Bước đầu nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase trong cây khoai lang (ipomoea batatas) tại Khánh Hòa

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 03/2008 42 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME CHITINASE TRONG CÂY KHOAI LANG (Ipomoea batatas) TẠI KHÁNH HÒA INITIAL RESEARCH ON OBTAINING CHITINASE FROM SWEET POTATO (Ipomoea batatas) IN KHANH HOA Đặng Trung Thành Khoa Chế biến - Trường Đại học Nha Trang Tóm tắt Enzyme chitinase được tìm thấy trong cây khoai lang. Tuỳ từng vị trí thu chitinase có hoạt tính khác nhau. Hoạt tính chitinase cao nhất ở lá và giảm dần ở cuống lá và dây khoai. Chitinase thu từ những phần của cây bị tổn thương cao hơn so với những cây không bị tổn thương. Sử dụng đệm acetat (pH 5,0) để chiết chitinase, thu chế phẩm chitinase bằng cách kết tủa chitinase dịch chiết bằng ethanol 65%. Nhiệt độ thích hợp của chitinase từ lá khoai là 300C, pH thích hợp là 5,5 - 6. Dùng chitinase xúc tác thuỷ phân chitin ở dạng huyền phù chitin, nồng độ chitin thích hợp cho thuỷ phân 0,75 – 1%. Quá trình thuỷ phân không cần phải sử dụng các chất phòng thối. Hiệu suất thuỷ phân chitin bằng chitinase đạt 16,96 - 22,15%. Từ khoá: Lá khoai lang, chitinase, glycol-chitin, swollen-chitin Abstract Enzyme chitinase was found in sweet potato. Chitinase activity was different from parts of sweet potato (leaves, vines of leaves and vines). Chitinase activity was the most in leaves. Parts of breaken sweet potato were higher activity than unbreaken sweet potato. Using acetat buffer (pH 5.0) extracting chitinase was the best way. Using ethanol with concentration 65% precipitated to make product of chitinase. The optimum temperature of chitinase was 300C, the optimum pH was 5.5 – 6. Chitinase hydrolysised colloidal chitin in 0.75 – 1% was good. The hydrolysis need not use substances to prevent from deterioration. The Capacity of hydrolysis chitin by chitinase was low, about 16.96 – 22.15%. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tận dụng các nguồn phế liệu từ các quá trình sản xuất không những giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các sản phẩm mới có giá trị. Trong lĩnh vực chế biến thuỷ sản, nguồn phế liệu giáp xác rất lớn. Tận dụng nguồn phế liệu này để sản xuất chitin và các chế phẩm từ chitin là một hướng đi có nhiều triển vọng tạo ra nhiều sản phẩm mới có hoạt tính sinh học cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực thực phẩm, y dược, mỹ phẩm, công nghiệp vv “Nghiên cứu chiết rút chitinase từ lá khoai lang và bước đầu thử nghiệm thủy phân chitin để sản xuất olygo- chitin” là hướng đi mới và rất cần thiết trong điều kiện sản xuất yêu cầu phải đảm bảo tính thân thiện môi trường. Nội dung: Nghiên cứu thu nhận chitinase từ lá khoai lang và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này. Bước đầu sử dụng chitinase thủy phân chitin thu olygo-chitin. Mục tiêu: Đưa ra các điều kiện thích hợp cho chiết chitinase, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến chitinase. Bước đầu sử dụng chitinase vào quá trình thủy phân chitin thu chế phẩm olygo-chitin. Kết quả thu được là cơ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 03/2008 43 sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của chitinase thực vật vào sản xuất olygo-chitin. Ý nghĩa: Nghiên cứu chiết chitinase từ lá khoai lang là một hướng mới tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu thu được giúp hiểu biết hơn về tính chất của chitinase từ thực vật (từ lá cây khoai lang), các điều kiện thích hợp để chiết chitinase. Sử dụng chitinase thuỷ phân chitin tạo ra các chế phẩm thay thế cho phương pháp hoá học và tận dụng được nguồn phế liệu vỏ tôm, cua, lá khoai lang. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu Nguồn thu nhận chitinase: Lá khoai lang là đối tượng nghiên cứu chiết rút enzyme chitinase. Vật liệu sử dụng để sản xuất olygo-chitin: là chitin ở dạng huyền phù chitin. