Xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 19 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN YẾU TỐ VIII  GÂY BỆNH HEMOPHILIA A  Nguyễn Ngọc Minh*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Thị Băng Sương*  TÓM TẮT  Mở đầu: Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hay bất thường chức năng của yếu tố đông  máu VIII. Đây là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nên bệnh gặp chủ yếu ở nam giới và nữ  giới là người mang gen bệnh. Biểu hiện bệnh trên lâm sàng chủ yếu là chảy máu, mức độ chảy máu có thể là nhẹ,  trung bình hoặc nặng tùy thuộc vào nồng độ của yếu tố VIII trong huyết tương. Chẩn đoán chính xác và điều trị  sớm căn bệnh này có một ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả  năng bệnh nhân trở thành tàn tật. Tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử ngày nay cho phép phân tích DNA để  phát hiện những tổn thương gen gây ra bệnh hemophilia A, phát hiện người lành mang gen bệnh và ứng dụng  trong chẩn đoán trước sinh cũng như tư vấn di truyền.  Mục tiêu: Xây dựng và chẩn hóa quy trình xét nghiệm xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophila A  bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.  Đối tượng và phương pháp: Phân tích đột biến gen F8 ở hai bệnh nhân nam mắc bệnh Hemophilia A ở thể  nặng đã được chẩn đoán trên lâm sàng. DNA từ máu ngoại vi của bệnh nhân sau khi tách chiết được dùng làm  khuôn cho phản ứng PCR với 33 cặp mồi nhằm khuếch đại toàn bộ 26 exon và vùng nối intron – exon của gen  F8. Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng nhằm xác định  các đột biến gây bệnh.  Kết quả: Trong hai bệnh nhân nam tham gia vào nghiên cứu, một bệnh nhân được xác định mang đột biến  dịch khung do mất 4 nucleotid ở exon 14. Bệnh nhân còn lại mang đột biến thay thế nucleotide T bằng A cũng  trên exon 14, đột biến này tạo ra một stop codon làm ngừng quá trình phiên mã ngay tại vị trí đột biến.   Kết luận: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế 33 cặp mồi và chẩn hóa thành công quy trình phản  ứng PCR và giải trình tự các vùng mã hóa của gen F8. Với quy trình này, chúng tôi cũng xác định được đột  biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A trên hai bệnh nhân nam. Trong hai đột biến được xác định, một đột biến vô  nghĩa chưa từng được công bố trên các cơ sở dữ liệu về Hemophilia A.  Từ khoá: Hemophilia A, gen yếu tố 8, đột biến.  ABSTRACT  ESTABLISH PROTOCOL FOR DIAGNOSIS OF MUTATION IN FACTOR VIII ENCODING GENE  CAUSING HEMOPHILIA A  Nguyen Ngoc Minh, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Thi Bang Suong  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 18‐ 23  Introduction: Hemophilia A is an X‐linked congenital bleeding disorder caused by Factor VIII deficiency.  Different mutations  including point mutations, deletions,  insertions and  inversions have been  reported  in  the  FVIII gene, which cause hemophilia A.  Objectives: Establish a standard protocol to diagnose and identify genetic mutations that cause Hemophilia  A disorder by PCR and Sequencing methods.   * Đại học Y Dược TP.HCM   Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương,   ĐT: 0914007038,   Email: suongnguyenmd@gmail.com.