Xác định gen kháng ceftriaxone ở vi khuẩn shigella sonnei phân lập từ các mẫu bệnh phẩm

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại [2, 10, 21, 24, 35, 36] Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn Gram âm gây bệnh, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1896 bởi Kiyoshi Shiga, nhà vi sinh vật học người Nhật. Shigella được chia làm 4 loài dựa trên thành phần kháng nguyên O của lớp lipopolysaccharide trên màng ngoài của vi khuẩn: Shigella dysenteriae (nhóm huyết thanh A), Shigella flexneri (nhóm huyết thanh B), Shigella boydii (nhóm huyết thanh C) và Shigella sonnei (nhóm huyết thanh D). Tất cả các loài Shigella (ngoại trừ nhóm huyết thanh D) đều chứa nhiều týp huyết thanh, trong đó nhóm B được chia làm nhiều týp phụ khác nhau. Shigella dysenteriae gồm 15 týp huyết thanh, được đánh số từ 1 đến 15. Xét về mặt huyết thanh học, Shigella flexneri là loài phức tạp nhất. Tuy S. flexneri chỉ gồm 6 týp huyết thanh (đánh số từ 1 đến 6) nhưng được chia làm 11 týp huyết thanh phụ 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, và 6. S. boydii là loài lớn nhất với 20 týp huyết thanh (đánh số từ 1 đến 20) được biết cho đến ngày hôm nay. Bảng 1.1 Danh pháp giống Shigella Loài Nhóm huyết thanh Týp huyết thanh S. dysenteriae A 1 – 15 S. flexneri S. boydii S. sonnei B C D 1 – 6 (týp 1-5 chứa týp phụ a và b) 1 – 20 Không có Hiện nay do sự nhiễm S. flexneri và S. sonnei ngày càng phổ biến nên ngoài huyết thanh học còn nhiều phương pháp khác được sử dụng để phân loại sâu hơn các chủng này. Các phương pháp được sử dụng gồm phage typing, plasmid fingerprinting, ribotyping, điện di đảo chiều PFGE, PCR và phân tích plasmid. 1.2 Hình thái, cấu trúc và một số đặc điểm sinh hóa [2, 10, 15, 21, 24, 35, 36] Shigella spp. là trực khuẩn đường ruột Gram âm, không di động, không tạo bào tử, kỵ khí tùy ý, lưu trú chính trong hệ tiêu hóa ở người. Vi khuẩn này có thể tồn tại được ở nhiệt độ trong khoảng từ 7oC đến 46oC, trong đó nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn tăng trưởng là ở 37oC. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hóa khắc nghiệt như trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trường chứa 5% NaCl, hay trong môi trường có độ pH 4,5. Shigella nhạy với nhiệt, và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng phương pháp khử trùng Pasteur. Shigella không có roi, vì vậy chúng thường thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ. Trong quá trình gây bệnh, Shigella hầu như tồn tại bên trong tế bào, và rất linh động nhờ vào cơ chế polymer hóa sợi actin. Cũng như các vi khuẩn Gram âm khác, màng của Shigella được bao phủ bởi lipopolysaccharide (LPS). LPS đóng vai trò rất quan trọng trong độc lực của vi khuẩn như thành phần lipid A của LPS tạo nên nội độc tố; polysaccharide kháng nguyên O và polysaccharide lõi giúp vi khuẩn kháng lại cơ chế phòng thủ của cơ thể như opsonin hóa, thực bào [15]. Các Shigella đều lên men glucose, không sinh hơi (trừ S. flexneri týp huyết thanh 6), không sinh H2S, không sử dụng nitrat và không lên men lactose, trừ S. sonnei lên men lactose chậm sau 2 ngày. Nhóm huyết thanh A, B và C có các đặc tính sinh lý học rất giống nhau, trong khi S. sonnei khác với các nhóm huyết thanh khác do có các phản ứng sinh hóa β-D-galactosidase và ornithine decarboxylase dương tính. Hình 1.1. Shigella spp. 1.3 Tình hình nhiễm Shigella trên thế giới và ở Việt Nam 1.3.1 Tình hình nhiễm Shigella trên thế giới [10, 21] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm trên thế giới có khoảng 165 triệu ca