Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ qua rừng (Momordica charantia L. Var. Abbreviata Ser. Cucurbitaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 169 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY KHỔ QUA RỪNG (Momordica charantia L. Var. Abbreviata Ser. Cucurbitaceae) Nguyễn Thành Trung*, Trương Thị Thanh Huyền*, Nguyễn Thị Hồng Hương* TÓM TẮT Mở đầu: Cây khổ qua rừng(Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.) đã được y học dân gian sử dụng rộng rãi trong trị bệnh đường huyết. Theo một số tài liệu khoa học, cây khổ qua rừng có chứa nhiều nhóm hợp chất tự nhiên trong đó có saponin. Nhưng các saponintrong khổ qua rừng Việt nam chưa được nghiên cứu sâu về cấu trúc hóa học cũng như tác dụng sinh học. Với các lý do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu nhóm hợp chất saponin trong cây khổ qua rừng Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.” Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:Đối tượng: khổ qua rừng (toàn cây trên mặt đất) được thu hái tại Tây Ninh (4 – 2011) phơi khô và xay nhỏ dưới rây 2 mm. Mẫu đã được PGS.TS. Trương thị Đẹp chủ nhiệm bộ môn Thực vật khoa Dược, đại học Y DượcHCMđịnh danh.Phương pháp nghiên cứu: - Sơ bộ xác định thành phần hóa học của khổ qua rừng bằng phương pháp Ciuley cải tiến.- Khảo sát các điều kiện chiết xuất saponin khổ qua rừng dùng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70%. Loại tạp, cô đặc dịch chiết tới cao đặc và chiếtphânbốcaođặcvớinhữngdungmôicóđộphâncựckhácnhauCHCl3, EtOAc, n-BuOH.- Phân lập một số hợp chất flavonoid từ cao EtOAc bằng các phương pháp sắc ký như sắc ký cột nhanh, sắc ký cột pha đảo, chiết pha rắn, sắc ký rây phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).- Phân lập và tách saponin từ cao n-BuOH bằng các phương pháp sắc ký, lần lượt qua cột chiết pha rắn, cột nhanh pha thuận, cột Sephadex, cột Silicagel. Tinh chế saponin thu được hợp chất tinh khiết S1. Tiến hành đo phổ MS và NMR của S1 để xác định cấu trúc. Kết quả và bàn luận:- Từ kết quả của các phản ứng định tính, sơ bộ kết luận trong khổ qua rừng có chứa flavonoid, saponin triterpen, hợp chất polyphenol, đường khử.- Khảo sát sơ bộ điều kiện chiết xuất cho thấy trong thân có nhiều saponin hơn trong lá và chiết bằng cồn 70% cho nhiều saponin và ít tạp chất hơn so với cồn 90%.- Từ 2,5 kg bột thân chiết ngấm kiệt với 20 lít cồn 70%, cô thu hồi dung môi, lọc loại tạp thu cao lỏng. Cao lỏng được chiết phân bố lần lượt với chloroform, EtOAc, n –BuOH rồi cô loại dung môi thu 100g cao EtOAc (chứa flavonoid), 200 g cao n- BuOH (saponin toàn phần).-Tách sắc ký cao EtOAc thu các phân đoạn dương tính với thuốc thử FeCl3 và kiểmtracác phân đoạn bằng TLC và HPLC, phát hiệntrongkhổ qua rừng có chứa rutin (so sánh với rutin chuẩn thấy có sự trùng khớp về Rf, màu sắc vết, thời gian lưu TR và phổ UV) và 4 vết dương tính với thuốc thử flavonoid.