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  20 Methods: Two male patients’ peripheral blood samples were collected to conduct the research. These patients  have severe Hemophilia A symptoms. DNA from blood samples were extracted using Quiagen Kit and performed  PCR with  33  pair  of  primers  in  order  to  amplify  26  exons with  exon‐intron  boundaries  regions. The PCR‐ amplified fragments were then subjected to Sequencing analysis.   Results:  In the current study, with the use of PCR and sequencing analysis, we identified a 4‐nt deletion  mutant occurring in exon 14 of the FVIII gene and a nonsense mutant caused by a substitution of A for T in exon  14.  This  mutation  that  cause  a  premature  stop‐codon  at  732  has  not  previously  been  reported  in  the  F8  Hemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) database.  Conclusion: We have successfully designed the primer set for amplification the whole functional FVIII gene  and standardized the diagnostic protocol for FVIII gene mutant. In addition, we detected a nonsense mutant that  has not been report before on the HAMSTeRS database.   Keywords: Factor VIII, Hemophilia A, deletion, frame shift, nonsense mutants.  ĐẶT VẤN ĐỀ   Bệnh ưa chảy máu Hemophilia A là bệnh di  truyền lặn liên kết NST X gây ra do đột biến gen  yếu tố VIII (F8) ‐ gen chịu trách nhiệm tổng hợp  protein FVIII tham gia vào con đường đông máu  nội sinh(4). Do không có cặp gen tương đồng trên  NST Y nên người nam dễ mắc bệnh hơn người  nữ do  chỉ  cần mang một  gen  đột  biến  là  biểu  hiện bệnh. Người nữ dị hợp  sẽ không  có biểu  hiện bệnh nhưng khả năng di  truyền gen bệnh  cho  thế hệ sau, đặc biệt  là cho con  trai, rất cao.  Trong các bệnh rối loạn đông máu, Hemophilia  A  là  bệnh  phổ  biến  nhất  với  tỷ  lệ  ước  tính  khoảng 1/5000 tới 1/10000 nam giới(8).   Thể  bệnh  nặng  hay  nhẹ  phụ  thuộc  vào  số  lượng các yếu tố đông máu trong máu. Nồng độ  yếu  tố VIII  ở người bình  thường  là 200 ng/ml.  80% bệnh nhân Hemophilia A mắc bệnh  ở  thể  nặng (< 1% yếu  tố đông máu), bệnh được phát  hiện trong hai năm đầu của trẻ; 10% bệnh nhân  ở thể bệnh trung bình (1‐5% yếu tố đông máu),  bệnh được phát hiện khi  trẻ  từ 5  tới 6  tuổi; và  10% bệnh nhân ở thể bệnh nhẹ (>5% yếu tố đông  máu), bệnh nhân thường không được phát hiện  bệnh sớm. Triệu chứng lâm sàng của bệnh khác  nhau ở các bệnh nhân với  thể bệnh khác nhau.  Thể bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất huyết  xảy  ra  càng  sớm. Triệu  chứng  lâm  sàng  thông  thường là hiện tượng chảy máu kéo dài hay gặp  nhất ở các khớp cổ tay, cổ chân, chảy máu dưới  da, chảy máu cơ, chảy máu nội tạng, chảy máu  do  chấn  thương  dù  rất  nhẹ  và  khó  cầm máu.  Hiện tượng chảy máu khớp kéo dài và tái phát  nhiều lần có thể dẫn tới biến chứng teo khớp, teo  cơ, lâu dần làm mất chức năng vận động. Bệnh  nhân cần được chẩn đoán bệnh càng sớm càng  tốt và được điều trị bằng cách truyền chế phẩm  máu.  Bản  đồ  của gen F8  được  công bố vào năm  1984, gen nằm trên cánh dài của NST X (Xq28).  