Bước đầu áp dụng kỹ thuật Multiplex PCR tìm đột biến mất đoạn trên vùng AZF của nhiễm sắc thể y ở một số bệnh nhân nam vô sinh vô căn

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ngoại Khoa 217 BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TÌM ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN TRÊN VÙNG AZF CỦA NHIỄM SẮC THỂ Y Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NAM VÔ SINH VÔ CĂN Nguyễn Minh Hà* TÓM TẮT Mở đầu: Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y là một nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ không nhỏ mà hiện nay đã có thể phát hiện được và Phòng xét nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch đã hoàn thiện được một số điều kiện kỹ thuật của xét nghiệm này. Mục tiêu: Bước đầu áp dụng kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến mất đoạn vùng AZF cho một số bệnh nhân nam vô sinh. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Bệnh nhân nam vô sinh vô căn, người Việt Nam (hoặc gốc Việt Nam). DNA bộ gen được ly trích từ bạch cầu và được chạy 2 phản ứng Multiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứng khuếch đại 5 đoạn DNA đích. Các cặp mồi sử dụng phát hiện được 95% trường hợp mất đoạn trên các vùng AZF. Chứng nam, chứng nữ và chứng nước được chạy song song với mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Kết quả: Áp dụng kỹ thuật xét nghiệm trên 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu và tìm được 9 bệnh nhân nam đột biến (tỷ lệ 12,8%). 8 trường hợp mang đột biến tại vùng AZFc, chỉ có 1 trường hợp đột biến tại AZFb. Kết luận: Đây là một xét nghiệm có độ tin cậy tốt, tính ứng dụng cao, có thể tiến hành làm thường quy ở các phòng xét nghiệm tại nước ta để chẩn đoán, tiên lượng và phòng ngừa cho bệnh nhân nam vô sinh. Từ khóa : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor) ABSTRACT INITIAL APPLYING OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE TO DETECT AZF MICRODELETION OF Y CHROMOSOME IN IDIOPATHIC INFERTILE MEN Nguyen Minh Ha * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 217 - 219 Background: The AZF microdeletion of Y chromosome is a frequently infertile cause that can be detected now. The laboratory of Biochemistry and Molecular biology Department-Pham Ngoc Thach Medical University has optimized some technical conditions of this test. Objectives: Initial applying Multiplex PCR technique to detect AZF microdeletion of Y chromosome in some idiopathic infertile men. Method: Vietnamese idiopathic infertile male patients. Genomic DNA is extracted and purified from leucocytes and is run two multiplex PCR. Each PCR amplifies five target sequences. The primers detect 95% of AZF microdeletion cases. Male, female and blank control are run at same time with each DNA sample. Results: Detection of 9 microdeletion cases in 70 idiopathic infertile males (12.8%). 8 patientss have the AZFc microdeletion and only 1 patient has AZFb microdeletion. Conclusion: The test is reliable and high applicable. As the results that we can run it routinely at our laboratories for diagnosis, prognosis and prevention for infertile male patients. Keywords: Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor) ∗ Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Minh Hà ĐT: 0989001581. Email: drnguyenminhha@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Ngoại Khoa 218 ĐẶT VẤN ĐỀ Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y đã được xác định có liên quan đến tình trạng rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng thành tinh trùng. Trước đây chưa có kỹ thuật phát hiện thường quy loại đột biến này cho các bệnh nhân nam đến khám tại các khoa Hiếm muộn và Nam khoa. Bên cạnh đó, theo một số nghiên cứu tại Châu Á, tần suất đột biến này trong khoảng 8-10% (trong quần thể bệnh nhân nam vô sinh vô căn)(1,2,3,6,7). Vì vậy, đây là một nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ không nhỏ mà hiện nay đã có thể phát hiện được. Phòng xét nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch đã hoàn thiện được một số điều kiện kỹ thuật của xét nghiệm này. Do đó, trước khi áp dụng thường quy tại các phòng xét nghiệm ở nước ta, chúng tôi tiến hành kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến mất đoạn vùng AZF cho một số bệnh nhân nam vô sinh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh nhân nam người Việt Nam (hoặc gốc Việt Nam), bị vô sinh vô căn, được chẩn đoán tại khoa Hiếm Muộn BV. Từ Dũ. Tiêu chuẩn chẩn đoán: bệnh nhân bình thường về lâm sàng và nhiễm sắc thể đồ (46,XX), chẩn đoán vô sinh dựa trên tiền căn (vợ chồng trong độ tuổi sinh sản sau 1 năm (vợ < 35 tuổi) hoặc 6 tháng (vợ ≥ 35 tuổi) chung sống thực sự, không áp dụng biện pháp tránh thai nào mà vẫn không thể có thai và sinh con) và tinh dịch đồ (không thỏa tiêu chuẩn bình thường nào của tinh dịch đồ. Tinh dịch đồ được thực hiện hai lần cách nhau 2 tuần với thời gian kiêng xuất tinh trước thử từ 3 đến 5 ngày. Mẫu tinh dịch được hướng dẫn lấy đúng quy cách và được tiến hành đánh giá tại Phòng Xét Nghiệm Tinh Trùng (Khoa Hiếm Muộn BV Từ Dũ) theo tiêu chuẩn WHO năm 1999. Bệnh nhân được gửi đến Phòng xét nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch để làm xét nghiệm. 