Đặc điểm kiểu gen CYP21A2 của gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase thể mất muối nặng

TCNCYH 115 (6) - 2018 45 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN CYP21A2 CỦA GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASE THỂ MẤT MUỐI NẶNG Ngô Thị Thu Hương1, Nguyễn Phú Đạt1, Trần Huy Thịnh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Vân Khánh1 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2. Mục tiêu: Phân tích kiểu gen bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase thể mất muối nặng và các thành viên gia đình bằng phương pháp giải trình tự gen và MLPA. Đối tượng và phương pháp: Phân tích đột biến gen CYP21A2 cho 27 bệnh nhân và 60 thành viên gia đình bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng bằng phương pháp giải trình tự gen và MLPA. Lập phả hệ cho từng gia đình. Kết quả: 100% bệnh nhân tìm thấy đột biến, 5 loại đột biến được phát hiện, đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao 61,1%, trong đó đột biến R356W chiếm tỷ lệ cao nhất 40,7%, IVS2 - 13A/C > G chiếm 9,3%, Q318X chiếm 7,4% và S125X chiếm 3,7%; Đột biến mất đoạn chiếm tỉ lệ 38,9%. 96,7% (58/60) thành viên gia đình mang gen đột biến dị hợp tử. 100% phả hệ chỉ có 1 thế hệ bị mắc bệnh, trong đó không có gia đình có hai con cùng bị bệnh. Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, thể mất muối I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh (congenital adrenal hyperplasia) thể thiếu enzym 21-OH là bệnh lý di truyền do đột biến gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể số 6, bệnh gây nên rối loạn quá trình sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận gây bệnh cảnh lâm sàng cơn suy thượng thận cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai [1; 2]. Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự có ước tính tỷ lệ người mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể dị hợp tử là 11,2- 12,6%/1.000 hay tỷ lệ 1/83 đối với quần thể người Trung Quốc [3]. Trong khi các báo cáo khác trên thế giới thì tỷ lệ chung người mang gen dị hợp tử là 1/55 [4; 5]. Trong xã hội, phần lớn bố mẹ đều là người lành mang gen bệnh thì khả năng sinh con bị bệnh là 25%, 50% người lành mang gen bệnh. Đến nay, đã có hơn 100 đột biến đã được công bố gây bệnh trên gen CYP21A2 thường gặp là đột biến mất đoạn, chuyển đoạn, nhân đoạn, đột biến điểm trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao [2]. Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, nhưng những nghiên cứu về gen mới được công bố trong những năm gần đây. Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng, nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời làm tăng nguy cơ tử vong của trẻ hoặc di chứng bại não sau này. Nhờ sự phát triển của kỹ thuật khoa học nên phương pháp PCR, MLPA đã giúp phát hiện các đột biến mất đoạn và giải trình tự gen để phát hiện đột biến điểm giúp cho việc phát hiện sớm bệnh để điều trị Địa chỉ liên hệ: Ngô Thị Thu Hương, Bộ môn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội Email: thuhuong0380@gmail.com Ngày nhận: 26/7/2018 Ngày được chấp thuận: 30/8/2018 46 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC cho bệnh nhân, với các thành viên gia đình kết quả là bằng chứng y học để tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình khi họ mang thai giúp cho điều trị và quản lý bệnh đạt hiệu quả cao, tránh tử vong cho trẻ và giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng. Xuất phát từ thực tiễn trên, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Phân tích kiểu gen CYP21A2 của các thành viên gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase thể mất muối nặng bằng phương pháp giải trình tự gen và MLPA. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng: gồm 27 gia đình. 27 bệnh nhân bị tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng đang điều trị nội và ngoại trú tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa- Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương. 60 thành viên gia đình gồm 27 người bố, 27 người mẹ và 6 anh, chị, em ruột của bệnh nhân. Tiêu chuẩn chẩn đoán Bệnh nhân có biểu hiện mất muối, mất nước mạn tính, xạm da, Biểu hiện mơ hồ giới tính sau sinh ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai. Điện giải đồ máu có rối loạn: Na+ giảm và K+ tăng; Nồng độ 17 - OH tăng trên 10.000 ng/dl. Testosterone tăng > 1ng/ml. 2. Phương pháp Lập phả hệ cho từng gia đình: Phỏng vấn để lập phả hệ cho từng gia đình. Sử dụng các ký hiệu vẽ phả hệ theo qui định quốc tế của hội nghị di truyền người lần thứ 19. Tách chiết DNA: Mỗi thành viên được lấy 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA; DNA chiết tách từ bạch cầu lympho máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Các mẫu DNA được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano- Drop, những mẫu DNA đạt chuẩn OD280/OD260 ≥ 1,8 được sử dụng để phân tích gen. Kỹ thuật PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen CYP21A2 cho vị trí đột biến đã được xác định trước từ bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh trong gia đình, để khuếch đại vị trí đột biến. Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 90o - 10 giây, [58o - 10 giây, 55o - 15 giây, 72o - 2 phút] x 30 chu kỳ. Kỹ thuật MLPA: Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) sàng lọc 06 đột biến thường gặp: P30L (Exon 1), mất đoạn 8bp (Exon 3), I172N (Exon 4), exon 6 Cluster (Exon 6), Q318 (Exon 8), mất toàn bộ gene CYP21A2, mất đoạn 30Kb (Exon 3 hybrid). Probe hỗn hợp P050 - B2 bao gồm 5 probe cho exon 1, 3, 4, 6 và 8 của gene CYP21A2, tương đương với các đột biến mất đoạn 8bp, I172, E6 cluster và Q318. Sản phẩm khuếch đại probe, được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự để phân tích kết quả. Kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing): Sản phẩm PCR được tinh sạch và được giải trình tự trên máy ABI -3100 tại Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả được phân tích bằng phần mềm CLC. 3. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu Y học. Bệnh nhân và gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia. Bệnh nhân và gia đình được thông báo về kết quả TCNCYH 115 (6) - 2018 47 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xét nghiệm gen và được tư vấn di truyền. Các thông tin cá nhân, kết quả chẩn đoán hoàn toàn được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ Phân tích kết quả kiểu gen của 27 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 - OH ở thể mất muối nặng được thể hiện ở bảng sau. Kết quả phân tích gen ở bảng 1 cho thấy các dạng đột biến R356W có tỷ lệ cao 40,7%, IVS2 - 13A/C > G tỷ lệ: 9,3%, đột biến mất đoạn lớn tỷ lệ: 38,9%. Có 2 bệnh nhân mang 2 gen dị hợp tử trên cùng alen Q318X và R356W. Bảng 1. Kiểu gen đột biến được phát hiện ở nhóm bệnh nhân Exon/ intron Các dạng đột biến Đồng hợp tử (n) Dị hợp tử (n) % alen đột biến Intron IVS2 - 13A/C > G 2(4) 1 (1) 5 (9,3) Ex8 R356W 9 (18) 4 (4) 22 (40,7) Ex8 Q318X 0 3*(4) 4(7,4) Ex3 S125X 1(2) 0 2(3,7) - Xóa đoạn lớn 10 (20) 1(1) 21 (38,9) Tổng số đột biến 22(44) 9(10) 56/54 alen đột biến (100%) Tổng số bệnh