Gen F8 gồm 26 exons  có  chiều dài 186 kb, mã  hóa cho protein FVIII gồm 2332 acid amin(5). Có  rất nhiều đột biến gen F8 đã được xác định, phổ  biến  là  đột biến  đảo  đoạn  intron 22 gây  ra 40‐ 50% ca bệnh Hemophilia A thể nặng và đột biến  đảo  đoạn  intron  1  gây  ra  5‐7%  ca  bệnh  thể  nặng(11). Những trường hợp còn lại mắc bệnh do  nhiều đột biến điểm và đột biến tái sắp xếp gen  nhỏ khác nhau rải rác trên khắp hệ gen(14). Theo  các  nghiên  cứu,  90‐95%  các  bệnh  nhân  hemophilia  A  thể  vừa  và  nhẹ mang  đột  biến  điểm và dạng đột biến này xuất hiện ở 50‐55%  các bệnh nhân  thể nặng(2). Cho  tới nay, có hơn  2100 đột biến trong vùng mã hoá của gen F8 đã  được công bố(9).  Nguy  cơ  trẻ mắc  bệnh Hemophilia A  bẩm  sinh phụ thuộc vào tình trạng của mẹ. Nếu mẹ  là người lành mang gen bệnh, 50% con trai sẽ có  nguy cơ mang gen F8 đột biến của mẹ và biểu  hiện bệnh. 50% con gái thừa hưởng gen đột biến  của mẹ  trở  thành người  lành mang bệnh. Bệnh  nhân nam di  truyền gen bệnh cho  toàn bộ con  gái của mình. Khoảng 1/3 các trường hợp là do  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 21 đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao  tử ở bố hoặc mẹ. Chẩn đoán chính xác và điều  trị  sớm  căn  bệnh  này  có  ý  nghĩa  quan  trọng  nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng  như giảm thiểu nguy cơ tàn tật cho bệnh nhân.  Tiến bộ của các kỹ thuật sinh học phân tử ngày  nay cho phép phân  tích DNA để phát hiện đột  biến gen gây bệnh, phát hiện người  lành mang  bệnh và ứng dụng  trong chẩn  đoán  trước  sinh  và tư vấn di truyền.   Ở Việt Nam, cho đến nay đã có nhiều công  trình  nghiên  cứu  về  bệnh Hemophilia A,  chủ  yếu là các nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, cận  lâm  sàng,  đánh  giá  tỷ  lệ  mắc  bệnh  hay  các  nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bằng  các chế phẩm thay thế Gần đây, một số tác giả  đã  định hướng phân  tích gen FVIII nhưng  các  nghiên cứu mới chỉ là bước đầu. Tại Thành phố  Hồ  Chí Minh,  các  bệnh  viện  có  chuyên  khoa  Huyết học  chưa  chẩn  đoán  được  đột biến gen  FVIII cũng như tiến hành chẩn đoán trước sinh  bệnh hemophilia A, gây hạn chế  trong  điều  trị  và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình  và không kiểm soát được sự lan truyền gen bệnh  trong  cộng  đồng.  Xuất  phát  từ  thực  tiễn  đó,  chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình  giải  trình  tự  chẩn  đoán  đột biến  điểm  của  gen  yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A”.  ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Hai mẫu máu  ngoại  vi  của  hai  bệnh  nhân  nam  đã  được  chẩn  đoán  lâm  sàng mắc  bệnh  Hemophilia A.   Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Sử dụng phần mềm chuyên dụng thiết kế 33  cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ 26 exon,  các vùng lân cận vị trí nối intron của gen yếu tố  8.  Các  cặp  mồi  được  thiết  kế  không  có  hiện  tượng SNP (single nucleotide polymorphism) và  có nhiệt độ gắn mồi xấp xỉ nhau.  Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi   Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh  nhân. Máu  tươi được chống đông bằng EDTA,  được  tách  chiết DNA  trong  vòng  24  giờ. Quy  trình  tách  chiết  DNA  từ  200μl  máu  ngoại  vi  được tiến hành theo QiAgen Kit. Đo nồng độ và  độ tinh sạch của DNA, những mẫu có giá trị tỷ  lệ về mật độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥  1,8 mới được sử dụng  làm khuôn để  tiến hành  phản ứng PCR và giải trình tự gen.  