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Đối tượng thu chitinase: Lá khoai tươi thu hái từ vườn sử dụng làm nguyên liệu chiết chitinase, thu từ ba giống khác nhau: giống VX-37, giống khoai 143 và giống HL4. Phương pháp tách chiết chitinase và thu nhận chế phẩm enzyme (CPE) chitinase được chiết bằng các dung môi: nước cất, dung dịch muối sinh lý và đệm acetat pH = 5. Kết tủa chitinase dịch chiết bằng các tác nhân kết tủa: aceton, ethanol và amonium sunfat. Điều kiện thủy phân chitin bằng CPE chitinase bao gồm các yếu tố: nồng độ chitinase, nhiệt độ, pH, nồng độ chitin và chất phòng thối. Các phương pháp phân tích - Xây dựng đường chuẩn glucosamine qua đó định lượng glucosamine trong dịch thuỷ phân theo phương pháp của Elson – Morgan. - Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu. - Xác định hoạt tính chitinase: Một đơn vị hoạt tính (đvht) enzyme chitinase tương đương với 1 µg glucosamin tạo thành trong thời gian thủy phân chitin là 1 phút ở nhiệt độ phản ứng. - Xác định độ ẩm: Phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi. - Xác định độ tan: Phương pháp xác định hàm lượng các chất không tan. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1.Xác định loại khoai lang sử dụng chiết chitinase Chọn giống khoai chiết rút chitinase: chọn giống khoai lang có hoạt tính chitinase cao nên chọn những giống trồng chủ yếu để thu lá (lá to, cuống to và dài). Kết quả cho thấy giống khoai 143 thu chitinase có hoạt tính cao nhất. Từ các phần của cây bao gồm lá, cuống lá và dây khoai cho thấy chitinase từ lá có hoạt tính cao nhất và giảm dần đến cuống lá và dây khoai. Tình trạng tổn thương của cây ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase: chitinase trong lá khoai lang bị tổn thương (do bị côn trùng ăn lá, do tác động cơ học hay bị sâu bệnh) có hoạt tính cao nhất (192 Units/ml) cao hơn 1,3 lần so với lá khoai không bị tổn thương (148 Units/ml). Kết quả thu được tương tự đối với cuống của các lá bị tổn thương có hoạt độ chitinase (82 Units/ml) cao hơn 1,6 lần so với cuống của lá không bị tổn thương (51 Units/ml). 3.2. Xác định phương pháp thu nhận chitinase DC, CPE Tách chiết chitinase dịch chiết (DC): chiết chitinase bằng đệm acetat pH = 5 thu được chitinase có hoạt độ cao nhất (192 Units/ml), cao hơn 1,15 và 1,22 lần so với dung dịch muối sinh lý và nước cất. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp là 1/1 chitinase thu được có hoạt độ cao nhất (197 Units/ml). Thời gian chiết tối ưu là 10 phút. Thu nhận chế phẩm enzyme (CPE): Chọn ethanol làm tác nhân gây kết tủa. Khi sử dụng aceton cho hoạt tính CPE là cao nhất (146 Units/ml) nhưng sự khác nhau về hoạt độ CPE thu được khi sử dụng ba tác nhân này là Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 03/2008 44 không nhiều (CPE kết tủa bằng aceton hoạt tính chỉ cao hơn 1,058 và 1,081 lần so với ethanol và amonium sunfat). Dùng amonium sulfat kết tủa thu được CPE có lẫn muối amonium sulfat, loại muối khó khăn. Trong khi đó sử dụng aceton giá cao hơn 3,5 lần so với ethanol nên không kinh tế, aceton rất độc nên ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nồng độ ethanol trong dịch chiết đạt 65% cho hoạt tính CPE chitinase cao nhất. Thời gian kết tủa tối ưu là 45 phút. 3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chitinase DC, CPE Nhiệt độ thích hợp đối với hoạt tính chitinase: nhiệt độ thích hợp của chitinase từ lá khoai là 300C. So sánh với kết quả nghiên cứu đã công bố của các tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen (1998), enzyme chitinase chiết rút từ lá khoai lang (leaves of sweet potato), nhiệt độ thích hợp là 250C. Nhiệt độ thích hợp của chitinase thấp hơn nhiều so với nhiệt độ tối ưu của đa số enzyme thu từ thực vật (50 – 650C). Độ bền nhiệt của chitinase: mặc dù chitinase DC và CPE đều được xử lý ở nhiệt độ thấp (45, 500C), thời gian xử lý ngắn (60 phút) nhưng hoạt tính giảm rất nhanh. Điều này chứng tỏ enzyme chitinase thu được từ lá khoai lang không bền với nhiệt. So sánh với các enzyme khác từ thực vật như bromeline, papain cho thấy tính bền nhiệt của chitinase từ lá khoai lang thấp hơn. pH thích hợp đối với hoạt tính chitinase: pH thích hợp của chitinase DC là pH = 5,5 và CPE chitinase là pH = 6. So sánh với kết quả nghiên cứu của các tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen (1998), pH thích hợp cho enzyme chitinase trong lá khoai lang là pH = 5. 