- Phân lập saponin: Từ 100 g cao n - BuOH tiếp tục phân lập qua cột chiết pha rắn thu được 3,2 g cắn D1, cột nhanh pha thuận thu được 640 mg cắn D2, qua cột Sephadex thu được 300 mg cắn D3 và cột cổ điển pha thuận thu được tinh thể S1 (13 mg). Rửa tinh thể S1 với ether ethylic thu được chất khối lượng 11 mg. - Xác định cấu trúc của S1:Từ phổ MS cho (M+) = 648,39 m/z và phổ NMR (1H, 13C, HSQC và HMBC)so sánh với tài liệu (Error! Reference source not found.,1) sơ bộ nhận định S1 là momordicosid K. Kết luận:Trong khổ qua rừng Việt nam mọc ở Tây ninh có chứa các hợp chất flavonoid (trong đó có rutin), saponin triterpenoid (trong đó có momordicosid K)vàpolyphenol. Từ khóa: Momordica charantia L. var. abbreviata Ser., momordicosid K ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Thị Hồng Hương ĐT: 01217432666 Email: nguyenhhuong@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 170 ABSTRACT PRELIMINARY STUDIES ON CHEMICAL CONSTITUENTS OF MOMORDICA CHARANTIA L. VAR. ABBREVIATA SER. CUCURBITACEAE Nguyen Thanh Trung, Truong Thi Thanh Huyen, Nguyen Thị Hong Huong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: : 169 - 174 Introduction: The bitter melon M. charantia L. var. abbreviata Ser. has been used as antidiabetic drug in traditional medicine. According to recent published results, this plant contains various natural compounds including saponins. The saponin compoundsof Vietnamese M. charantia L. var. abbreviata Ser. have not been yet studied deeply about the chemical structure as well as biological activities. Therefore, we have accessed the essay “Preliminary studies on saponin compounds of M. charantia L. var. abbreviate”. Materials and methods: Materials: the ground-above parts of M. charantia L. var. abbreviate were harvestedin Tay Ninh province (April – 2010), dried and cut into pieces in order to pass through 2 mm sieve.Methods::- Checking the purity and identifying the chemical constituents of the herbal modified by Ciuley method. - Extracting (percolation with alcohol 70%) and isolating flavonoid glycosides, saponin compounds by chromatography methods (TLC, CC, SPE, sephadex column, HPLC) and specific chemical tests. - Determining the structure of the pure compound S1 by MS and NMR spectrum results. Results and discussions: - M. charantia L. var. abbreviatafrom Tay Ninh province of Viet Nam contains polyphenols, triterpenoids, saponins and flavonoid glycosides.- 2.5 kg of M. charantia var. abbreviata extracted with 20 liters of 70% alcohol. The liquid extract was acessed to collect the EtOAc extract (flavonoid contents - 100g) and n- BuOH extract (200 g) contents saponin. Results from the EtOAc extract: The results obtained from forest bitter melon fractions were positive with FeCl3test which was continued to be isolated by chromatography (CC, TCL and HPLC). As the results of these we received 5 flavonoids. From total flavonoid extract, rutin was found by comparing with the standard rutin in TLC (by Rf, color) and HPLC (by TR, UV spectrum of peak). Results from the n–BuOH extract: Being isolated by solid phase extraction, rapid column chromatography, sephadex column and traditional column chromatography method gave the product S1 (13 mg). The identified product was purified by washing with ether ethylic to obtain 11 mg of S1. According to the references and the results of H1 and C13 NMR spectrum, we preliminarily identify that the terpene saponin S1 is momordicoside K. Conclusions: The results showed that M. charantia var. abbreviata contained flavonoid glycosides (including rutin), triterpenoid saponins (including momordicoside K) and polyphenols. Keywords: Momordica charantia L. var. abbreviata Ser., momordicosid K ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insulin) với triệu chứng ăn, uống và tiểu tiện nhiều là một trong hai bệnh mãn tính thời đại rất khó trị khỏi - bệnh tăng huyết áp (hypertension) và bệnh đái tháo đường (diabetes).