Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ [Polyscias fruticosa (L.) Harms.] bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 593 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID OLEANOLIC TRONG ĐINH LĂNG LÁ XẺ [POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS.] BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thị Phương Thảo*, Võ Thị Bạch Tuyết*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp: Cao Đinh lăng lá xẻ sau khi chiết xuất và thủy phân sẽ được tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm xác định hàm lượng acid oleanolic. Kết quả: Đã xây dựng hoàn chỉnh và thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ Đinh lăng bằng HPLC. Kết luận: Phương pháp định lượng HPLC xây dựng đáng tin cậy. Hàm lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ khá cao (1,5%), trong khi hàm lượng trong rễ rất thấp (0,063%) Từ khóa: Đinh lăng, saponin, acid oleanolic, HPLC. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OFOLEANOLIC ACID IN POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS - ARALIACEAE) BY HPLC Nguyen Thi Phuong Thao, Vo Thi Bach Tuyet, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 593 - 597 Objectives: Study on a HPLC method for quantitative determination of oleanolic acid in Polyscias fruticosa (stems and leaves, and roots). Methods: Extracts of Polyscias fruticosa were hydrolyzed, purifified prior to quantity determination of oleanolic acid by HPLC. Results:: A HPLC method to determine oleanolic acid in Polyscias fruticosa was established.. Conclusions: The analytical method was proven to be reliable. The content of oleanolic acid in stems and leaves, and in roots were determined to be 1,5% and 0,063%, respectively. Keywords: Polyscias fruticosa, saponin, oleanolic acid, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms - Araliaceace), còn được gọi là cây Gỏi cá, là một dược liệu được sử dụng khá rộng rãi với tác dụng bổ, tăng lực, chống mệt mỏi, giúp tăng cường khả năng lao động và hoạt động trí não(1,3). Đinh lăng lá xẻ chứa saponin triterpen với aglycon chính là acid oleanolic(4). Tuy nhiên, các tiêu chí kiểm nghiệm Đinh lăng và các chế phẩm đang lưu hành hiện nay còn rất đơn giản. Vì vậy mục tiêu của đề tài này là nhằm nghiên cứu phương pháp định lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)(2) với chất chuẩn là acid oleanolic, nhằm góp phần phục vụ cho việc kiểm định Đinh lăng lá xẻ và các chế phẩm hơn hiệu quả. *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908989865 Email: [email protected] Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 594 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu - Rễ Đinh lăng thu hái ở Phú Yên, thân lá Đinh lăng thu hái ở Tây Ninh vào tháng 4/2010. - Acid oleanolic chuẩn (độ tinh khiết 99%) do Ban Nghiên cứu Khoa học-Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Phương pháp Máy sắc ký Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-10AD, detector SPD-M10AVP. Cột HPLC pha đảo Prontosil LC8 (150 x 4.6 mm, 3 μm). Quy trình chiết xuất và định lượng acid oleanolic Rễ, thân và lá Đinh lăng, rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ, xác định độ ẩm. Cân chính xác khoảng 2 g (thân lá) hoặc 5 g (rễ). Chiết kiệt bằng 150 ml methanol với dụng cụ Soxhlet trong 20 giờ. Cô dịch chiết đến cắn, hòa với 30 ml dung dịch HCl 10% trong cồn. Thủy phân hồi lưu ở nhiệt độ sôi trong 6 giờ. Lắc dịch thủy phân với 200 ml dichloromethan (20 ml x 5 lần + 10 ml x 5 lần + 5 ml x 10 lần). Lắc dịch dichloromethan với 500 ml nước cất (100 ml x 5 lần). Làm khan dịch dichloromethan với muối Na2SO4 khan. Cô dịch dichloromethan đến cắn và sấy chân không ở nhiệt độ 50oC thu được sapogenin toàn phần (chứa chủ yếu acid oleanolic). Cân chính xác khoảng 3 mg sapogenin toàn phần (thân lá) hoặc 10 mg (rễ), hòa tan trong methanol HPLC trong bình định mức 5 ml. Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc 0.45 μm, tiến hành sắc ký HPLC, tính hàm lượng acid oleanolic trong Đinh lăng lá xẻ. Điều kiện tiến hành HPLC định lượng acid oleanolic Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Pha động: CH3CN- H2O (72:28) Cột sắc ký: Prontosil LC8 (150 x 4,6 mm, 3 μm). Detector SPD phát hiện ở bước sóng 203 nm. Tốc độ dòng 0,768 ml/ phút Thể tích bơm mẫu: 20 μl Hình 1. Sắc đồ HPLC của acid oleanolic chuẩn (trái, Rt ~ 6,5) và sapogenin toàn phần cao thân lá Đinh lăng (phải). Thẩm định phương pháp HPLC Xác định tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 595 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC Bảng 1. Kết quả điều chế mẫu để định lượng hoạt chất trong Đinh lăng bằng HPLC Tên mẫu Độ ẩm dược liệu Lượng dược liệu ban đầu (g) Lượng dược liêu khô (g) Lượng cắn sapogenin (mg) Lượng cắn pha mẫu định lượng (mg) Thân lá 8,65% 2,0004 1,8274 136,9 3,49 Định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng Đường chuẩn HPLC định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng Tiến hành xác định diện tích đỉnh acid oleanolic của các mẫu chuẩn có nồng độ từ 24 đến 300 μg/ml ta thu được kết quả sau: y = 13855x + 21100 R2 = 0.9998 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ (mcg/ml) D iện tí ch đỉ nh Hình 2. Đồ thị biểu diễn tính tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ acid oleanolic Nhận xét: R2 = 0,9998 > 0,995 Như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ acid oleanolic và diện tích đỉnh Kết quả định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng Bảng 2. Kết quả định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng Tên mẫu Diện tích đỉnh acid oleanolic Nồng độ acid oleanolic (mg/ml) % acid oleanolic tính trên dược liệu khô Thân lá 2634708 0,1886 2,02% Thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ Tính tương thích hệ thống Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống khi xét hệ số phân tán của 6 lần bơm dung dịch mẫu thử thân và lá Đinh lăng lá xẻ (Bảng 3). Bảng 3. Các thông số sắc ký ứng với đỉnh acid oleanolic Số lần bơm Thời gian lưu Diện tích đỉnh Hệ số bất đối Độ phân giải Số đĩa lý thuyết 1 6.507 2354748 0.88 1.6 1604 2 6.461 2378642 0.86 1.55 1628 3 6.425 2315583 0.83 1.54 1611 4 6.44 2398933 0.86 1.62 1592 5 6.471 2439432 0.86 1.58 1546 6 6.548 2433719 0.87 1.59 1562 TB 6.475333 2386843 0.86 1.58 1590.5 SD 0.045364 47506.76 0.016733 0.030332 30.99516 RSD% 0.700562 1.99036 1.945721 1.919715 1.948768 RSD% của thời gian lưu là 0.7% (<2%) và của diện tích đỉnh là 1.99% (<2%) nên hệ thống đạt tính tương thích. Độ lặp lại Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày trong Bảng 4. Nồng độ mẫu chuẩn 0,22 mg/ml, diện tích đỉnh 3069709. Bảng 4. Độ lặp lại của phương pháp định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ Mẫu Diện tích đỉnh mẫu thử Hàm lượng acid oleanolic (%) 1 2404815 1.55 2 2713779 1.52 3 2030165 1.43 4 2680677 1.5 5 2419096 1.49 6 2496939 1.49 TB 1.5 SD 0.04 RSD% 2.66 Nhận xét: hàm lượng trung bình acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ là 1,5%. RSD = 2,66%. Hàm lượng chất phân tích < 10% nên RSD < 2,8% là được chấp nhận. Như vậy phương pháp đạt độ chính xác. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 596 Độ đúng Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày trong Bảng 5. Bảng 5. Độ đúng của phương pháp định lượng acid oleanolic trong thân và lá Đinh lăng lá xẻ Mẫu Mức hàm lượng Lượng acid oleanolic thêm vào (mg) Lượng acid oleanolic tìm thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 1 17,99 17,48 97,17 2 18,24 18,11 99,29 3 80% 18,14 17,96 99,01 4 22,49 22,41 99,64 5 22,49 23,07 102,58 6 100% 22,45 22,36 99,6 7 27,03 26,61 98,45 8 27,31 26,78 98,06 9 120% 26,75 26,41 98,73 TB 99,17 SD 1,5 RSD% 1,51 Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục là 99,17%. Hàm lượng chất phân tích ≥ 1% nên tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng 97-103% là được chấp nhận. Như vậy phương pháp đạt độ đúng. Kết luận: Như vậy, kết quả thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic đã cho thấy: với quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã trình bày, phương pháp đạt độ đúng và độ lặp lại cần thiết để định lượng acid oleanolic trong dược liệu thân và lá Đinh lăng lá xẻ. Thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ Độ lặp lại Kết quả đánh giá độ lặp lại được trình bày trong Bảng 6. Nồng độ mẫu chuẩn 0,235 mg/ml, diện tích đỉnh 3279022. Bảng 6. Độ lặp lại của phương pháp định lượng acid oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ Mẫu Diện tích đỉnh mẫu thử Hàm lượng acid oleanolic (%) 1 1465489 0,063 2 1476281 0,064 3 1251069 0,061 4 1175139 0,059 Mẫu Diện tích đỉnh mẫu thử Hàm lượng acid oleanolic (%) 5 1488948 0,065 6 1430635 0,064 TB 0.063 SD 0,002 RSD% 3,59 Nhận xét: hàm lượng trung bình acid oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ là 0,063%. RSD = 3,59%. Hàm lượng chất phân tích < 0,1% nên RSD < 3,7% là được chấp nhận. Như vậy phương pháp đạt độ chính xác. Độ đúng Kết quả đánh giá độ đúng được trình bày trong Bảng 7. Bảng 7. Độ đúng của phương pháp định lượng acid oleanolic trong rễ Đinh lăng lá xẻ Mẫu Mức hàm lượng Lượng acid oleanolic thêm vào (mg) Lượng acid oleanolic tìm thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 1 2 3 80% 2,3 2,28 2.25 2,21 2.2 2.2 96,09 96,49 97,78 4 5 6 100% 3,35 3,34 3.3 3,27 3,27 3.23 97,61 97,9 98,48 3.75 3.62 96,53 3.72 3.59 96,51 7 8 9 120% 3.8 3.71 97,63 TB 97,22 SD 0,83 RSD% 0,85 Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục là 97,22%. RSD = 0,85%. Hàm lượng chất phân tích < 0,1% nên tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng 95-105% là được chấp nhận. Như vậy phương pháp đạt độ đúng. Kết luận: Như vậy, kết quả thẩm định quy trình định lượng acid oleanolic đã cho thấy: với quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã trình bày, phương pháp đạt độ đúng và độ lặp lại cần thiết để định lượng acid oleanolic trong dược liệu rễ Đinh lăng lá xẻ. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng được hoàn chỉnh và thẩm định quy trình Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 597 định lượng acid oleanolic trong thân lá và rễ Đinh lăng lá xẻ. Qua kết quả định lượng thấy được thân lá Đinh lăng lá xẻ chứa hàm lượng acid oleanolic khá cao (1,5%) trong khi rễ chứa rất ít (0,063%). Phương pháp chiết xuất, loại tạp và định lượng acid oleanolic trong thân là và rễ Định lăng đã được chứng minh là đáng tin cậy và ổn định, có thể dùng để kiểm định acid oleanolic trong Đinh lăng và các chế phẩm, cũng như mở rộng ứng dụng cho các dược liệu chứa acid oleanolic khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr. 828-830. 2. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản Y Học, Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.793- 796. 4. Vo Duy Huan, Satoshi Yamamura, Kazuhiro Otani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki, Nguyen Thoi Nham, Hoang Minh Chau (1998), “Oleannolic saponins from Polyscias fruticosa”, Phytochemmistry, Vol. 47, No. 3, pp. 451-457.