Xác định độ tinh khiết quang học của dẫn chất cis-N-benzyl và cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 128 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT QUANG HỌC CỦA DẪN CHẤT Cis-N-BENZYL VÀ Cis-N-HEPTYL TETRAHYDRO PHTHALAZINON BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC SỬ DỤNG PHA TĨNH BẤT ĐỐI Chương Ngọc Nãi*, Trần Quốc Duy**, Đặng Văn Tịnh**, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mục tiêu: Nhằm đóng góp vào công cuộc tìm kiếm nguồn nguyên liệu làm thuốc mới, cho đến nay, ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã bước đầu tổng hợp thành công các dẫn chất cis-N-alkyl phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc phosphodiesterase IV và tác dụng kháng viêm mạnh hơn các dẫn chất trans và hỗn hợp racemic. Đối với các dẫn chất cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon (N1) và cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon (N2) mới được tổng hợp, hiện nay chưa có quy trình cụ thể để xác định độ tinh khiết quang học.Vì vậy, một phương pháp tách được các đồng phân đối quang riêng lẻ này mang tính cấp thiết. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất quang hoạt N1 và N2 đãđược tổng hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng pha tĩnh bất đối là dẫn xuất tris (3,5- dimethylphenyl carbamat) cellulose. Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất quang hoạt N1 và N2, sử dụng pha tĩnh bất đối là dẫn xuất tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) cellulose (cột Lux cellulose-1: 250 x 4,6 mm; 5 μm) với pha động n-hexan chứa triethylamin 0,2% và isopropanol chứa triethylamin 0,2% (90:10), nhiệt độ cột 30oC, tốc độ dòng 1,5 ml/phút đối với hợp chất N1 và 2 ml/phút đối với hợp chất N2, bước sóng phát hiện 317 nm. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao vàđộ chính xác RSD < 2%.Độ tinh khiết quang học đối quang (ee) của các dẫn chất (−)N1, (+)N1, (−)N2 và (+)N2 lần lượt là 90,90%; 91,36%; 93,40% và 93,42%. Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình HPLC xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon và cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon. Quy trìnhcó thể được áp dụng để xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất cis-N-alkyl-tetrahydro phthalazinon đã được tổng hợp. Từ khóa: cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon, cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon, độ tinh khiết quang học, pha tĩnh bất đối tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) cellulose. ABSTRACT CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF ENANTIOMERS OF SYNTHESIZED NEW CHIRAL Cis-N-HEPTYL AND Cis-N-BENZYL TETRAHYDRO PHTHALAZINONE DERIVATIVES WITH CHIRAL STATIONARY PHASE Chuong Ngoc Nai, Tran Quoc Duy, Dang Van Tinh, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 128 - 133 Objective: In order to search for new sources of bulk drugs, so far, in Vietnam, our study group was successfully synthesized new chiral cis-N-alkyl phthalazinone derivatives with selective phosphodiesterase IV inhibitory activity and stronger anti-inflammatory activity than that of trans derivatives and racemic mixture. For synthesized new chiral cis-N-heptyl tetrahydrophthalazinone (N1) andcis-N-benzyl tetrahydrophthalazinone (N2) derivatives, there is not a specific proceduretodetermine their enantiomeric purity, so far. Therefore, * Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Chương Ngọc Nãi ĐT: 0913799068 Email: diemnhim@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 129 separation of these chiral compounds is necessary. Subjects and Methods: A high performance liquid chromatographic method using derivatized cellulose tris (3,5-dimethylphenyl carbamate) chiral stationary phase was developed for separation of the enantiomers of synthesized new chiral N1 and N2 derivatives. Results: The appropriate chromatographic conditions were found out for complete separation of the enantiomers, using a cellulose tris-3,5-dimethylphenyl carbamate chiral stationary phase (Lux cellulose-1 column: 250 x 4.6 mm; 5 μm), thermostated at 30oC, mixture of n-hexan containing 0.2% triethylamine and isopropanol containing 0.2% triethylamine (90:10, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.5 ml/min for N1 compound, of 2 ml/min for N2 compound, and detection wavelength of 317 nm. The method was validated and shown wide linearity range with high