nhiễm Shigella. Trong đó, ở những nước đang phát triển, tỷ lệ nhiễm chiếm đến 99% (69% là trẻ em dưới 5 tuổi) và có 1,1 triệu ca tử vong do nhiễm Shigella hằng năm (60% trong số đó là trẻ em dưới 5 tuổi). Người ta nhận thấy có sự thay đổi týp huyết thanh giữa các loài cũng như thay đổi về loài gây bệnh phổ biến ở từng giai đoạn. Đầu tiên, S. dysenteriae týp 1 là loài gây bệnh phổ biến, sau đó dần được thay thế bởi S. flexneri, và cuối cùng chuyển dần sang S. sonnei. Có sự khác biệt giữa loài Shigella thường gặp ở những nước phát triển và những nước đang phát triển. Ơû những nước phát triển, loài Shigella gây bệnh thường gặp là S. sonnei (chiếm 77%) và S. flexneri (chiếm 16%). Trong khi đó, ở những nước đang phát triển S. flexneri thường gặp nhất (chiếm 60% tổng số ca nhiễm), tiếp sau là S. sonnei (chiếm 15%). Ở loài S. flexneri, týp 2a chiếm từ 32% - 58%, týp 1b gây ra 12% - 13%, và týp 3a gây ra 4 – 11% tổng số ca nhiễm ở những nước đang phát triển. S. dysenteria thường được tìm thấy ở vùng Nam Á và châu Phi, trong đó týp 1 phổ biến ở Ấn Độ, Nigeria và Singapore, týp 2 phổ biến ở Guatamala, Hungary và Yemen. S. boydii là Shigella được phát hiện đầu tiên ở Ấn Độ, và không phổ biến lắm, chủ yếu gây bệnh ở vùng tiểu lục địa Ấn, trong đóS. boydii týp 2 là S. boydii gây bệnh phổ biến ở những nước đang phát triển. 1.3.2 Tình hình nhiễm Shigella ở Việt Nam [1, 16] Ở Việt Nam, số ca nhiễm Shigella rất cao, hơn hẳn bệnh gây ra bởi Salmonella typhi và Vibrio choleraeri. Trong nghiên cứu của Kelly Hope và công sự, từ năm 1991 đến năm 2001, Việt Nam có khoảng 435.000 ca nhiễm Shigella (khoảng 39.500 ca nhiễm hằng năm). Số ca nhiễm hằng năm trên 100.000 dân cao nhất ở vùng cao nguyên Trung Bộ (241,7 ca), kế đến là vùng bờ biển Nam Trung Bộ (100,2 ca) và thấp nhất là vùng đồng bằng sông Hồng (hình 1.2). Nghiên cứu cũng cho thấy lượng mưa nhiều và tình trạng nghèo đói là những nguy cơ quan trọng trong nhiễm Shigella. Hình 1.2 Tỷ lệ nhiễm Shigella trung bình hằng năm trên 100.000 dân [16] Nhìn chung ở Việt Nam, loài Shigella gây bệnh phổ biến là S. flexneri và S. sonnei. Vào đầu những năm 90, tại thành phố Hồ Chí Minh, trong các nhóm Shigella gây bệnh, S. flexneri là loài có tỷ lệ gây bệnh cao nhất (72,58%), kế đến Kilômet là S. sonnei (23,87%). Vào năm 1997, tình hình nhiễm Shigella cũng tương tự, với S. flexneri là loài gây bệnh phổ biến nhất (69,59%), và kế đến là Shigella sonnei (13,40%). Tuy nhiên, hiện nay tình hình gây bệnh của các nhóm Shigella có sự thay đổi. Từ năm 2000 đến năm 2002 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, tỷ lệ các mẫu phân lập cho kết quả S. flexneri và S. sonnei là tương đương nhau (45,6%). Từ năm 2006 đến năm 2008, trong 113 mẫu Shigella phân lập được từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, Shigella sonnei chiếm đến 70,8%, còn S. flexneri chỉ chiếm 27,4% (Hà Vinh và cộng sự, số liệu chưa công bố) (bảng 1.2). Bảng 1.2 Tỷ lệ S. flexneri và S. sonnei phân lập qua các năm [1] Shigella spp. 1990 1997 2000-2002 2006-2008 S. flexneri 72,58% 69,59% 45,60% 27,40% S. sonnei 23,87% 13,40% 45,60% 70,80% Số lượng S. boydii (17%) phân lập từ năm 1991 đến năm 2001 dọc theo vùng sông Hồng cao hơn nhiều so với các thập kỷ trước (3%). Bên cạnh đó, týp huyết thanh của S. flexneri gây bệnh phổ biến cũng có sự thay đổi. Những năm 1960, týp huyết thanh phân lập được gồm týp 2 (66%), týp 3 (16%), týp (10%) và týp 4 (5%), trong khi hiện nay, các týp phân lập được gồm týp 6 (17%), týp 1 (13), týp 4 (10), biến thể Y (9%), và 40% các mẫu S. flexneri phân lập không thể định týp huyết thanh nếu chỉ dựa vào những bộ kít thương mại. Điều này cho thấy rằng Shigella đang dần xuất hiện những biến thể khác, chúng có thể phát triển mạnh ở nhiều điều kiện môi trường và tập quán ăn uống khác nhau trong những thời điểm khác nhau. Điều này, cùng với ngày càng nhiều Shigella kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị Shigella trở nên khó khăn hơn, cũng như khó sử dụng loại vắc-xin đặc hiệu cho từng týp huyết thanh của Shigella. 