Ở Việt Nam bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) phát triển rất nhanh. Độ tuổi mắc bệnh trẻ hóa từ 45 đến 64 tuổi tập trung nhiều ở thành thị với tỷ lệ 4%, nông thôn 2,5%.Bệnh ĐTĐ nếu không điều trị và ăn uống đúng cách thì vô cùng nguy hiểm vì biến chứng (bong võng mạc, hoại tử tứ chi, ). Do đó nhu cầu về thuốc điều trị bệnh ĐTĐ hiện đang là vấn đề cần giải quyết cấp bách của các nhà quản lý y tế. Y học cổ truyền đã chứng minh có nhiều loại thảo dược như hành tây, mướp đắng, nhân sâm... rất hiệu quả trong điều trị bệnh ĐTĐ, do có tác dụng hạ đường huyết.Khổ qua rừng là một dược liệu cùng loài nhưng khác thứ (variete) với khổ qua – một thực phẩm, dược Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 171 liệu. Khổ qua rừng có quả nhỏ hơn và vị đắng hơn rất nhiều.Y học dân gian dùng vị thuốc này trong điều trị ĐTĐ và làm hạ cholesterol huyết. Nhiều tài liệu khoa học đã công bố khổ qua rừng có hoạt tính trị liệu mạnh hơn so với khổ qua, nhưng các báo cáo khoa học về thành phần hóa học của loại dược liệu này hiện vẫn còn rất hạn chế.Trong bài báo này chúng tôi trình bày kết quả “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ qua rừng”. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Mẫu nghiên cứu là toàn thân trên mặt đất của khổ qua rừng được thu hái tại Tây Ninh (tháng 4/2011); Mẫu đã được PGs.Ts. Trương thi Đẹp chủ nhiệm bộ môn Thực vật khoa Dược, đại học Y DượcHCMđịnh danh. Hóa chất – Thiết bị Tất cả các hóa chất thuốc thử sử dụng đạt yêu cầu tinh khiết cho các loại thiết bị phân tích chuyên dụng như HPLC, LC-MS, NMR. Một số thiết bị chính sử dụng gồm: Hệ thống HPLC water2695; Water2420 detector PDA; Máy đo phổ MS Micromass® Quattro micro™ API tại khoa Dược Đại học Y Dược TP.HCM; Máy đo phổ NMRBRUKER Avance tại Viện Công Nghệ Hóa học. Phương pháp nghiên cứu Kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu (độ tro, độ ẩm) và xác định sơ bộ thành phần hóa học cây khổ qua rừng bằng phương pháp Ciuley cải tiến. - Chiếtxuất flavonoid và saponin trong khổ qua rừng bằngkỹ thuật ngấm kiệt với cồn ethanol 70%. Phân lập và tách các hợp chất này bằng các phương pháp chiết phân bố, tách pha rắn với pha tĩnh Lichroprep RP 18, sắc ký cột Diaion HP 20, Sephadex LH 20 (4). Tinh chế saponin thu được hợp chất tinh khiết S1. - Xác định cấu trúc S1 đophổ MS,1H NMR &13C NMR pha mẫu trong CD3OD, lọc qua màng 0,45µm, đo trên máy BRUKER Avance 300 MHz (1H) – 75 MHz (13C). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Từ kết quả thực nghiệm xác định trong thân lá khổ qua rừng có chứa các hợp chất tinh dầu, saponin, flavonoid, polyphenol, triterpen, acid hữu cơ vàđường khử. Chiết 2,5 kg bột thân khổ qua rừng với EtOH 70%, cô và loại tạp (chlorophyl, uronic) thu được cao lỏng. Lấy cao lỏng hòa với nước chiết phân bố lần lượt với Et2O, EtOAc, n-BuOH thu 100 g cao phân đoạnEtOAc dùng để tách flavonoid và 200g cao phân đoạn n-BuOH dùng để tách saponin. Khảo sát hợp chất flavonoid: Từ cao EtOAc tiếp tục phân tách qua các cột Lichroprep RP 18, sephadex LH 20 thu các phân đoạn dương tính với thuốc thử FeCl3,. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với pha động EtOAc- HOOH-AcOH-H2O (13,5:0,8:1,5:2,5), phát hiện vết với thuốc thử FeCl3. Trên sắc ký đồ TLC thấy có 1 vết trùng khớp về Rf và màu sắc vết khi so sánh với rutin chuẩn. Kiểm tra các phân đoạn bằng HPLC với máy WATERS 2969 và các điều kiện sắc ký: Cột sắc ký Waters Spherisorb 5µm C8, 4,6 x 250 mm; Nhiệt độ cột: 45oC; Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Thể tích bơm: 10 µl; Phát hiện: detector PDA tại 360 nm; pha động gồmacetonitril (a) và TFA 0,1%/H2O (b)với chế độ rửa giải gradient: phút 0,0 - 20: 20 (a) 80 (b); phút 20,5 - 30: 21% (a) 79% (b); phút 30,5-34: 30% (a) 70% (b); phút 34,5- 42: 90% (a) 10% (b); phút 42,5-50,0: 20% (a) 80% (b). Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của HPLC cho 5 vết với phổ UV có dạng điển hình của các flavonol. So sánh với rutin chuẩn trong cùng điều kiện cho thấy pic 2 trùng khớp về thời gian lưu 13,5 phút và dạng phổ UV (hình 1b). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 172 Khảo sát hợp chất saponin Hình 1: (a) Sắc ký đồ HPLC và phổ UV các pic của flavonoid toàn phần (b) sắc ký đồ và phổ UV của rutin. Định tính nhóm hợp chất saponin trong cây bằng SKLM và các phản ứng đặc trưng sơ bộ kết luận được trong khổ qua rừng có chứa saponin triterpenoid. Khảo sát sơ bộ điều kiện chiết xuất cho thấy trong thân có nhiều saponin hơn trong lá và chiết bằng cồn 70% cho nhiều saponin và ít tạp chất hơn so với cồn 90%. Từ cao n-butanol tiếp tục tách bằng các phương pháp sắc ký cột silica gel.Kiểm tra các phân đoạn bằng phản ứng màu với vanilin trong acid sulfuric (VS). Cô áp suất giảm loại dung thu được 12 g cắn D. Tiếp tục phân lập cắn D qua lần lượt cột chiết pha rắnLichroprep RP 18 (D1), cột diaion HP 20 (D2), cột sephadex thu được 300 mg cắn D3 và cột cổ điển silica gel thu được đơn chất S1 (13 mg). Trong quá trình phân lập các phân đoạn sắc ký cột được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3– MeOH– H2O (65:35:10) và phát hiện vết dương tính với thuốc thửVS. Từ cắn D3 tiếp tục qua cột silica gel với dung môi rửa giải là CHCl3, CHCl3–MeOH (99:1), CHCl3– MeOH (98:2) thu được tinh thể 1 hợp chất tinh khiết S1 (13 mg). Rửa tinh thể với ether ethylic thu 11 mg S1. A B Hình 2: Sắc ký đồ các hợp chất saponin trong khổ qua rừngD1: Cao sau khi chiết pha rắn D2: Cao sau khi qua cột diaionD3: Cao sau khi qua cột Sephadex S1: hợp chất tinh khiết Hệ dung môi A: CHCl3 – MeOH (80:20) B: CHCl3 –MeOH – H2O (65:35:10) Đo phổ MS S1 pha trong MeOH đo với kỹ thuật (ES +), phổ MS cho các phân mảnh có m/z 671,55 (M+Na+), m/z 687,49 (M + K+), m/z 648,39 (M+). Phổ NMRS1 Theo phổ NMR 13C, S1 gồm 37 carbon có (b) (a) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 173 chuyển dịch hóa học từ 15 – 210 ppm nhưng không có tín hiệu của nhóm CH tại 159 ppm, như vậy trong công thức không có nhân thơm (Error! Reference source not found.). Trên phổ DEPT cho thấy S1 có 15 CH, 8 CH2, 8 CH3 và 6 C bậc 4.Mũi CH tại 210.4 ppm đặc trưng cho nhóm aldehyde, HMBC cho tín hiệu tương tác giữa H8 và C19chứng tỏ nhóm aldehyde gắn vào vị trí 9. Mũi tại 102,2 là mũi đặc trưng của cacbon acetal (O–CH–O) và 4 cacbon loại >CH–O cộng hưởng trong vùng từ 71,7 đến 78,1 chứng tỏ có 1 phân tử đường ghép vào genin. Bảng Dữ liệu phổ NMR của S1 (CD3OD) Vị trí δC (ppm) δH (ppm) Loại carbon HMBC 1 H→ 13 C 1 22,3(t) 1,62 (1H, m), 1,25 (1H, m) – CH2 – - 2 29,8 (t) 2,02 (1H, s), 1,72 (1H, m) – CH2 – - 3 77,1 (d) 3,57 (1H, br.s) > C – O C5, C1 4 42,4 (s) − > C < - 5 148,0 (s) − = C < - 6 123,4 (d) 5,98 (1H, d, 4,5 Hz) = C – C4, C7, C10 7 73,5 (d) 4,20 (1H, d, 5,5 Hz) – CH – OH C5, C6, C9, C1’ 8 47,0 (d) 2,05 (1H, s) C6, C7, C19, C10, C30 9 51,3 (s) − > C < - 10 37,5 (d) 1,58 (1H, m) – CH < C1, C5, C9, C19 11 23,2 (t) 2,38 (1H, m), 1,48 (1H) – CH2 – C9, C12, C10, C19 12 30,1 (t) 1,72 (2H, m) – CH2 – C13, C14 13 46,7 (s) − > C < - 14 49,6*(s) − > C < - 15 35,8 (t) 1,40 (2H, m) – CH2 – - 16 28,4 (t) 1,99 (2H, br), 1,45 (1H, m) – CH2 – - 17 51,3 (d) 1,55 (1H, m) – CH < C20 18 15,4 (q) 0,96 (3H, s) – CH3 C12, C13 19 210,3 (d) 9,87 (1H, s) – CHO C9, C11 20 37,4 (d) 2,61 (1H, br.d, 9,0 Hz) – CH < - 21 19,3 (q) 1,00 (3H, d, 7.0 Hz) – CH3 C17, C20, C22 22 40,4 (t) 2,24 (1H, br.d, 9,0 Hz) 1,86 (1H, m) – CH2 C20, C23 23 130,0 (d) 5,61 (1H, m) – CH < C22, C24, C25 24 137,7 (d) 5,21 (1H, d, 15,5 Hz) – CH < C22, C23, C25, C26, C27 25 76,5 (s) − > C < - 26 26,4 (q) 1,27 (6H, s) – CH3 C24, C25, C27 27 26,0 (q) – CH3 C24, C25, C26 28 27,8 (q) 1,10 (3H, s) – CH3 C3, C4, C5, C29 29 26,2 (q) 1,27 (3H, s) – CH3 C3, C4, C5, C28 30 18,8 (q) 0,84 (3H, s) – CH3 C13, C14, C15 OMe 50,5* (q) 3,16 (3H, s) – CH3 C25 D - Glucopyranosid 1’ 102,2 (d) 4,27(1H, d, 8,0 Hz) – CH < C7, C3’ 2’ 75,0 (d) 3,15 (1H, m) – CH < C1’, C6’ 3’ 78,1 (d) 3,23 (1H, m) – CH < C2’, C4’ 4’ 78,0 (d) 3,35 (1H, m) – CH < C3’, C5’ 5’ 71,7 (d) 3,29 (1H, m) – CH < - 6’ 62,8 (t) 3,90 (1H, dd, 1,5, 12,0) 3,69 (1H, dd, 5,5, 12,0) – CH2 C5’ (* phần bị trùng lắp với pic của D3COD xác định bằng phổHMBC) Phổ NMR 1H cũng cho thấy S1 có 8 nhóm CH3. Các tín hiệu d, dd, của 1H trong vùng 3,5 – Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 174 5,5 ppm chứng tỏ trong S1 có đường ghép vào genin(Error! Reference source not found.). Tại 9,87 ppm có tín hiệu chứng tỏ có 1 H ghép nối với O (CHO)(Error! Reference source not found.). Các dữ liệu phổ 1H và 13C hoàn toàn phù hợp với nhau. Từ kết quả của phổ NMR 1 H và 13C và so sánh với các dữ liệu phổ NMR của momordicosid K(Error! Reference source not found.,1) chúng tôi sơ bộ nhận định S1 là momordicosid K - một saponin triterpen. Hình 3: Cấu trúc của momordicosid K KẾT LUẬN Trong cây khổ qua rừng có chứa các hợp chất polyphenol, triterpenoid, saponin, và flavonoid (trong đó có rutin).Trong nhóm hợp chất saponin triterpen, chúng tôi đã chiết, phân lập tinh chế và momordicosid K. Cấu trúc hóa học củamomordicosid K được xác định dựa trên phổ MS, NMR và so sánh với các tài liệu đã công bố. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ngô Hải Ðăng, Phùng Văn Trung và Nguyễn Ngọc Hạnh (2011). Khảo sát thành phần hóa học của trái khổ qua Momordica charantia L. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần thơ 2011, 19(a) 35 – 37. 2. Okabe H, Miyahara Y, Yamauchi T (1982). Studies on constituents of Momordica charantia L. (III 1, 2) Chem Pharm Bull 30 (11):3977- 3986. 3. Okabe H, Miyahara Y, Yamauchi T (1982). Studies on constituents of Momordica charantia L. IV, Characterization of New Cucurbitacin Glycosides of the Immature Fruits, Structures of the Bitter Glycosides, Momordicosides K and L, Chem Pharm Bull 30(12): 4334-4340. 4. Zhao M, Tao G, Gu X, Tang J, Jiang C (2008). “Separation, Purification and Structure Identification of a Saponin from Momordica charantia L. var. abbreviate Ser”, Journal of food biochemistry. 27(6):44-47. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014 O HO O O O H HO H HO H H OHH HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 4 15 16 1 7 20 22 23 24 2 5 19 28 29 18 30 2 1 27 1 '2' 3' 4 ' 5' 6' Me 26