Kỹ thuật giải trình tự gen  Tiến  hành  các  phản  ứng  PCR  khuếch  đại  toàn bộ 26 exon và các vị trí nối intron‐ exon của  gen  F8.  Thành  phần  của  phản  ứng  PCR  gồm  50μl  chứa  các  thành  phần:  200‐300  ng  khuôn  mẫu DNA’  0.2 mmol.l  dNTP;  20 mmol/l  Tris‐ HCl  (pH 8.4); 125 ng mỗi mồi và 2 đơn vị Taq  polymerase.   Tinh  sạch  sản  phẩm  PCR  và  giải  trình  tự  từng  đoạn  gen  được  khuếch  đại  bằng  cả mồi  xuôi và mồi ngược.  Phân tích kết quả giải trình tự  Xác  định  đột  biến,  kiểm  tra  khả  năng  gây  bệnh  của  các  đột biến bằng những phần mềm  chuyên dụng.  Hình 1 là kết quả giải trình tự exon 14 bằng  mồi xuôi của bệnh nhân 01 cho thấy gen F8 của  bệnh  nhân  này  bị  đột  biến  mất  4  nucleotid  TAGA, tại vị trí c.4121‐4124del, đột biến gây lệch  khung dịch mã (frameshift) và làm thay đổi cấu  trúc  protein  F8:  pIle1374thrfs*49.  Kết  quả  giải  trình tự exon 14 bằng mồi ngược khẳng định lại  đột biến này. Đột biến này đã được Lin công bố  lần  đầu  tiên  vào  năm  1993  trên  tạp  chí  Genomics(10).  Kết quả giải  trình  tự gen F8 của bệnh nhân  02 cho thấy bệnh nhân mang đột biến thay thế T  bằng  A  tại  codon  732  trên  exon  14  (Hình  2).  Codon  bình  thường  trên Genbank  là  TAT mã  hóa  cho  acid  amin Tyrosine  bị  đột  biến  thành  trình tự TAA, đột biến thay nucleotit này đã tạo  thành stop codon, làm kết thúc quá trình phiên  mã ngay tại vị trí đột biến.   Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  22 KẾT QUẢ  Bệnh nhân 01  Hình 1: Kết quả giải trình tự exon 14 của bệnh nhân 01.  Bệnh nhân 02  Hình 2: Kết quả giải trình tự gen F8 của bệnh nhân HA 02.  BÀN LUẬN  Hemophilia A  là  bệnh  chảy máu  do  thiếu  yếu  tố  đông  máu  VIII.  Bệnh  có  tính  chất  di  truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X.  Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII (FVIII) là một  trong  những  gen  lớn  với  26  exon  trong  đó  2  exon  lớn nhất  là exon 14  (3106 bp) và  exon 26  (1958 bp). Trong một nghiên  cứu  thống kê dữ  liệu đột biến 845 gia đình có người nhà là bệnh  nhân hemophilia A, Oldenburg và  cộng  sự  đã  chỉ  ra  rằng  các  dạng  đột  biến  điểm  (thay  thế  nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa)  chiếm tỉ lệ cao nhất (47,5%) tiếp đến là dạng đột  biến  đảo  đoạn  bao  gồm  đảo  đoạn  intron  1và  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 23 intron 22  (36,7%),  còn  lại  là  đột biến xóa  đoạn  gen chiếm khoảng 10‐15%(12). Tùy thuộc vào kiểu  và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể  bệnh nặng nhẹ khác nhau. Việc xác định các đột  biến gây bệnh Hemophilia không dễ dàng vì các  đột biến phần  lớn  là đột biến điểm nằm rải rác  trên suốt chiều dài của gen F8. Do đó, trong các  kỹ thuật xác định đột biến gen F8, phương pháp  giải  trình  tự gen  thường được sử dụng hơn cả.  Trong  nghiên  cứu  này,  chúng  tôi  đã  sử  dụng  phương pháp giải  trình  tự  trực  tiếp  sản phẩm  PCR 26 exon của gen F8 trên hai bệnh nhân mắc  bệnh Hemophilia A.   