1.4 Sự lây nhiễm và con đường lan truyền bệnh [2, 10, 14, 21, 24] Hơn 100 năm sau phát hiện của nhà khoa học người Nhật Shiga, bệnh lỵ trực trùng (shigellosis) vẫn còn là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng. Vì bệnh lây qua đường tiếp xúc phân miệng vàShigella có thể gây bệnh với liều lượng thấp (chỉ từ 10 đến 200 tế bào), nên nguy cơ lan bệnh cao ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém và nguồn nước ô nhiễm. Vật chủ tự nhiên chủ yếu của Shigella là người. Ở động vật một số mẫu được phân lập được từ chó và ở động vật linh trưởng. Sự nhiễm bệnh xảy ra cao nhất ở trẻ em từ 1 đến 5 tuổi, ngoại trừ S. dysenteriae týp 1 gây bệnh ở tất cả các nhóm tuổi. Bệnh nhân nhiễm các týp Shigella khác nhau sẽ biểu hiện bệnh khác nhau. Ngoài ra, sự biểu hiện bệnh còn phụ thuộc vào độ tuổi, sự hiện diện của các yếu tố nguy cơ và tình trạng miễn dịch của cơ thể người bệnh. Thời gian ủ bệnh thường từ 1 đến 4 ngày nhưng cũng có thể kéo dài đến 8 ngày trong trường hợp nhiễm S. dysenteriae. Sau đó, bệnh nhân sẽ có những triệu chứng như sốt, mệt mỏi, khó chịu và chán ăn, tiếp theo là tiêu chảy ra nước. Nhiễm bệnh nặng có thể dẫn đến phân nhầy có máu và co thắt bụng. Nhiễm Shigella làm mất khoảng 200 – 300 ml protein huyết thanh vào phân mỗi ngày, dẫn đến sụt giảm lượng nitrogen dự trữ. Đối với trẻ em bị suy dinh dưỡng, nhiễm Shigella gây ra vòng luẩn quẩn, làm trẻ em càng trở nên suy dinh dưỡng, tái nhiễm và chậm phát triển. Sự nhiễm Shigella thường chỉ xảy ra tại lớp màng nhầy ở ruột, gây phản ứng viêm và phá hủy thành ruột. Cơ chế xâm nhập vào tế bào và lan truyền của bệnh khá phức tạp. Quá trình này có thể chia ra làm 4 giai đoạn: (1) xâm nhiễm vào tế bào; (2) nhân bản nội bào; (3) lan truyền nội bào và gian bào; (4) tiêu diệt tế bào bị xâm nhiễm. Shigella sử dụng hệ thống tiết III (hệ thống tiết phổ biến của các vi khuẩn đường ruột Gram âm) để tiêm protein Ipa (Invasion Plasmid Antigen protein) vào tế bào lây nhiễm. Phức hợp protein này có thể gây ly giải không bào của tế bào nhiễm, làm nhiều vi khuẩn Shigella có thể đi vào tế bào M. Từ tế bào M, Shigella chuyển đến vùng dưới biểu mô và bị thực bào bởi đại thực bào. Sau đó chúng làm ly giải thể thực bào, kích thích quá trình apoptosis (chết theo chương trình) của đại thực bào. Trong suốt quá trình này, đại thực bào nhiễm Shigella sẽ tiết ra IL-1, hấp dẫn các bạch cầu đa nhân đến và thấm qua lớp lumen của thành ruột. Khi bạch cầu đa nhân di chuyển qua lớp biểu mô, chúng làm lỏng lẻo các liên kết giữa các tế bào, làm Shigella có thể di chuyển ngược lại vào vùng dưới biểu mô, xâm nhiễm các tế bào biểu mô trụ bằng việc cảm ứng quá trình thực ẩm bào. Bên trong tế bào, chúng sẽ ly giải không bào và bám vào bộ xương tế bào. Tại tế bào chất, vi khuẩn nhân bản, cảm ứng sự phân cực của sợi actin, tạo ra “đuôi” đẩy vi khuẩn va chạm với các tế bào ruột khác. Màng tế bào chất bao xung quanh vi khuẩn lại tiếp tục bị ly giải, vi khuẩn tiếp tục vào các tế bào xung quanh, và lan truyền giữa các tế bào (hình 1.3). Hình 1.3 Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của Shigella 1.5 Đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với sự xâm nhiễm của Shigella [21] Sự nhiễm Shigella sẽ gây tính đáp ứng miễn dịch bảo vệ của cơ thể. Tuy nhiên, tính miễn dịch này có tính đặc hiệu với từng týp huyết thanh (tức là đặc hiệu với kháng nguyên O trên lớp LPS của màng ngoài vi khuẩn). Kháng thể đáp ứng với kháng nguyên của Shigella xuất hiện sớm trong quá trình nhiễm vi khuẩn và theo quá trình đặc trưng cho mỗi loại kháng thể kháng các liposaccharide khác nhau. 1.6 Các phương pháp chẩn đoán [21, 24, 35, 36] 1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng: Các bác sĩ chẩn đoán lâm sàng việc nhiễm Shigella spp. trước hết dựa vào các triệu chứng của bệnh nhân. Triệu chứng của việc nhiễm Shigella là buồn nôn, ói, tiêu chảy ra nước và sốt cao. Tiêu biểu là phân nhầy và có lẫn máu. Tuy nhiên, các triệu chứng này khó phân biệt với các bệnh nhiễm virus, vi khuẩn khác hay nhiễm protozoan. 1.6.2 Phòng thí nghiệm: - Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống: Đây là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh. Phương pháp này cho kết quả tốt nhất khi (1) mẫu phân được thu trong thời gian đầu nhiễm bệnh (do số lượng vi khuẩn nhiều) và trước khi bệnh nhân được điều trị với kháng sinh; (2) mẫu phân được cấy trong vài giờ sau khi thu mẫu. Mẫu phân được cấy phân lập trên các môi trường chọn lọc khác nhau như MacConkey, Hektoen Enteric, Salmonella – Shigella, Xylose Lysine Desoxycholate và Desoxycholate Citrate, trong điều kiện hiếu khí để loại các vi khuẩn kỵ khí. Song song đó, sau khi phân lập được Shigella, các xét nghiệm về tính kháng kháng sinh cũng đồng thời được tiến hành, để bác sĩ có thể đưa ra liệu pháp chữa trị phù hợp. - Các kỹ thuật phát hiện Shigella nhanh và nhạy đang được phát triển như phương pháp PCR sử dụng các mẫu dò và mồi đặc hiệu với các gen gây độc. Tuy nhiên, phương pháp này đắt tiền và đòi hỏi những kỹ thuật phức tạp. 1.7 Các phương pháp điều trị [21, 22, 39, 40] Điều đầu tiên bệnh nhân nhiễm Shigella cần là cung cấp lại lượng nước và muối khoáng đã mất khi bị tiêu chảy. Nhưng do sự mất nước gây ra bởi nhiễm Shigella ít khi trở nên trầm trọng nên nếu có biện pháp bù nước và các chất điện giải thích hợp bệnh sẽ tự khỏi. Chữa trị bằng kháng sinh: Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo nên dùng kháng sinh cho bệnh nhân đã được chẩn đoán nhiễm Shigella. Kháng sinh đó sẽ tiếp tục được chỉ định điều trị nếu sau 2 ngày bệnh nhân có tiến triển tốt. Việc sử dụng kháng sinh trong chữa trị tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh, độ tuổi của bệnh nhân, và mức độ lan truyền của vi khuẩn ra cộng đồng. Nếu chữa trị bằng kháng sinh có hiệu quả, các triệu chứng của bệnh sẽ yếu dần trong vòng 48 giờ. Khi đó thời gian mang bệnh sẽ rút ngắn từ 5 – 8 ngày xuống còn khoảng 3 ngày, do đó làm giảm thời gian Shigella phát tán ra ngoài cộng đồng. Nếu không dùng kháng sinh hay dùng kháng sinh không thích hợp, bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày hoặc lâu hơn, làm tăng nguy cơ bội nhiễm (do kháng sinh tiêu diệt các vi khuẩn đường ruột có lợi sống cạnh tranh với Shigella). Đặc biệt trong trường hợp nhiễm S. dysenteriae hoặc S. flexneri bệnh nhân có thể tử vong. Ngoài ra, chữa trị bệnh không dứt điểm có thể dẫn đến bệnh tiêu chảy mãn tính. Vào những năm 1990, Quinolone là kháng sinh được dùng phổ biến trong chữa trị bệnh nhiễm Shigella. Kháng sinh này ức chế enzyme DNA gyrase hay topoisomerase IV, và do đó ức chế quá trình sao chép và phiên mã DNA của vi khuẩn. Tuy nhiên, kháng sinh