Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nang bổ khí hoạt huyết

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 224 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM VIÊN NANG BỔ KHÍ HOẠT HUYẾT Lâm Bích Thảo*, Dương Thị Mộng Ngọc*, Nguyễn Phương Dung** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Dựa vào những bài thuốc cổ truyền và những thành tựu nghiên cứu khoa học gần đây về các thảo dược, chế phẩm viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết” đã được các nhà nghiên cứu của Khoa Y học Cổ truyền - Đaị học Y Dược TP. HCM điều chế. Chế phẩm này được dùng để nghiên cứu về tác dụng ổn định lipid máu trên các bệnh nhân rối loạn chuyển hóa lipid. Mục tiêu: Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nang Bổ khí hoạt huyết làm cơ sở cho các nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng tiếp theo.. Phương pháp: Định tính các hợp chất saponin, alkaloid, flavonoid và paeoniflorin bằng phản ứng hoá học và sắc kí lớp mỏng. Định lượng paeoniflorin trong chế phẩm bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến. Kết quả: Đã xây dựng được tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết. Định tính bằng phản ứng hoá học và sắc ký lớp mỏng cho thấy trong chế phẩm có sự hiện diện của các hợp chất saponin, flavonoid, alkaloid và paeoniflorin. Lượng paeoniflorin trong một viên nang là 6,3 mg. Kết luận: Viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết đã được tiêu chuẩn hóa giúp ích cho việc ổn định quy trình sản xuất cũng như ổn định chất lượng sản phẩm. Phương pháp phân tích này đáng tin cậy. Kết quả của nghiên cứu này sẽ được áp dụng cho các nghiên cứu triển khai tiếp theo. Từ khoá:Viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết, paeoniflorin. ABSTRACT STUDY ON THE STANDARDIZATION OF BO KHI HOAT HUYET CAPSULES Lam Bich Thao, Duong Thi Mong Ngoc, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 224 – 229 Background: Based on folk remedies and recently scientific achievements in traditional medicine, the preparation “Bo Khi Hoat Huyet capsule” was prepared by the researchs from Faculty of Traditional Medicine - University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City. The hypocholesterolemic effect on dyslipidemic patients will be investigated in clinical trials. Objectives: The aim of the study was to build the standard for analyzing the Bo Khi Hoat Huyet capsules Methods: Chemical reactions and thin layer chromatography were used to identify the presence of saponins, alkaloids, flavonoids and paeoniflorin in Bo Khi Hoat Huyet capsules. Quantitatitive determination of paeoniflorin in the capsules was carried by spectrophotometric method.. Results: Standards for testing of Bo Khi Hoat Huyet capsules were establised. Identification by chemical reactions and TLC showed the presence of saponin, alkaloid, flavonoid compounds and paeoniflorin in the product. Amount of paeoniflorin in a capsule was determined to be 6.3 mg. Conclusions: The Bo Khi Hoat Huyet capsules have been standardized for stabilizing the producing process  Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. HCM ** Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược Tp. HCM Tác giả liên lạc: DS Lâm Bích Thảo ĐT: 0909325233 Email: thaonhi19842002@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 225 as well as the quality of product. The analytical method was proven to be reliable. This result is used to further study. Keywords: Bo Khi Hoat Huyet capsules, paeoniflorin. ĐẶT VẤN ĐỀ Bổ Khí Hoạt Huyết (BKHH) có nguồn gốc từ bài thuốc cổ truyền Bổ Dương Hoàn Ngũ Thang, gia thêm Nhân sâm, Bạch thược. Bài thuốc đã được sử dụng tại Cơ sở 3 – Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM theo hướng phòng chống tăng cholesterol máu dưới dạng viên hoàn cứng. Hạn chế của dạng bào chế cổ truyền này là người bệnh phải uống số lượng khá lớn viên hoàn 15 – 30 viên/ lần, không thuận tiện khi sử dụng điều trị dài ngày Để tiện lợi hơn trong việc sử dụng thuốc cho người bệnh, Bộ môn Bào chế Đông dược – Đại học Y Dược TPHCM đã nghiên cứu chuyển từ dạng hoàn sang dạng viên nang cứng với thành phần và công dụng tương tự như dạng bào chế cũ. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi áp dụng các phương pháp lý hóa để khảo sát độ ẩm, độ tro, độ rã, định tính các nhóm hoạt chất chủ yếu có trong chế phẩm. Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để xác định sự hiện diện của các dược liệu trong thành phần chế phẩm. Đồng thời, áp dụng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 228 nm để định lượng hoạt chất paeoniflorin – hoạt chất có tác dụng hạ cholesterol máu của Bạch thược, Xích thược 7 trong viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết. Từ đó, góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm trong các nghiên cứu triển khai, tiến tới giới thiệu một sản phẩm mới cho cộng đồng. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết (BKHH) được sản xuất bởi Bộ môn Bào chế Đông dược – Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TPHCM. Thành phần gồm 9 dược liệu (Hoàng kỳ, Hồng hoa, Đào nhân, Nhân sâm, Đương qui, Địa long, Xích thược, Bạch thược, Xuyên khung): NSX 170810, mỗi lọ chứa 50 viên nang số 0. Bột trong nang có màu nâu đậm, vị nhẫn đắng, mùi thơm đặc trưng. Phương tiện Hóa chất: methanol (TQ và Merck); anhydric acetic (Merck); ethyl acetate (TQ và Merck); chloroform (TQ); paeoniflorin chuẩn (Sigma - Aldrich, 099K1305, độ tinh khiết ≥ 98%).Dụng cụ: máy siêu âm (lma, LC60H); tủ sấy; bể cách thủy; bình sắc kí; cân 4 số lẻ (Mettler Tolerdo, AB204); máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Thermo Spectronic - Heios ) Phương pháp khảo sát độ ẩm, độ tan rã, độ đồng đều khối lượng1 Khảo sát độ ẩm (mất khối lượng do sấy khô) theo DĐVN IV, mục 9.6, trang PL-182: Cân 0,5g bột chế phẩm, sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.Khảo sát độ tan rã theo DĐVN IV, mục 11.6, trang PL-226: Thực hiện với 6 viên lấy ngẫu nhiên, trong môi trường nước.Khảo sát độ đồng đều khối lượng theo DĐVN IV, mục 11.3, trang PL-221 (khối lượng trung bình viên ± 7,5%): Thực hiện với 20 viên nang lấy ngẫu nhiên. Định tính bằng phương pháp hóa học Thực hiện các phản ứng hóa học để xác định sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin trong chế phẩm.Hợp chất alkaloid: Dùng dịch chiết H2SO4 5% của 5 g bột chế phẩm, siêu âm 30 phút, làm các phản ứng màu với thuốc thử (TT) đặc trưng của hợp chất alkaloid (Mayer, Bouchardat, Dragendroff).Hợp chất flavonoid: Dùng dịch chiết ethanol 96% của 5 g bột chế phẩm, siêu âm nóng 30 phút, làm các phản ứng màu đặc trưng của hợp chất flavonoid (NaOH 10%, FeCl3 10%, chì acetat 5%).Hợp chất saponin: Cân khoảng 5 g bột chế phẩm, thêm 20 ml ethanol 96%, siêu âm nóng 30 phút, lọc. Lấy 2 ml dịch lọc cô đến cắn. Hòa cắn với 0,5 ml anhydric acetic, 1 ml chloroform và cho vào ống Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 226 nghiệm, cho từ từ vào ống nghiệm H2SO4 đđ (phản ứng Lieberman). Định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng6 Dung dịch mẫu thử Hoàng kỳ, Đào nhân, Hồng hoa: Cân 20 g bột chế phẩm hoặc dược liệu, thêm 200 ml nước cất, đun sôi 20 phút, cách thủy 30 phút, lọc qua bông, để nguội. Lắc dịch lọc với ether ethylic (3 lần x 100ml). Tập trung dịch ether ethylic cô còn 2ml dùng để làm dung dịch chấm sắc kí. Dung dịch mẫu thử Địa long, Xuyên khung: Cân 20 g bột chế phẩm hoặc dược liệu. thêm 200 ml nước cất, đun sôi 20 phút, cách thủy 30 phút, lọc qua bông, để nguội. Dịch lọc lắc với ether ethylic (3 lần x 100 ml). Lấy phần dịch nước lắc tiếp với chloroform (3 lần x 100 ml), loại dịch chloroform. Lấy phần dịch nước