Ở bệnh nhân  thứ nhất,  chúng  tôi  xác  định  được  đột  biến mất  4  nucleotid  tại  codon  1355  trên exon 14 của bệnh nhân này. Mất nucleotide  hay mất đoạn trên vùng mã hóa của gen thường  gây đột biến dịch khung và một nửa các đột biến  này thường xảy ra trên exon lớn là exon 14. Hầu  hết  các  đột  biến  mất  nucleotid  trên  gen  F8  thường  làm  giảm  nồng  độ  và  hoạt  tính  của  protein FVIII và do đó, gây ra bệnh Hemophilia  A(6). Bệnh nhân  01 mang  đột  biến này  có  biểu  hiện bệnh  thể nặng  trên  lâm sàng với nồng độ  protein  FVIII  dưới  1%.  Trong  5  trường  hợp  mang đột biến này đã được công bố  trên cơ sở  dữ  liệu  quốc  tế,  4  trường  hợp  đều  biểu  hiện  bệnh ở thể nặng, chỉ có 1 trường hợp biểu hiện ở  thể trung bình với nồng độ protein FVIII  là 2%  công  bố  vào  năm  2010  bởi  Abdul‐Ghafar  và  cộng sự(1).  Kết  quả  giải  trình  tự  gen  FVIII  của  bệnh  nhân 02 cho thấy có xuất hiện đột biến thay thế  nucleotide  T  bằng A  tại  vị  trí  codon  732  trên  exon  14.  Đột  biến  này  làm  thay  đổi  trình  tự  codon  TAT  mã  hóa  cho  acid  amin  Tyrosine  thành TAA, tạo ra stop codon ngay tại vị trí này.  Sự  thay  đổi  này  làm  cho  protein  FVIII  không  được  tổng  hợp  hoàn  chỉnh  mà  chỉ  tổng  hợp  được 732 acid amin.   Protein  yếu  tố  VIII  chứa  2332  acid  amin  sắp xếp  thành 6 vùng  là A1‐A2‐B‐A3‐C1‐C2(7)  (Hình 3).  Hình 3: Trình tự mã hóa các vùng của protein FVIII  trên gen.  Protein  yếu  tố  VIII  lưu  thông  trong  máu  gồm hai  chuỗi polypeptide: một  chuỗi nhẹ với  trọng  lượng  phân  tử  80.000 Da  và một  chuỗi  nặng  có  trọng  lượng  phân  tử  là  200.000  Da.  Chuỗi nặng bao gồm tiểu phần A1 (từ codon 1‐ 336), vùng mang tính acid a1 (từ codon 337‐372),  vùng A2 (từ codon 373‐710) và vùng mang tính  acid a2  (từ codon 711‐740). Vùng A3  (từ codon  1690‐2019), vùng C1 (codon 2020‐2172) và vùng  C2  (codon 2173‐2332)  tạo nên chuỗi nhẹ. Vùng  C2 là vị trí liên kết màng tế bào của protein yếu  tố FVIII và cũng là vị trí tương tác với yếu tố von  Willebrand(13).   Ở bệnh nhân 02,  codon  đột biến 732  thuộc  vùng a2 cấu thành nên chuỗi nặng. Đột biến này  làm cho quá  trình  tổng hợp protein yếu  tố VIII  dừng ngay tại codon 732, do đó, protein yếu tố  VIII  của  bệnh  nhân  02  hoàn  toàn  không  có  những  vùng  còn  lại.  Đột  biến  này  khiến  cho  protein  không  hoàn  chỉnh  và  không  thể  thực  hiện chức năng trong quá trình đông máu. Điều  này  khiến  cho  bệnh  nhân  biểu  hiện  bệnh  Hemophilia A ở thể nặng.  Hiện  nay,  trên  cơ  sở  dữ  liệu  thế  giới  về  Hemophilia A và  các  đột biến  trên gen FVIII  (F8  Hemophilia  A  Mutation,  Structure,  Test  and  Resource  Site  – HAMSTeRS  ‐  database),  chưa có công bố nào về đột biến vô nghĩa  tại  codon  732.  Bằng  phương  pháp  giải  trình  tự  trực  tiếp gen F8, chúng  tôi  đã ghi nhận  được  đột biến này lần đầu tiên.   Trong  những  nghiên  cứu  tiếp  theo,  chúng  tôi sẽ  tiếp  tục phân  tích gen F8 cho mẹ, chị em  gái của bệnh nhân 01 và 02, đặc biệt tại các vị trí  phát hiện đột biến trên exon 14 nhằm phân tích  di truyền cho gia đình có gen bệnh và đưa ra các  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  24 tư vấn di  truyền  thích hợp, nếu người nhà của  gia  đình  có  kế  hoạch  sinh  con.  