này không được sử dụng cho phụ nữ trong thời kì mang thai và cho trẻ em, do nghi ngờ chúng gây độc cho sụn. Ngày nay, tính kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng gia tăng làm các nhà khoa học buộc phải tìm các kháng sinh mới trong điều trị. Trong đó, Cephalosporin thế hệ thứ 3 (ceftriaxone là một ví dụ) có kết quả điều trị lâm sàng rất tốt, và an toàn với trẻ em, được khuyến khích dùng trong chữa trị nhiễm Shigella. Tại Việt Nam, do hiện nay Shigella đã kháng hầu hết với các kháng sinh phổ biến như ampicillin, tetracycline nên kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị nhiễm Shigella là ciprofloxacin (hay một loại fluoroquinolone khác). Tuy nhiên, thuốc này có thể có những tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, co giật và nhức đầu. Ngoài ra, thuốc này cũng không được dùng cho trẻ dưới 12 tuổi do nhóm kháng sinh này ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của sụn và khớp. Khi bệnh nhân nhiễm Shigella kháng với kháng sinh này, kháng sinh ceftriaxone (cephalosporin thế hệ ba) được sử dụng thay thế. 1.8 Tình hình kháng kháng sinh của Shigella trên thế giới và ở Việt Nam 1.8.1 Tình hình kháng kháng sinh của Shigella trên thế giới [9, 18, 20, 21, 30] Theo các ghi chép trong lịch sử y học, Shigella spp. là loài vi khuẩn dễ trở nên kháng kháng sinh. Chỉ trong vài thập kỷ, Shigella đã trở nên kháng với hầu hết các loại kháng sinh phổ biến. Việc kháng kháng sinh của Shigella thường phản ánh loại thuốc được dùng phổ biến trong những thập kỉ trước đó. Và vấn đề này trở nên nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng. Vào đầu những năm 1940, sulfonamides là loại thuốc kháng sinh có hiệu quả tốt và được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, đến những năm 50, thuốc này đã trở nên kém hiệu quả trong điều trị. Tình trạng kháng thuốc này cũng xảy ra tương tự đối với các loại kháng sinh khác. Tetracycline, ampicilline, co-trimixazole rất có hiệu quả ở những năm 1960, nhưng từ cuối thập kỉ 60 đến những năm 1980, Shigella kháng 3 loại kháng sinh này ngày càng gia tăng và trở nên phổ biến. Sau đó, các fluoroquinolone thế hệ mới như norfloxacin, ciprofloxacin được sử dụng đối với những bệnh nhân nhiễm Shigella kháng nalidixic acid. Sau đó, Shigella kháng với các kháng sinh này cũng đã xuất hiện. Hiện nay, ceftriaxone được sử dụng rộng rãi và được đề nghị dùng khi điều trị cho các bệnh nhân nhiễm Shigella đa kháng thuốc ở mọi lứa tuổi. Nhưng những chủng Shigella kháng ceftriaxone cũng đã xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, như ở Bangladesh, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông, Pháp, Argentina,… 1.8.2 Tình hình kháng kháng sinh của Shigella ở Việt Nam [1, 25, 28] Tại Việt Nam, tình hình kháng kháng sinh của Shigella cũng tương tự như tình hình thế giới. Việc có thể dễ dàng mua và sử dụng thuốc kháng sinh dễ dàng và bừa bãi ở Việt Nam (71% bệnh nhân bệnh tiêu chảy tự ý sử dụng kháng sinh mà không tham khảo ý kiến bác sĩ) làm cho tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Hiện nay Shigella ở Việt Nam hầu như đều kháng với ít nhất một loại kháng sinh thường dùng. Tỷ lệ kháng ampicillin, trimethoprim – sulfamethoxazole, tetracycline lên đến 85%-96%. Đặc biệt, tỷ lệ đa kháng ampicilin, trimethoprim – sulfamethoxazole và tetracycline là 25% ở S. sonnei và 62% ở S. flexneri. Trong số các chủng Shigella phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp. HCM (HTD) từ năm 2000 đến năm 2002, chỉ có 1 ca nhiễm Shigella kháng ceftriaxone. Nhưng từ tháng 6-2006 đến tháng 1-20