lắc với ethyl acetat (3 lần x 100 ml). Tập trung dịch ethyl acetat cô còn 2 ml dùng làm dung dịch chấm sắc kí Dung dịch mẫu thử Xuyên khung: Cân 20 g bột chế phẩm hoặc dược liệu, thêm 200 ml nước cất, đun sôi 20 phút, cách thủy 30 phút, lọc qua bông, để nguội. Dịch lọc được lắc với ether ethylic (3 lần x 100 ml), loại dịch ether ethylic. Dịch nước được lắc tiếp với chloroform (3 lần x 100 ml). Tập trung dịch chloroform cô còn 2ml dùng làm dung dịch chấm sắc kí. Dung dịch mẫu thử Nhân sâm: Cân 5 g bột chế phẩm hoặc dược liệu, thêm 50 ml methanol, siêu âm 30 phút, lọc. Tập trung dịch lọc, cô còn 2ml dùng để làm dung dịch chấm sắc kí. Dung dịch mẫu thử Bạch thược, Xích thược: Cân 5 g bột chế phẩm hoặc dược liệu, thêm 50 ml ethanol 96%, siêu âm 30 phút, lọc. Tập trung dịch lọc, cô còn 2 ml dùng để làm dung dịch chấm sắc kí. Điều kiện sắc kí: Bản mỏng nhôm Silicagel 60F254 (dày 0,25 mm, 20 x 20 cm) Merck, Germany. Các hệ dung môi khai triển Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:8:0,5) để xác định sự hiện diện của Địa longToluen – ethyl acetat – acid formic – nước (10:3:2:1) để xác định sự hiện diện của Đương qui Chloroform – ethyl acetat (9:1) để xác định sự hiện diện của Xuyên khung, Hồng hoa Toluen – ethyl acetat (5:5) để xác định sự hiện diện của Hoàng kỳ, Đào nhân, Chloroform – ethyl acetat – methanol – nước (40:5:10:0,2) để xác định sự hiện diện của Bạch thược, Xích thược n-Butanol- acid acetic- nước (7:1:2) để xác định sự hiện diện của Nhân sâm Thể tích chấm: 20µl dung dịch dược liệu đối chiếu, 20µl dung dịch chế phẩm, 5 µl dung dịch paeoniflorin chuẩn Phát hiện Soi UV 254 nm, 365 nm để phát hiện vết Đào nhân, Địa long, Xuyên khung, Hồng hoa, Đương qui Thuốc thử Anisaldehyd, 1050C để phát hiện vết Địa long, Hồng hoa Thuốc thử H2SO4 10% / cồn, 1050C để phát hiện vết Nhân sâm Thuốc thử Vanillin 5%/H2SO, 1050C để phát hiện vết Hoàng kỳ, Bạch thược, Xích thược. Định lượng paeoniflorin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ dựa vào đường cong chuẩn của paeoniflorin chuẩn trong methanol Thiết lập giai mẫu: Cân chính xác 2 mg paeoniflorin chuẩn, hòa tan trong 10 ml methanol. Dùng micro pipette lấy chính xác dung dịch chuẩn có thể tích lần lượt là 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol tới vạch, lắc đều. Đo quang trên máy quang phổ tử ngọai khả kiến Thermo Spectromic HEIOS (max = 228 nm). Dịch methanol: Cân chính xác 0,5g bột chế phẩm, chiết kiệt nhiều lần bằng methanol. Cô dịch chiết còn khoảng 100 ml và qui vào bình định mức 100 ml, lắc đều. Dùng micro pipet hút chính xác 1 ml dịch chiết cô đến cắn. Hòa cắn bằng methanol vào bình định mức 10ml và thêm methanol tới vạch, lắc đều. Đo quang ở max = 228 nm. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 227 Công thức xác định lượng hoạt chất tính theo paeoniflorin trong mẫu thử dựa vào đường chuẩn y= 0,007x - 0,0069 310100 007,0 0069,0 )/(    x p b xx A viênmgC t Trong đó:At: Độ hấp thu của mẫu thử.b: Khối lượng trung bình bột chế phẩm trong 1 viên (g)p: Khối lượng bột chế phẩm thử (g) KẾT QUẢ Độ ẩm, độ rã, độ đồng đều khối lượng của viên nang BKHH Bảng 1: Độ ẩm, thời gian rã, độ đồng đều khối lượng của viên nang BKHH Chỉ tiêu Số lần lặp lại thí nghiệm Trung bình Yêu cầu phải đạt Độ ẩm (%) 3 7,25 ± 0,02 ≤ 9 Thời gian rã (phút) 6 5,33 ± 0,77 ≤ 30 Khối lượng trung bình bột thuốc trong 1 viên (g) 20 0,4866 ± 0,0074 Độ đồng đều khối lượng (g) 20 0,4501- 0,5231 ± 7,5 % KLTB viên Độ ẩm của viên nang BKHH là 7,25%Thời gian rã trung bình của viên nang BKHH là 5,33 phút <30 phút, đạt yêu cầu về độ rã của viên nang theo quy định của Dược điển Việt Nam IV.Khối lượng bột thuốc trong mỗi viên nang rung bình nằm trong khoảng 0,4501 g - 0,5231 g, nằm trong giới hạn cho phép (± 7,5% khối lượng trung bình viên)n đạt yêu cầu về độ đồng đều khối lượng theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Định tính bằng phương pháp hóa học Bảng 2: Kết quả định tính các hợp chất có trong viên nang BKHH bằng phương pháp hóa học Hợp chất Chế phẩm Kết quả Alkaloid Có tủa trắng với thuốc thử Mayer + Có tủa cam với thuốc thử Dragendorff + Có tủa nâu vớu thuốc thử Bouchardat + Flavonoid Dung dịch tăng màu với NaOH 10% ++ Dung dịch có màu xanh rêu với FeCl3 ++ Dung dịch có tủa trắng với chì acetat 5% ++ Saponin Vòng ngăn cách có màu nâu đỏ ++ Trong viên nang BKHH có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin Định tính bằng sắc kí lớp mỏng Bảng 3: Sắc kí đồ của viên nang BKHH với các nguyên liệu đối chiếu Nguyên liệu Dịch chiết chế phẩm Hệ dung môi Phát hiện Số vết nguyên liệu đối chứng Số vết chế phẩm Số vết chế phẩm trùng với nguyên liệu Hoàng kỳ Dịch chiết ether ethylic Toluen-ethyl acetat (5:5) Phun TT vanillin 18 12 2 Đào nhân Dịch chiết ether ethylic Toluen-ethyl acetat (5:5) Soi UV 366nm Phun TT vanillin 8 12 3 Địa long Dịch chiết ethyl acetat Toluen -ethyl acetat-acid formic (20:8:0,5) Soi UV 254nm, 366nm Phun vanillin 7 6 2 Xuyên khung Dịch chiết Cloroform Cloroform-ethylacetat (9:1) Soi UV 366nm 7 8 2 Hồng hoa Dịch chiết ether ethylic Cloroform-ethylacetat (9:1) Soi UV 254nm, 366nm Phun vanillin 8 7 1 Đương qui Dịch chiết ether ethylic Toluen:ethyl acetat:acid formic:nước (10:3:2:1) Soi UV 254nm, 366nm 4 3 2 Nhân sâm Dịch chiết methanol n-BuOH-acid acetic-nước (7:1:2) Phun TT H2SO4 10% trong EtOH 96% 9 8 2 Bạch thược Dịch chiết ethanol 96% Cloroform-ethyl acetat - methanol -nước (40:5:10:0,2) Phun TT vanillin 12 10 1 Xích thược Dịch chiết ethanol 96% Cloroform-ethyl acetat- methanol-nước (40:5:10:0,2) Phun TT vanillin 12 10 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 227 Kỹ thuật phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã chứng minh trong viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết có sự hiện diện của cả 9 dược liệu Hoàng kỳ, Hồng hoa, Đào nhân, Nhân sâm, Đương qui, Địa long, Xích thược, Bạch thược, Xuyên khung. Đặc biệt, trên hình ảnh sắc ký đồ đối chiếu với nguyên liệu Bạch thược và Xích thược cho thấy trong viên nang BKHH có một vết cùng giá trị Rf và màu sắc với giá trị Rf và màu sắc của paeoniflorin chuẩn. Đây là 1 hoạt chất có tác dụng hạ cholesterol7, bảo vệ gan 4, 5, được phân lập từ Bạch thược trồng tại Việt Nam2. Định lượng paeoniflorin trong viên nang BKHH bằng phương pháp đo quang Thẩm định đỉnh hấp thu cực đại của paeoniflorin trên máy Thermo Spectronic - Heios  Hình 1: Đồ thị biểu diễn đỉnh hấp thu cực đại của paeoniflorin Kết quả thẩm định cho thấy paeoniflorin có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 228nm, tương tự như các công bố của các tác giả trước3 Đường chuẩn paeoniflorin Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của chuẩn paeoniflorin có dạng y = ax + b Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính (Máy Thermo Spectronic - Heios ) STT Lượng paeoniflorin (µg) Mật độ quang (OD) 1 2 3 4 5 20 40 60 80 100 0,136 0,268 0,404 0,565 0,685 Hình 2. Đường thẳng hồi quy biểu diễn tính tuyến tính chuẩn paeoniflorin Nhận xét: Kết quả trên cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của chuẩn paeoniflorin theo phương trình y = 0,007 x – 0,0069 ; R2= 0,9984; trong khoảng lượng paeoniflorin từ 20 – 100 µg. Qua khảo sát cho thấy, dịch chiết MeOH của bột viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết cũng có đỉnh hấp thu của paeoniflorin ở bước sóng 228nm. Do đó, ta có thể áp dụng phương trình đường chuẩn trên để tính hàm lượng hoạt chất tính theo paeoniflorin trong viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết. Bảng 5: Hàm lượng hoạt chất tính theo paeoniflorin trong 1 viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết Lần TN Khối lượng mẫu thử Mật độ quang Hàm lượng paeoniflorin (mg/viên) 1 0,5394 0,480 6,275 2 0,5361 0,467 6,313 3 0,53399 0,496 6,269 Trung bình (mg/viên) 6,286 ± 0,03 RSD % 0,219 Lượng hoạt chất tính theo paeoniflorin trong 1 viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết là 6,3 mg. Từ những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đề nghị một số tiêu chuẩn chất lượng cho viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết (bảng 6). Bảng 6. Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết STT Tiêu chuẩn Yêu cầu 1 Mất khối lượng do sấy khô Không quá 9% 2 Độ rã Không quá 30 phút 3 Độ đồng đều khối lượng ± 7,5 % KLTB viên y = 0.007x - 0.0069 R 2 = 0.9984 0 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0 20 40 60 80 100 120 Hàm lượng paeoniflorin (µg) Độ hấp thu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 228 4 Định tính bột viên nang bằng phương pháp hóa học Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất flavonoid. Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất alkaloid. Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất saponin. 5 Định tính bột viên nang bằng sắc kí lớp mỏng Các sắc kí đồ của chế phẩm phải có sự hiện diện 9 nguyên liệu: Hoàng kỳ, Hồng hoa, Đào nhân, Nhân sâm, Đương qui, Địa long, Xích thược, Bạch thược, Xuyên khung 6 Định lượng paeoniflorin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại Hàm lượng paeoniflorin 5,34 - 7,23 mg/1 viên KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được từ thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:Viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết đạt các yêu cầu về độ ẩm, độ rã, độ đồng đều khối lượng theo các quy định của Dược điển Việt Nam IV.Viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết có các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponinViên nang Bổ Khí Hoạt Huyết có sự hiện diện của 9 dược liệu Hoàng kỳ, Hồng hoa, Đào nhân, Nhân sâm, Đương qui, Địa long, Xích thược, Bạch thược, Xuyên khung. Hàm lượng paeoniflorin trong mỗi viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết trung bình là 6,3 mg.Những kết quả này là một trong minh chứng cho thấy viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết sau chuyển dạng vẫn giữ được các thành phần tương tự như bài thuốc cổ truyền. Những kết quả thu được từ nghiên cứu này góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm tiêu chuẩn chất lượng viên nang Bổ Khí Hoạt Huyết, phục vụ cho các nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng tiếp theo và có triển vọng đóng góp với cộng đồng một lựa chọn mới trong phòng chống rối loạn mỡ máu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, phụ lục tr.182, 221, 226 2. Phan Văn Kiệm, Phạm Hải Yến, Nguyễn Xuân Nhiệm (2007), Paeoniflorin và benzoylpaeoniflorin phân lập từ cây Bạch thược, tạp chí Hóa học, 5, tr. 570-574. 3. Koide T., Murakami M., Morita Y., Saito H., Tanimoto T., (2003), Paeoniflorin Reference Standard (Control 021) of Natrional Instritute of Health Sciences, Bull. Nalt/ Inst. Health Sci., 121, pp. 59-61. 4. Lui D.F., Wei W., Song L.H., (2006), Protective effect of Paeoniflorin on immunological liver injury induced by bacillus calmette-guerin plus lipopolysaccharide modulation of tumour necrosis factor-A and interleukin-6 mRNA, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 33, pp. 332-339. 5. Sun W. Y., Wei W., Wu L., Gui S.Y., Wang H., (2007), Effects and mechanism of extract from Paeonia lactiflora and Astragalus membranaceus on liver fibrosis induced by carbontetrachloride in rats, Journal of Ethnopharmacology, 112, pp. 515-523. 6. Wagner H., Baldl B, (1996), Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatrography Attlas, Springer, 305, pp. 335 7. Yang H.O., Ko W.K., Kim J.Y., Ro H.S., (2004), Paeoniflorin: an antihyperlipidemic agent from Paeonia lactiflora, Fitoterapia. 75(1), pp. 45-49.