correlation coefficient and the precision with RSD < 2%. The enantiomeric purity of the synthesized enantiomers is 90.90%, 91.36%, 93.40% and 93.42% (ee) for (−)N1, (+)N1, (−)N2 and (+)N2, respectively. Conclusion: A liquid chromatographic method was successfully developed for separation of the enantiomers of synthesized new chiral cis-N-heptyl and cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinone derivatives. The validated method could be applied for determination of the enantiomeric excess (ee) of synthesized cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinone derivatives. Key words: cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinone, cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinone, enantiomeric purity, cellulose tris-3,5-dimethylphenyl carbamate chiral stationary phase. ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng sinh học của chất đối quang chỉ thể hiện ở một trong những dạng đồng phân quang học riêng lẻ, nên việc xác định độ tinh khiết quang học của sản phẩm là vô cùng quan trọng để xác định xem sản phẩm có đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết quang học của một nguyên liệu làm thuốc hay không. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy các dẫn chất cis-N- alkyl phthalazinon có tác dụng ức chế chọn lọc phosphodiesterase IV mạnh hơn đồng phân trans đồng thời các đồng phân cis(+) có tác dụng mạnh hơn các cis(−) và dạng racemic(4,2). Hiện nay, Khoa Dược, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã tổng hợp thành công các dẫn chất quang hoạt cis-N-heptyl và cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon bằng con đường tổng hợp tạo muối dia. Đối với các dẫn chất mới được tổng hợp này, hiện nay chưa có quy trình cụ thể để xác định độ tinh khiết quang học. Vì vậy, việc xây dựng một phương pháp tách được các đồng phân đối quang riêng lẻ này là cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tách các đồng phân cis-N-alkyl-tetrahydro phthalazinon bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng pha tĩnh bất đối là dẫn xuất tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) cellulose. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu (−)N1:Cis(−)-2-(N-heptyl)-4-(3’,4’- dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2H- phthalazin-1-on (+)N1:Cis(+)-2-(N-heptyl)-4-(3’,4’- dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2H- phthalazin-1-on (−)N2:Cis(−)-2-(N-benzyl)-4-(3’,4’- dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2H- phthalazin-1-on (+)N2:Cis(+)-2-(N-benzyl)-4-(3’,4’- dimethoxyphenyl)-4a,5,8,8a-tetrahydro-2H- phthalazin-1-on Trang thiết bị, hóa chất và dung môi Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-20A.Cột sắc ký Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm; 5 μm). Cân phân tích Mettler AB265-S. Các thiết bị phân tích đã được hiệu chuẩn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 130 Hóa chất, dung môi Isopropanol, n-hexan đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (J.T.Baker).Triethylamin đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện phân tích Các dẫn chất cis-N-heptyl và cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinon đều là những base hữu cơ kém phân cực, nên pha động sử dụng phải kém phân cực. Vì vậy, sắc ký pha thuận được áp dụng. Hiện tại có nhiều loại pha tĩnh bất đối được sử dụng để tách đồng phân quang học. Cột Lux Cellulose-1 được nhồi pha tĩnh là dẫn xuất tris (3,5-dimethylphenyl carbamat) liên kết với cellulose bởi nhóm C=O, được lựa chọn để tách các dẫn chất cis-N-alkyl-phthalazinon với những lý do sau: khung cellulose dạng chuỗi dài, tạo thành những đường và những khoảng trống để thực hiện quá trình hấp phụ và phản hấp phụ, nhóm carbamat tương tác với đối quang bằng liên kết hydro giữa nhóm N−H và C=O, liên kết π-π được hình thành giữa khung phenyl của pha tĩnh và vòng benzyl của chất phân tích. Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng cột trong việc phân tách các đồng phân quang học, pha động thường được sử dụng là n-hexan: isopropanol (90:10) và dựa vào điều kiện sắc ký thích hợp dùng để xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất - cis-N-alkyl hexahydro phthalazinon đã công bố(1), một số điều kiện sắc ký đã được khảo sát trên các dẫn chất cis-N-heptyl và cis-N-benzyl tetrahydro phthalazinonnhư tỉ lệ dung môi pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện, nồng độ mẫu đo, thêm base hữu cơ vào pha động. Điều kiện sắc ký thích hợp với mẫu phân tích cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinon là phải đáp ứng các yêu cầu sau: hai pic đồng phân phải tách hoàn toàn với độ phân giải Rs> 1,5; hệ số kéo đuôi (As) nằm trong khoảng 0,8 đến 1,5; thời gian phân tích ngắn. Điều kiện sắc ký ban đầu(1): - Pha động: n-hexan chứa triethylamin 0,2%: isopropanol chứa triethylamin 0,2% (90:10). - Cột sắc ký: Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm, 5 μm). - Nhiệt độ cột: 30oC. - Đầu dò PDA cài đặt ở bước sóng 317 nm. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 5 μl Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn của ICH ban hành tháng 11 năm 2005 (3), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, độ chính xác, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Xác định độ tinh khiết quang học Phương pháp sau khi được thẩm định sẽ được ứng dụng để xác định lượng đối quang tinh khiết của các sản phẩm đã tổng hợp theo phần trăm diện tích pic đo được trên sắc ký đồ (độ tinh khiết quang học theo sắc ký) và biểu diễn theo độ tinh khiết quang học đối quang (ee). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện phân tích Với điều kiện sắc ký như trên, kết quả phân tích đạt yêu cầu về độ phân giải Rs và hệ số kéo đuôi As. Tuy nhiên, thời gian phân tích tương đối dài nên tiến hành khảo sát tốc độ dòng.Với các dẫn chất N1, khi tăng tốc độ dòng từ 0,8 ml/phút đến 1,5 ml/phút thì độ phân giải giảm không đáng kể, thời gian lưu tR giảm gần gấp đôi. Hơn nữa, hệ số kéo đuôi hầu như không đổi và độ phân giải là 2,0 đáp ứng yêu cầu phân tích nên tốc độ dòng là 1,5 ml/phút được lựa chọn. Khi tăng tốc độ dòng lên 2 ml/phút thì độ phân giải giảm hẳn. Với các dẫn chất N2, tăng tốc độ dòng từ 0,8 ml/phút lên 2 ml/phút làm giảm đáng kể thời gian lưu (2,61 lần), hệ số kéo đuôi hầu như không đổi và độ phân giải vẫn đáp ứng yêu cầu phân tích, khi tăng tốc độ dòng cao hơn thìáp suất hệ thống quá cao không phù hợp phân tích. Vậy tốc độ dòng được lựa chọn cho phân tích hợp chất N1 là 1,5 ml/phút và hợp chất N2 là 2 ml/phút, kết quả được trình bày ở bảng 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 131 Như vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để phân tách đồng phân quang học của các dẫn chất cis- N-alkyl tetrahydro phthalazinon là: - Pha động: n-hexan chứa triethylamin 0,2%: isopropanol chứa triethylamin 0,2% (90:10). - Cột sắc ký: Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm, 5 μm), nhiệt độ cột 30oC. - Bước sóng phát hiện 317 nm. - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút với hợp chất N1 và 2 ml/phút với hợp chất N2. - Thể tích tiêm mẫu: 5 μl - Dung dịch đo: nồng độ 100 μg/ml trong n- hexan: isopropanol (90:10). Bảng 1: Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ dòng 1,5 ml/phút 2 ml/phút Thông số sắc ký tR (phút) AS RS tR (phút) AS RS (−)N1 Pic 1 (pic phụ) 5,211 1,3 2,0 3,823 1,2 1,8 Pic 2 (pic chính) 6,342 1,2 4,768 1,2 (+)N1 Pic 1 (pic chính) 5,636 1,2 2,0 3,943 1,2 1,7 Pic 2 (pic phụ) 6,550 1,2 4,564 1,2 (−)N2 Pic 1 (pic phụ) 9,879 1,2 4,9 7,359 1,3 4,5 Pic 2 (pic chính) 13,867 1,3 10,377 1,2 (+)N2 Pic 1 (pic chính) 10,003 1,2 4,9 7,450 1,2 4,5 Pic 2 (pic phụ) 14,071 1,3 10,424 1,2 Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp của hệ thống Mỗi đối quang được chuẩn bị 1 mẫu thử nồng độ 100 μg/ml. Tiêm lặp lại mỗi mẫu 6 lần. Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6) Thông số Chất RSD% của tR RSD% của S RS AS (−)N1 0,11 0,06 2,0 1,3 (+)N1 0,19 0,11 2,0 1,2 (−)N2 0,01 0,06 4,5 1,2 (+)N2 0,45 0,07 4,5 1,2 Hệ số kéo đuôi nằm trong khoảng 0,8-1,5. Độ phân giải của 2 đối quang lớn hơn 1,5. RSD của các thông số sắc ký cho các lần tiêm lặp lại (thời gian lưu tR và diện tích pic S) của tất cả các mẫu đều nhỏ hơn 2%. Vậy quy trình phân tách các đồng phân quang học của chất phân tích đạt tính phù hợp của hệ thống. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu thử và hỗn hợp racemic của 2 chất phân tích N1 và N2 theo điều kiện sắc ký đã chọn. Hình 1: Sắc ký đồ các hợp chất N1 và N2 Kết quả cho thấy mẫu trắng không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu của 2 pic chính và phụ; mẫu thử ở nồng độ 100 μg/ml không xuất hiện pic tạp trùng với 2 pic chính và phụ, phổ UV tại thời gian lưu của 2 pic giống nhau và bước sóng hấp thụ cực đại của 2 pic đều là 317 nm, các pic có độ tinh khiết trên 99%; hỗn hợp racemic của 2 chất phân tích N1 và N2 xuất hiện 2 pic gần bằng nhau có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 2 đối quang, diện tích pic và chiều cao pic tương ứng với (−)N1 100 g/ml (+)N1 100 g/ml (−)N2 100 g/ml (+)N2 100 g/ml Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 132 từng đối quang tăng lên khi thêm lần lượt một lượng (−)N1 và (+)N1 vào hỗn hợp racemic của N1. Đối với racemic của N2 cũng cho kết quả tương tự. Do đó, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu. Sắc ký đồ các hợp chất N1 và N2 được minh họa ở hình 1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu nhỏ nhất còn phát hiện được để xác định LOD và pha loãng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ chính xác để xác định LOQ. Đo tín hiệu thu được từ mẫu trắng (N) và mẫu thử (S). Thiết lập tỉ số S/N. Nồng độ mẫu thử tại điểm có S/N = 3/1 là LOD và S/N = 10/1 là LOQ. Kết quả thu được như sau: LOD của N1 và N2 lần lượt là 0,05μg/ml và 0,025 μg/ml; LOQ của N1 và N2 là 1 μg/ml. Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính được xác định trong 2 khoảng nồng độ từ 80-120% nồng độ đo nhằm xác định lượng đối quang tinh khiết và từ giới hạn định lượng (LOQ) đến 10% nồng độ đo nhằm xác định lượng tạp đồng phân. Mỗi khoảng tuyến tính sẽ pha 5 dung dịch có nồng độ khác nhau. Mỗi dung dịch tiến hành sắc ký 2 lần, kết quả được trình bày ở bảng 3. Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Chất 80-120 % nồng độ đo LOQ – 10% nồng độ đo R2 Phương trình hồi quy R2 Phương trình hồi quy (−)N1 0,9997 yâ= 33031x - 1307537 0,9998 yâ = 18683x (+)N1 0,9995 yâ=21230x-259843 0,9996 yâ = 17443x (−)N2 0,9996 yâ =14163x – 114550 0,9997 yâ = 13223x (+)N2 0,9999 yâ = 21147x – 858340 0,9998 yâ = 12733x Độ chính xác Độ lặp lại: mỗi chất chuẩn bị 6 mẫu thử tại nồng độ LOQ và nồng độ đo tương ứng với từng chất, tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần trong cùng một ngày. Độ chính xác trung gian: chuẩn bị mẫu thử giống như độ lặp lại và tiến hành trong vòng 3 ngày khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 4. Bảng 4: Kết quả khảo sát độ chính xác theo diện tích pic (n=6) Chất Nồng độ đo LOQ Độ lặp lại (RSD%) Độ chính xác trung gian (RSD%) Độ lặp lại (RSD%) Độ chính xác trung gian (RSD%) (−)N1 0,63 0,64 1,91 1,84 (+)N1 0,71 0,89 1,22 1,52 (−)N2 1,29 1,26 1,32 1,63 (+)N2 1,08 0,86 1,13 1,44 Nhận xét: Kết quả thống kê cho thấy quy trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao vàđộ chính xác RSD < 2%. Do đó, có thể áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất cis-N-alkyl tetrahydro phthalazinon. Xác định độ tinh khiết quang học Bảng 5: Độ tinh khiết quang học của các chất phân tích Chất Độ tinh khiết quang học theo sắc ký Độ tinh khiết quang học đối quang (ee) (−)N1 95,45% 90,90% (+)N1 95,68% 91,36% (−)N2 96,70% 93,40% (+)N2 96,71% 93,42% Với mỗi chất phân tích tiến hành xác định trên 3 lô sản phẩm đã được tổng hợp. Mỗi lô đo 2 mẫu thử. Pha mẫu ở nồng độ đo 100 μg/ml. Mỗi mẫu sắc ký 2 lần với điều kiện sắc ký đã chọn. KẾT LUẬN Dựa vào các kết quả thực nghiệm thu được, có thể áp dụng quy trình đã thiết lập để xác định độ tinh khiết quang học của các dẫn chất quang hoạt cis-N-heptyl tetrahydro phthalazinon và cis- N-benzyl tetrahydro phthalazinon. Quy trình có độ chính xác cao, giúp đánh giá được chất lượng của các sản phẩm đồng phân đã được tổng hợp, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 133 góp phần xác định nguồn nguyên liệu tinh khiết và đạt tiêu chuẩn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chương Ngọc Nãi, Trần Thị Nguyên Đăng, Đặng Văn Tịnh, Nguyễn Đức Tuấn (2011), Xác định độ tinh khiết quang học của dẫn chất cis-N-benzyl và cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon bằng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối, Tạp chí dược học, 4: 32-37. 2. Dang Van Tinh, Jin CK, Miyamoto M, Ikee Y, Masuda T, Sano S, Shiro M, Nagao Y (2006), Practical synthesis of new chiral cis-phthalazinones with potential for high phosphodiesterase inhibitory activity, Heterocycles, 68:2133-2144. 3. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5. 4. Van der May M, et al (2002), Novel selective PDE4 inhibitor. 3. In vivo antiinflammatory activity of a new series of N- substituted cis-tetra- and cis-hexahydrophthalazinones, Journal of Medical Chemistry, 45:2520-2525. Ngày nhận bài báo: 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 23.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014