nhân 27 (54) *: Hai đột biến dị hợp tử trên cùng 1 alen Số lượng alen mang đột biến Bảng 2. Kiểu gen đột biến được phát hiện ở nhóm các thành viên gia đình bệnh nhân Thành viên gia đình Mang gen Không mang gen Tổng số Bố 27 0 27 Mẹ 27 0 27 Anh trai 2 1 3 Chị gái 1 1 2 Em gái 1 0 1 Tổng số 58 2 60 Trong nghiên cứu này, 60 thành viên của gia đình là những người hoàn toàn bình thường về lâm sàng được xét nghiệm tìm đột biến gen, có 58/60 (96,7%) thành viên được phát hiện có mang gen đột biến; 2/60 (3,3%) thành viên không mang gen đột biến. 48 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 3. Các dạng đột biến của các thành viên gia đình bệnh nhân Điểm đột biến Bố Mẹ Chị gái Em gái Anh trai Tổng số IVS2 - 13A/C > G 2 3 0 0 0 5 R356W 12 11 0 1 1 25 Q318X 3 2 0 0 0 5 S125X 1 1 0 0 0 2 Mất đoạn 10 11 1 0 1 23 Tổng 28 28 1 1 2 60 Nghiên cứu phát hiện được 5 loại đột biến ở 58 thành viên của gia đình bệnh nhân. Trong đó đột biến điểm chiếm 37/60 (61,7%), đột biến mất đoạn chiếm 38,3%. 1 người bố và 1 người mẹ mang 2 đột biến dị hợp tử R356W và Q318X trên cùng 1 alen. Trong số các loại đột biến, đột biến R356W có tỷ lệ cao 25/60 (41,7%) thành viên có đột biến. Bảng 4. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân Đặc điểm Nam Nữ Tổng Xạm da 3 4 7 Cơn suy thượng thận cấp 0 0 0 Dậy thì sớm 1 0 3 Hội chứng cường androgen 0 2 2 Âm vật phì đại ( sau phẫu thuật) 0 1 1 Gia đình có 1 con bị bệnh 0 0 27 Gia đình có 2 con bị bệnh 0 0 0 Thăm khám và phân tích phả hệ của 27 gia đình có con bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối, 100% các gia đình có con bị bệnh ở cùng một thế hệ, không có gia đình nào có 2 con bị bệnh. Tất cả 27 bệnh nhân đang được khám và theo dõi ngoại trú; 7 trường hợp xạm da, 3 dậy thì sớm đang điều trị, 2 trẻ nữ có dấu hiệu cường androgen, 1 trẻ có dấu hiệu phì đại nhẹ âm vật, không có trẻ nào bị suy thượng thận cấp. TCNCYH 115 (6) - 2018 49 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Phả hệ và kiểu gen gia đình mang đột biến dị hợp tử kép IVS2 - 13A/C > G/Q318X&R356W Phân tích phả hệ ở thế hệ 1 và 2, không ai mắc bệnh giống bệnh nhân. Ở thế hệ thứ 3 gia đình có hai con gái đầu bị mất trong thời kỳ sơ sinh, 1 con trai 2 tuổi bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối với kiểu gen I2g và 2 đột biến trên cùng 1 alen p.Q138X & R356W. Bố mẹ và chị gái (III.3) có kiểu hình bình thường. Phân tích gen cho gia đình: đột biến I2g, p.Q318X&p.R356W. Bố mang đột biến dị hợp tử kép p.Q318X và p.R356W mẹ mang gen dị hợp tử I2g. Bệnh nhân nhận 1 alen p.Q318X và p.R356W từ bố và 1 alen I2g từ mẹ. c.656A/C IVS2 - 13A/C > G c.1996C > T P.Q138X c.2110C > T p.R356W Mẹ bệnh nhân II4 Bố bệnh nhân II3 Bố bệnh nhân II3 c.656A/C c.IVS2 - 13A/C > G c.1996C > T P.Q138X c.2110C > T p.R356W Mẹ bệnh nhân III4 Bố bệnh nhân III4 Bố bệnh nhân III4 50 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV. BÀN LUẬN Phân tích gen bằng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen cho 27 bệnh nhân được chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng được khám và điều trị ngoại trú tại khoa Nội tiết- Di truyền- Chuyển hóa tại Bệnh viện Nhi Trung ương, chúng tôi nhận thấy dạng đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao là 61,1%, kiểu gen hay gặp nhất R356W có tỷ lệ 40,7%, đột biến mất đoạn chiếm tỷ lệ cao 38,9%. Đột biến của gen CYP21A2 đã được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới, cho đến nay đã có hơn 150 đột biến khác nhau đã được báo cáo [2; 5]. Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng 100% ở các dạng đột biến ở exon 8 như R356W, Q318X, exon 3 như S125X, vị trí intron 2, và các mất đoạn lớn làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc của gen CYP21A2 dẫn đến không tổng hợp được enzym 21 - OH. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên nhóm bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối nặng nên tỷ lệ đột biến mất đoạn có tăng cao hơn các nghiên cứu khác vì đây là một dạng đột biến phức tạp 100% gây thể mất muối. Trong đó, tỷ lệ gặp đột biến này ở các nước Iraq 19,3%, Châu Á, như Trung Quốc (20%), Nhật Bản (18%) [2; 7; 8]. Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối là một thể nặng của bệnh, có nguy cơ tử vong do cơn suy thượng thận cấp, trong 27 bệnh nhân nghiên cứu của chúng tôi, không có bệnh nhân tái khám bị suy thượng thận, nhưng có 3 trường hợp đang điều trị dậy thì sớm tại khoa, 7 trường hợp còn dấu hiệu xạm da, 2 trường hợp nữ còn dấu hiệu cường androgen kèm 1 bệnh nhân phì đại nhẹ âm vật, do bệnh nhân ở xa, không tuân thủ tái khám đúng hẹn và điều trị thuốc với liều chưa đúng. Phân tích phả hệ của 27 gia đình mang gen đột biến CYP21A2, chúng tôi nhận thấy 100% bố, mẹ mang gen dị hợp tử. Có 6 anh, chị, em, bệnh nhân được phân tích gen có 4 trường hợp mang gen dị hợp tử, chỉ có 2 ca không mang gen bệnh. Có 2 gia đình, có bố, mẹ mang gen dị hợp tử kép Q318X và R356W. Trong đó 1 gia đình có bố mang dị hợp tử kép Q318X và R356W, mẹ mang gen I2g, bệnh nhân bị tăng sản thượng thận bẩm sinh thể rất nặng. Bệnh nhân có 2 người chị gái đã mất ở thời kỳ sơ sinh không rõ chẩn đoán, 1 chị gái đã lớn đi lấy chồng xa. Bệnh nhân có rất nhiều lần vào viện cấp cứu vì cơn suy thượng thận cấp nguy hiểm đến tính mạng. Trong một nghiên cứu mới ở Ai Cập (2018), đã phân tích kiểu gen và kiểu hình cho 14 bệnh nhân và gia đình có người bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 - OH nhận thấy tỷ lệ các dạng đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao, nhưng khi phân tích từng ca lâm sàng thì có nhiều trường hợp kiểu gen và kiểu hình không tương xứng với nhau. Nghiên cứu chỉ rõ kiểu gen IVS2 - 13/A/C > G có thể có kiều hình mất muối hoặc nam hóa đơn thuần, kiểu gen Q318X đồng hợp tử luôn luôn có kiểu hình mất muối, nhưng một vài trường hợp dị hợp tử kép thì lại có kiểu hình nam hóa đơn thuần [9]. Kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh đã có nhiều nghiên cứu đã được báo cáo, để bổ sung vào dữ liệu di truyền giúp cho các bác sĩ trong tư vấn chẩn đoán trước sinh và quản lý bệnh nhân. Đây là bước tiền đề để chúng tôi chẩn đoán trước sinh cho các mẹ, hoặc chị, em gái bệnh nhân khi mang thai, để tránh sinh ra một đứa trẻ bị bệnh hoặc có kế hoạch điều trị sớm cho các bệnh nhân được chẩn đoán sớm từ thời kỳ bào thai [10; 11]. Trong số 27 gia đình này chúng tôi đã tiến TCNCYH 115 (6) - 2018 51 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hành chẩn đoán trước sinh cho 1 thai phụ đã có kết quả bước đầu phát hiện 1 thai nhi mang gen dị hợp tử. Phát hiện đột biến gen CYP21A2 trên bệnh nhân và các thành viên gia đình có giá trị cao giúp bác sĩ chẩn đoán trước sinh cho các thai nhi ngay từ những tháng đầu mang thai để điều trị sớm và tư vấn tiền hôn nhân, cung cấp dữ liệu cho trung tâm di truyền để quản lý người mang gen làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cho cộng đồng. IV. KẾT LUẬN Sử dụng kỹ thuật PCR, MLPA và giải trình tự gen đã phát hiện được 96,7 % người lành mang gen bệnh của các thành viên gia đình bệnh nhân. Trong số đột biến điểm thì đột biến R356W chiếm tỉ lệ cao nhất với 40,7%, tiếp theo là đột biến Q318X chiếm 9,3% và IVS2 - 13A/C > G chiếm 7,4%. Đột biến mất đoạn chiếm 38,9% đây là một dạng đột biến luôn biểu hiện kiểu hình thể mất muối nặng cho bệnh nhân. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Saroj. N, New. M. I (2011). Congenital adrenal hyperplasia due to 21 – hydroxylase deficiency. Annals of the new york academy of sciences, 1192, 5 - 11. 2. White. P.C, Speiser.P.W (2000). Con- genital adrenal hyperplasia due to 21- hy- droxylase deficiency. Endocrine reviews, 21 (3), 245 - 291. 3. Lee. H. H (2004). The chimeric CYP21P/ CYP21 gene and 21-hydroxylase deficiency. Journal Hum Genet, 49, 65 - 72. 4. Baumgartner-Parzer. S.M, Nowotny. P (2004). Carrier frequency of congenital adre- nal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in a Middle European population. The journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 90(2), 775 - 778. 5. Anastasovska.V., Kocova. M (2010). Detected heterozygouts during the molecular analysis of the common CYP21A2 point muta- tions in Macedonian patients with congenital adrenal hyperplasia and their relatives. Sec, Biol.Med.Sci, MASA, XXXI, 2, 71 - 82. 6. Tạ Thành Văn (2010). PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử. Nhà xuất bản Y học, 28 - 32. 7. Ruqayah G. Y.A, Bassam M. S.A (2016). Molecular analysis of CYP21A2 gene mutations among Iraqi patients with congenital adrenal. Hindawi Publishing Corporation. En- zyme Research, 4, 117 - 124. 8. Angel.O.K Chan, But.M.W (2011). Mo- lecular analysis of congenital adrenal hyper- plasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients. Steroids, 76, 1057 - 1062. 9. Fatma E, Sahar S, Mona H et al (2018). CYP21A2 genetic profile in 14 Egyptian chil- dren with suspected congenital adrenal hyper- plasia: a diagnostic challenge. Annals of the new York academy of sciences, 1415, 11 - 20. 10. Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi et al (2010). Novel deletion alleles car- rying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Brazil- ian patients with 21-hydroxylase deficiency. BMC medical Genetics, 1 - 7. 11. Finkielstain GP., Chen W., Mehta SP., Fujimura FK et al (2011). Comprehen- sive genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency, J Clin Endocrinol Me- tab, 96 (1), 161 - 172. 52 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary CYP21A2 GENOTYPE STUDY IN PATIENTS AND THEIR FAMILY MEMBER WITH CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA DUE TO 21-OH DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia (CAH) caused x by 21- hydroxylase deficiency (CAH-21OH) is an autosomal recessive genetic disorder due to mutation in the CYP21A2 gene. Objective: to identify CYP21A2 genotype of patients and the familly members using sequencing and MLPA methods. Patients and method: Mutation analysis of the CYP21A2 was performed on 27 patients and 60 family members with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. 100% of CAH patients were found to have mutation in CYP21A2 gene. 5 types of mutations have been detected. Point mutation is accounted for 61.1%, the most commont point mutation was R356W (40.7%), following are IVS2-13A/C > G (9.3%), Q318X (9.3%), S125X (3.7%). We also detected 38.9% large deletion mutation in patient group. 96.7% (58/60) of the family members were detected to have heterozygous mutation. Only one generation of the whole pedigrees will be diagnosed with CAH and only one out of two children from the same family with have this disorder. Keywords: congenital adrenal hyperplasia,salt wasting, CYP21A2 gene