3mL máu ngoại biên được chống đông bằng EDTA. Ly trích DNA bộ gen từ tế bào bạch cầu với tỷ số tinh khiết từ 1,8 – 2,0. Mỗi mẫu DNA được chạy 2 phản ứng Multiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứng khuếch đại 5 đoạn DNA đích (gồm 2 đoạn gen ZFY, SRY là chứng nội tại và 3 đoạn gen thuộc 3 vùng AZFa, b, c). Các cặp mồi sử dụng phát hiện được 95% trường hợp mất đoạn trên các vùng AZF. Chứng nam, chứng nữ (DNA của một người nam và người nữ bình thường) và chứng nước được chạy song song với mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Nồng độ trong một phản ứng của Mg2+ là 6,5mM, của mồi là 2µmol mỗi loại và của dNTPs là 0,3mM. Lượng DNA sử dụng là 200ng/phản ứng. Chu kỳ nhiệt phản ứng là 950C 6’ , 940C 30’’ , 550C 30’’, 720C 60’’ , 35 chu kỳ, 720C 10’. Chạy điện di ở 100V , 40 phút , gel agarose 2,5% , chất phát quang ethidium bromide, thước đo 100 đôi base. Đọc kết quả dưới đèn UV và chụp hình lưu lại. Bảng 1: Các đoạn gen được khuếch đại trong phần phản ứng Đoạn khuếch đại Kích thước (đôi base) ZFY ( chứng) 495 SRY (chứng) 472 sY86 ( AZFa) 320 sY127 ( AZFb) 274 Phản ứng 1 sY254 (AZFc) 380 ZFY ( chứng) 495 SRY (chứng) 472 sY84 ( AZFa) 326 sY134 ( AZFb) 301 Phản ứng 2 sY255 (AZFc) 126 KẾT QUẢ Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật xét nghiệm trên 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu và tìm được 9 bệnh nhân nam đột biến (tỷ lệ 12,8%). 8 trường hợp mang đột biến tại vùng AZFc, chỉ có 1 trường hợp đột biến tại AZFb. Bảng 2: ZFY 495 bp ZFY 495 bp SRY 472 bp SRY 472 bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ngoại Khoa 219 sY86 (AZFa) 320 bp sY84 ( AZFa) 326 bp sY127 (AZFb) 274 bp sY134 (AZFb) 301 bp sY254 (AZFc) 380 bp sY255 (AZFc) 126 bp Hình 1: Kết quả xét nghiệm trên DNA bệnh nhân. M: thước đo 100 đôi base – Giếng 1: DNA bệnh nhân không mất đoạn - Giếng 2: DNA bệnh nhân mất đoạn AZFc - Giếng 3: DNA bệnh nhân mất đoạn AZFb - Giếng 4: chứng nam – Giếng 5: chứng nữ - Giếng: nước cất Ở hình 1, giếng số 1, DNA bệnh nhân có đủ 5 vạch tương ứng 5 đoạn được khuếch đại trên mỗi phản ứng, do đó bệnh nhân không bị đột biến. Ở giếng số 2, DNA bệnh nhân mất vạch ở vị trí khoảng 380 đôi base (tương ứng sY254 của AZFc) trên phản ứng 1 và vạch ở vị trí khoảng 126 đôi base (tương ứng sY255 của AZFc) trên phản ứng 2. Do đó bệnh nhân bị mất đoạn tại AZFc. Ở giếng số 3, DNA bệnh nhân mất vạch ở vị trí khoảng 274 đôi base (tương ứng sY127 của AZFb) trên phản ứng 1 và vạch ở vị trí khoảng 301 đôi base (tương ứng sY134 của AZFb) trên phản ứng 2. Do đó bệnh nhân bị đột biến tại AZFb. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã áp dụng thành công kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến mất đoạn cho 70 bệnh nhân nam vô sinh vô căn và tìm được 9 trường hợp đột biến (8 trường hợp mất đoạn vùng AZFc, 1 trường hợp mất đoạn vùng AZFb). Với kết quả trên, chúng tôi nhận thấy đây là một xét nghiệm có độ tin cậy tốt, tính ứng dụng cao, có thể tiến hành làm thường quy ở các phòng xét nghiệm tại nước ta để chẩn đoán, tiên lượng và phòng ngừa cho bệnh nhân nam vô sinh. Chúng tôi hy vọng rằng kỹ thuật này sẽ được đón nhận bởi các bác sỹ khoa Hiếm Muộn và Nam khoa, hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo xác định nguyên nhân di truyền trong vô sinh nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Carvalho C.M., Zuccherato L.W. et al (2006). Study of AZFc partial deletion gr/gr in fertile and infertile Japanese males. J Hum Genet. 51 : 794-799. 2. Chiang H.S., Yeh S.D., Wu C.C. et al (2004). Clinical and pathological correlation of the microdeletion of Y chromosome for 334 patients with azoospermia and severe oligoasthenospermia. Asian J Androl. 6 : 369 – 375. 3. Dada R., Gupta N. P. and Kucheria K. (2007). Molecular screening for Yq microdeletion in men with idiopathic oligozoospermia and azoospermia ; J. Biosci. 28: 163 – 168. 4. Simoni M., Bakker E., Krausz C. (2004). EAA/EMQN best practice giudelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004. Int. J. Andro. 27:240-249. 5. WHO (1999). WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction ( 14th edition). 6. Yang Y., Zhang S.Z et al (2003). Studies on molecular epidemiology of Y chromosome azoospermia factor microdeletions in Chinese patients with idiopathic azoospermia or severe oligozoospermia. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi.5 : 385 – 389. 7. Yung-Ming L., Ying-Hung L., Yen-Ni T. et al (2008). Gene- based creening for Y chromosome deletions in Taiwanese men presenting with spermatogenic failure. Fertil. Steril. 77 : 897 – 903.