Bên  cạnh  đó,  chúng  tôi  cũng  sẽ  xây  dựng  và  chẩn  hóa  quy  trình chẩn đoán  truớc sinh các đột biến gen F8  gây bệnh Hemophilia A từ dịch ối thai nhi.   KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  này  đã  xây  dựng  thành  công  quy  trình chẩn đoán đột biến gen yếu  tố FVIII  gây bệnh Hemophilia A và phát hiện được hai  đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A trên hai  bệnh  nhân  nam,  bao  gồm một  đột  biến  dịch  khung do mất  4 nucleotid và một  đột biến vô  nghĩa do  tạo  thành  stop  codon. Trong  đó,  đột  biến vô nghĩa chưa từng được công bố trên các  cơ sở dữ liệu về Hemophilia A.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Abdul‐Ghafar  A, Bogdanova  N, Lim  LC, Zhao  Y, Markoff  A, Tien  SL  (2010). Ten novel  factor VIII  (F8C) mutations  in  eighteen  haemophilia  A  families  detected  in  Singapore,  Haemophilia, 16(3):551‐3.  2. Anne Goodeve. Moleculer Genetic  testing of Hemophilia A  (2008). Seminar in thrombosis an Hemostasis; 34 (6): 491‐501.  3. Antonarakis SE, Kazazian HH and Tuddenham EGD (1995).  Molecular ethiology of factor VIII deficiency in hemophilia A.  Hum. Mutat., 5:1–22.  4. Azza AGTantawy  (2010). Molecular  genetics  of hemophilia  A:  Clinical  perspectives.  The  Egyptian  Journal  of  Medical  Human Genetics 11: 105–114.  5. Brower C,  Thompson AR  (2000). Hemophilia A.  In: Pagon  RA, Bird TC, Dolan CR, Stephens K, editors. GeneReviews.  Seattle (WA): University of Washington, Seattle.  6. Geoffrey KC, Edward GD, Adam  IW  (1998). The  factor VIII  structure  and  mutation  resource  site:  HAMSTeRS  Version  4. Nucleic Acids Res, 26:216–9.  7. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, Wion KL, Chen EY, Eaton  DH, Vehar GA, Capon DJ, Lawn RM (1984). Characterization  of the human factor VIII gene. Nature, 312: 326–330.  8. Hedner,  Ulla,  Ginsburg,  David,  Lusher,  Jeanne  M.,  High,  Katherine A (2000). Congenital Hemorrhagic Disorders: new  insights  into  the  pathophysiology  and  treatment  of  hemophilia. Hematology 2000: 241–65.  9.   10. Lin  SW,  Lin  SR  and  Shen MC  (1993).  Characterization  of  genetic defects of hemophilia A in patients of Chinese origin.  Genomics 18: 496‐504.  11. Margaglione  M,  Castaman  G,  Morfini  M,  Rocino  A,  Santagostino  E,  Tagariello  G,  et  al.  Mannucci  PM;  AICE‐ Genetics  Study  Group  (2008).  The  Italian  AICE‐Genetics  hemophilia A database:  results and  correlation with  clinical  phenotype. Haematologica, 93(5):722–8.  12. Oldenburg  J, El‐Maarri  O  (2006).  New  insight  into  the  molecular basis of hemophilia A. Int J Hematol., 83(2):96‐102.  13. Pratt KP,  Shen  BW,  Takeshima K, Davie  EW,  Fujikawa K,  Stoddard BL.  (1999). Structure of  the C2 domain of human  factor VIII at 1.5 Å resolution. Nature, 402: 439–442.  14. Xue F, Zhang L, Sui T, Ge J, Gu D, Du W, et al (2010). Factor  VIII  gene  mutations  profile  in  148  Chinese  hemophilia  A  subjects. Eur J Haematol., 85(3):264–72.  Ngày nhận bài       29/8/2013.  Ngày phản biện nhận xét bài báo   04/9/2013.  Ngày bài báo được đăng:    18/10/2013