Xây dựng qui trình định lượng Clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 14 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLONIDIN TRONG HUYẾT TƯƠNG THỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Huỳnh Văn Hóa*, Lê Hậu*, Trương Quốc Kỳ*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục tiêu nghiên cứu: Dạng thuốc dán hấp thu qua da với dược chất clonidin đã được phát triển với tên thương mại là Catapres. Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin chỉ có trong Dược điển Mỹ. Trên thế giới chỉ có một vài công trình công bố qui trình định lượng clonidin được phóng thích từ thuốc dán Catapres trong huyết tương thỏ bằng phương pháp LC-MS. Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và 7,5 mg đã được Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công. Bước tiếp theo của đề tài là tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc. Vì vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” đã được thực hiện. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin chuẩn bằng phương pháp tủa protein và chiết pha rắn. Thăm dò các điều kiện sắc ký về pha động: không có dung dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào một tác nhân tạo cặp ion. Kết quả: Đã xác định được điều kiện thích hợp để chiết clonidin từ huyết tương thêm clonidin chuẩn với hiệu suất chiết khoảng 70% và có độ lặp lại cao. Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng clonidin trong huyết tương thỏ. Qui trình định lượng đã được thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn của FDA Hoa Kỳ. Cuối cùng, qui trình đã được ứng dụng để định lượng clonidin trong một số mẫu huyết tương thỏ sau khi được dán thuốc thử nghiệm. Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công qui trình HPLC-PDA định lượng clonidin trong huyết tương thỏ. Qui trình có thể được tiếp tục ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc trên huyết tương thỏ. Từ khóa: Clonidin, huyết tương thỏ, sắc ký lỏng hiệu năng cao. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDINE IN RABBIT PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH PHOTO DIODE ARRAY DETECTOR Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Truong Quoc Ky, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 14 - 20 Introduction - Aims: Transdermal patches containing clonidine have been launched into global market under trade name Catapres–TTS (Transdermal Therapeutic System) for a long time. So far, there’s only TTS monograph clonidine in USP. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry has recently been applied for measurement of clonidine in rabbit plasma. In Vietnam, transdermal therapeutic system of clonidine 2.5 mg and 7.5 mg has been successfully prepared by Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City. Therefore, the aim of this study was to develop a simple HPLC-PDA method for quantitative determination of clonidine in rabbit plasma. Subjects and Methods: Protein precipitation and solid phase extraction were applied for clonidine extraction from rabbit plasma. Several chromatographic conditions such as mobile phase including buffer, without * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Trần Quốc Thanh - ĐT: 0903 389 214 - Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 15 buffer, or added to one ion pair agent, were investigated. Results: The protein precipitation was successfully applied for clonidine extraction from rabbit plasma with recovery of 70% and high repeatability. The appropriate chromatographic conditions were found out for quantitative determination of clonidine from rabbit plasma. The liquid chromatographic method was validated and satisfied all requirements under the guidance of US FDA. Finally, the validated method could be a reliable statement concerning quantitative determination of clonidine in rabbit plasma. Conclusion: A simple HPLC-PDA method was successfully developed for quantitative determination of clonidine in rabbit plasma. The method can be further applied for clonidine quantitation in in vivo bioavailability study of transdermal patches. Key words: Clonidine, rabbit plasma, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Dạng thuốc dán hấp thu qua da (Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày càng được quan tâm phát triển rộng rãi do có rất nhiều ưu điểm so với thuốc viên. Thuốc dán điều trị tăng huyết áp đầu tiên ra đời là chế phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin. Cho đến nay, chuyên luận thuốc dán clonidin chỉ có trong Dược điển Mỹ(3). Trên thế giới chỉ có một công trình công bố qui trình định lượng clonidin được phóng thích từ thuốc dán Catapres trong huyết tương thỏ bằng phương pháp LC-MS(2). Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 và 7,5mg đã được Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công. Bước tiếp theo của đề tài là tiến hành xác định sinh khả dụng của thuốc. Vì vậy đề tài “Xây dựng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA” đã được thực hiện. ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Thuốc dán Clonidin 2,5 mg và 7,5 mg của Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. Chất đối chiếu và thuốc đối chiếu Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng 04/2014. Thuốc đối chiếu: Catapres-TTS® 7,5 mg/10,5 cm2, hạn dùng tháng 05/2013 của công ty Boehringer Ingelhem, Đức. Hóa chất, dung môi Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1- heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng (Merck). Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996. Cân phân tích Sartorius CP 224D. Máy đo pH Metrohm 744. Bể siêu âm Elma. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện sắc ký Clonidin là một chất có tính base, phân cực nên kỹ thuật sắc ký pha đảo được lựa chọn. Qua tham khảo các tài liệu(3,2,1) định lượng clonidin trong huyết tương, điều kiện sắc ký ban đầu được đề nghị như sau: Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 210 nm. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Pha động A (không có dung dịch đệm): methanol – nước (40:60) được điều chỉnh đến pH 3 bằng acid phosphoric. Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1 ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%. Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1,21 g Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 16 natri 1-heptansulfonat và 1 ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH 3 bằng KOH 30%. Khảo sát 3 hệ pha động trên để chọn điều kiện sắc ký thích hợp thoả mãn các yêu cầu sau: pic clonidin phải tách hoàn toàn pic khác (nếu có) và có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân chính xác 11,8 mg clonidin HCl chuẩn, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và bổ sung bằng dung dịch KOH 0,0025% đến vạch, lắc đều. Dung dịch sau khi pha được bảo quản ở 0 – 4oC. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước để được các dung dịch chuẩn nồng độ từ 2 – 13 µg/ml. Tủa protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ Trước tiên, chọn phương pháp tủa protein để xử lý mẫu vì đây là phương pháp đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thời gian xử lý nhanh. Do clonidin tan tốt trong methanol nên dung môi này được lựa chọn để tủa protein. Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi/huyết tương để tủa hoàn toàn protein. Áp dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) Dựa theo tài liệu tham khảo(2), dùng cột SPE đã được nhồi sẵn 500 mg silicagel C18, thể tích 5 ml. Hoạt hóa cột bằng 1 ml methanol, 1 ml nước. Cho 0,04 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,36 ml huyết tương trắng, lắc rung 1 phút. Cho qua cột SPE, để yên 5 phút. Rửa cột với 1 ml nước và 1 ml methanol 5%. Rửa giải cột với 0,8 ml methanol. Tủa protein trong huyết tương bằng acid percloric Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,49 ml huyết tương trắng, lắc rung 1 phút. Thêm tiếp 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút. Tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung 1 phút. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút. Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn của US FDA(4), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết), giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ ổn định. Ứng dụng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ Thử nghiệm đối với thuốc dán chứa clonidin 7,5 mg/17,28 cm2 do Khoa Dược, ĐHYD Tp HCM bào chế và thuốc dán đối chiếu Catapres – TTS chứa clonidin 7,5 mg/10,5 cm2. Mỗi loại thuốc dán trên sẽ được thử nghiệm trên 6 thỏ. Lấy một miếng thuốc dán dán lên vùng thử nghiệm trên da thỏ. Lấy 1 ml máu thỏ qua tĩnh mạch vành tai thỏ vào các thời điểm 0, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 78 giờ. Mẫu máu được đem ly tâm, xử lý và tiến hành định lượng. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện sắc ký Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký được thể hiện qua hình 1. Với pha động A, pic clonidin xuất hiện rất sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút. Với pha động B, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 4,58 phút nhưng bị kéo đuôi. Pha động C, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 11,4 – 12,8 phút, pic clonidin tách hoàn toàn pic tạp và có hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Vì vậy pha động C được lựa chọn. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu huyết tương Phương pháp kết tủa protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ có ưu điểm là xử lý mẫu nhanh, sau một tuần khảo sát, tỷ lệ methanol/ huyết tương để tủa hoàn toàn protein là 3:1. Tuy nhiên nồng độ clonidin bị loãng đi, còn lẫn nhiều tạp chất khi tiến hành sắc ký và pic clonidin không tách khỏi hoàn toàn pic tạp (hình 2). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 17 (a) (b) (c) (d) Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C và mẫu huyết tương trắng thêm dung dịch chuẩn: (d) với pha động C. Phương pháp chiết pha rắn có thời gian xử lý mẫu lâu hơn, sau khi tiến hành sắc ký thấy còn khá nhiều tạp và pic clonidin còn lẫn với các pic tạp khác (hình 3). Phương pháp tủa protein với acid percloric dù còn nhiều tạp nhưng pic clonidin tách hoàn toàn khỏi pic tạp và phát hiện được với nồng độ mẫu rất thấp (hình 1d). Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn được xử lý bằng cách tủa protein với methanol Hình 3: Sắc ký đồ mẫu huyết tương thêm chuẩn được xử lý bằng phương pháp chiết pha rắn Do đó phương pháp xử lý mẫu huyết tương bằng acid percloric được lựa chọn. Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp của hệ thống Kết quả phân tích lặp lại 6 lần mẫu huyết tương thêm chuẩn clonidin được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6) Diện tích pic (µAu x giây) Thời gian lưu (phút) Hệ số đối xứng (As) Số đĩa lý thuyết (N) Độ phân giải (Rs) TB 334818 12,014 1,2 26891 4,25 RSD 1,03% 0,27% 0,87% 1,92% 0,92% Nhận xét: RSD của các thông số khảo sát gồm diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý thuyết, độ phân giải đều có RSD < 2%, chứng tỏ qui trình có tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu huyết tương thêm chuẩn và mẫu huyết tương trắng theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả cho thấy: phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu huyết tương thêm chuẩn và mẫu chuẩn giống nhau (hình 4), thời gian lưu của pic trong mẫu huyết tương thêm chuẩn (hình 1d) tương đương với thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu huyết tương trắng (hình 5) không có pic trùng với pic Clonidin HCl Clonidin HCl Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 18 clonidin, sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic cho thấy pic clonidin trong mẫu huyết tương thêm chuẩn tinh khiết (hình 6). Do đó, có thể khẳng định qui trình phân tích có tính đặc hiệu. Hình 4: Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic clonidin trong mẫu chuẩn (a) và mẫu huyết tương thêm chuẩn (b) Hình 5: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình 6: Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic clonidin HCl trong mẫu huyết tương thêm chuẩn Khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất chiết, độ ổn định Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, hiệu suất chiết và độ ổn định Chỉ tiêu thẩm định Clonidin HCl Phương trình hồi qui Ŷ = 472,9X; R2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính (ng/ml) 45 – 800 Giới hạn định lượng dưới (ng/ml) 45 Hiệu suất chiết* 73,1% - 77,0% ; RSD = 0,65% - 5,20% Độ chính xác trong ngày và khác ngày* (RSD, n= 18) 2,42% - 18,25% Độ đúng trong ngày và khác ngày* (tỷ lệ hồi phục, n=18) 92,80% - 115,85% Độ ổn định* Dung dịch chuẩn gốc vẫn ổn định sau 7 ngày bảo quản ở 0 – 4oC. Mẫu huyết tương chứa clonidin có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, bảo quản ở -70oC trong khoảng 1 tháng, ổn định sau 3 chu kỳ đông, rã đông và sau khi xử lý mẫu 12 tiếng ở nhiệt độ phòng. * Được thực hiện tại 3 nồng độ khác nhau 45 ng/ml, 400 ng/ml và 800 ng/ml. Nhận xét: Bằng các kết quả thực nghiệm thu được, phương pháp định lượng clonidin trong huyết tương thỏ đạt yêu cầu thẩm định của quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học về tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, hiệu suất chiết, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, độ ổn định theo hướng dẫn của FDA Hoa Kỳ(4). Tóm tắt qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân chính xác 11,8 mg chuẩn clonidin HCl, cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan và bổ sung bằng dung dịch KOH 0,0025% (g/ml) đến vạch, lắc đều. Pha loãng dung dịch thu được với nước để thu được 3 dung dịch chuẩn ở 3 mức (a) (b) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 19 nồng độ sao cho nồng độ clonidin sau xử lý mẫu huyết tương là 45 ng/ml, 400 ng/ml và 800 ng/ml. Cho 0,01 ml dung dịch chuẩn clonidin vào 0,49 ml huyết tương trắng, lắc rung (vortex) 1 phút, thêm 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút, tiếp tục thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung 1 phút. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút, lọc dịch trong qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký. Chuẩn bị mẫu thử Lấy 0,5 ml huyết tương thỏ, thêm 0,05 ml dung dịch HCl 0,2%, lắc rung 1 phút, thêm 0,05 ml dung dịch acid percloric 70%, lắc rung 1 phút. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút, lọc dịch trong qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký. Điều kiện sắc ký Cột sắc ký: Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng 260C. Pha động: hòa tan 1,21 g natri heptansulfonat trong 600 ml nước, thêm 400 ml methanol và 1 ml acid phosphoric, điều chỉnh đến pH = 3 bằng dung dịch KOH 30%. Tốc độ dòng: 1 ml/ phút. Đầu dò PDA: bước sóng phát hiện 210 nm. Thể tích tiêm mẫu: 100 µl. Ứng dụng qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ clonidin trong huyết tương thỏ theo thời gian sau khi dán thuốc dán clonidin 7,5 mg và thuốc dán Catapres 7,5 mg Nhận xét: Thuốc dán Catapres 7,5 mg và clonidin 7,5 mg đều có nồng độ nồng độ clonidin cực đại trong huyết tương thỏ tương đương sau khi dán thuốc 36 giờ. Không phát hiện clonidin sau khi dán thuốc (0 giờ) và nồng độ clonidin trong huyết tương thỏ nhỏ hơn giới hạn định lượng dưới sau khi dán thuốc 6, 60, 72 và 78 giờ. Phương pháp HPLC-PDA tuy có độ nhạy không bằng phương pháp LC-MS/MS nhưng giá trị giới hạn định lượng dưới chấp nhận được để định lượng hoạt chất trong huyết tương. Các kết quả định lượng ban đầu cho thấy qui trình có thể được ứng dụng cho các nghiên cứu về sinh khả dụng trên thỏ. KẾT LUẬN Đề tài đã xây dựng được qui trình định lượng clonidin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Qui trình định lượng clonidin đã được thẩm định về tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ chính xác, độ đúng, tỷ lệ hồi phục và độ ổn định. Qui trình đã được ứng dụng để định lượng clonidin trong huyết tương thỏ sau khi được dán thuốc thử nghiệm và có thể được tiếp tục ứng dụng để N ồn g ñộ c lo ni di n (n g/ m l) Thời gian (Giờ) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 20 đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc trên huyết tương thỏ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chux LC, Bayne WF, Tao FT, Schmitt LG, Shaw JE (1979). Determination of submicrogram quantities of clonidin in biological fluids, Journal of Pharmaceutical Sciences, 68(1), 72-74. 2. Mote M, Inamdar S, Ghosh C, Chakraborty B (2009). A sensitive, selective, precise and accurate LC-MS method for determination of clonidine in human plasma, Chromatography, 69, 11-12. 3. United States Pharmacopoeia 32, NF27 (2009). The United States Pharmacopeial Convention. 557-563. 4. US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical method validation, 3 – 15. Ngày nhận bài báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014