas are one of the most common intraocular malignant tumors in infants and young children. They are caused by a mutation in the RB1 gene that results in the loss or deacti- vation of the RB1 protein. In developing countries like Vietnam, most cases are diagnosed in later stages that are life-threatening, requiring enucleation. Detection of RB1 mutations in patients with retinoblastoma is an important for identifying healthy carriers and conducting prenatal diagnosis to reduce mortality and blindness in children. Mutations in the RB1 are often point mutations and are common in some key exons including 10, 14, 20. The study was conducted with the purpose of identifying RB1 mutations on exon 10, 14, 20. This study is composed of 49 patients with retino- blastomas Mutations in exon 10, 14 and 20 of the RB1 gene were identified by direct sequencing. Different mutations were found in 5/49 (10.2%) patients. One patient was detected with mutation p.Trp680Cys and a second patient with p.Glu692Val_Leu693Ile mutation on exon 20. A third patient was detected with p.Tyr452Phe mutation on exon 14 and a fourth patient was detected with 2 mutations: p.Tyr452Phe and p.Val455Glu on exon 14. The fifth patient was detected with mutant p.Thr345Arg frameshift X6 on exon 10. All mutations were mutant heterologous. These findings are novel and have not been reported in prior publications . Keywords: Retinoblastoma, RB1 gene, mutation