3.4. Quá trình thủy phân chitin bằng chitinase Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitin: Nồng độ CPE bổ sung 0,2% là thích hợp. Nồng độ CPE càng tăng, tốc độ thuỷ phân tăng, nhưng với nồng độ CPE cao (>0,2%) cho lượng olygo-chitin thu được tăng nhưng mức tăng chậm. Nhiệt độ thủy phân thích hợp là 300C. pH thích hợp = 5,5. Chitin ở dạng huyền phù với nồng độ tối ưu 0,75 – 1%. Đối với vấn đề phòng thối, do mẫu đối chứng không bị mùi hôi hay bị biến đổi do vi sinh vật sau 16 giờ thủy phân. Vì vậy không cần phòng thối cho các mẫu thủy phân. Hiệu suất thủy phân chitin: Đánh giá hiệu suất thủy phân chitin của chitinase theo nồng độ CPE, nhiệt độ, pH và nồng độ chitin, qua kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ CPE = 0,2 % là thích hợp cho quá trình thủy phân chitin, hiệu suất thu được cao nhất (21,34%). Nhiệt độ thuỷ phân 300C cho hiệu suất cao nhất (20,89%). Môi trường có pH = 5,5 cho hiệu suất thuỷ phân cao nhất (19,78%). Khi nồng độ chitin là 1% cho hiệu suất cao nhất (22,15%). Mặc dù hiệu suất thuỷ phân chitin của chitinase thấp chỉ đạt 16,96 - 22,15%. So với thuỷ phân bằng cellulase, hemicellase, papain thương mại (hiệu suất rất cao 45 – 95%) nhưng giá trị của các sản phẩm thương mại này rất cao, phải nhập khẩu trong khi đó nguồn thu enzyme chitinase từ lá khoai lang rất dễ tìm, rẻ tiền và có quanh năm và cũng là một hướng tận dụng nguồn phế liệu lá khoai trong nông nghiệp. IV. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLYGO-CHITIN Từ những kết quả nghiên cứu cho phép đề xuất quy trình chiết rút chitinase và sử dụng chitinase thuỷ phân chitin thu olygo-chitin theo sơ đồ sau: Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 03/2008 45 Thuyết minh quy trình: Lá khoai lang thu hái tươi, rửa bằng nước sạch để loại bỏ tạp chất. Xay nhỏ lá cùng với đệm acetat pH = 5. Tỷ lệ đệm acetat/nguyên liệu = 1/1. Thời gian chiết 10 phút, chiết ở nhiệt độ 5 – 100C. Sau khi chiết xong, lọc qua vải lọc để thu dịch chiết. Dịch chiết được ly tâm lạnh với tốc độ 9000 vòng/phút ở nhiệt độ 50C trong thời gian 15 phút. Thu dịch chiết chứa enzyme chitinase, loại bỏ bã ở đáy của ống ly tâm. Kết tủa chitinase bằng ethanol nồng độ 65%, thời gian 45 phút thu được CPE chitinase. Thuỷ phân chitin bằng CPE chitinase với nồng độ 0,2%, nhiệt độ 300C, pH = 5,5 và nồng độ chitin 0,75 – 1%. Không phải bổ sung ethanol để phòng thối. Kết thúc thuỷ phân, dịch thuỷ phân được lọc qua giấy lọc thu dịch có chứa olygo-chitin. Dịch đem cô đặc trong thiết bị cô chân không, được sấy khô thu sản phẩm olygo-chitin. V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 5.1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu ở trên có thể rút ra một số kết luận như sau: * Chọn giống khoai thích hợp chiết rút chitinase. Giống khoai (giống 143) có thân màu xanh sẫm, lá to hình tim, dây dài phân nhánh ít. Là giống trồng để thu lá (lá to, cuống to và dài). Sử dụng lá khoai lang tươi, bị tổn thương (do tác động cơ học, do các loại sâu bệnh, do côn trùng ăn lá) sẽ thu enzyme chitinase có hoạt độ cao hơn. * Các điều kiện thích hợp cho tách chiết chitinase DC, thu nhận CPE. + Dung môi chiết là đệm acetat pH=5. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/1, thời gian chiết 10 phút + Sử dụng ethanol kết tủa với nồng độ 65%, thời gian kết tủa 45 phút. + Nhiệt độ thích hợp của chitinase là 300C, độ bền nhiệt kém, pH thích hợp = 5,5 * Các điều kiện thích hợp cho thủy phân chitin. + Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy là 300C, pH = 5,5, nồng độ CPE chitinase = 0,2%. Chitin sử dụng cho thuỷ phân ở dạng huyền phù với nồng độ thích hợp 0,75 – 1%. + Không cần sử dụng ethanol hay các chất khác để phòng thối cho quá trình thủy phân. 5.2 Đề xuất ý kiến + Nghiên cứu tinh sạch chitinase dịch chiết bằng các phương pháp phù hợp để thu chitinase có hoạt tính cao hơn. + Cần nghiên cứu một số dẫn xuất khác của chitin (swollen-chitin, glycol-chitin) làm cơ chất thủy phân, qua đó có thể so sánh hiệu + Đệm acetat pH = 5 + Tỷ lệ dm/ng.liệu = 1/1 + Thời gian: 10 phút + Kết tủa bằng ethanol + Nồng độ ethanol: 65% + Thời gian: 45 phút +[CPE]: 0,2% +Nhiệt độ: 300C +pH = 5,5 +[Chitin]:0,75-1% Lá khoai lang Loại bã Loại bã Xay nhỏ Chiết enzyme Lọc qua vải lọc Ly tâm Dịch chiết enzyme Thu olygo-chitin Thủy phân chitin Chế phẩm thô (CPE) Kết tủa enzyme Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 03/2008 46 quả thủy phân của chitinase với các dẫn xuất chitin khác nhau. + Cần tiếp tục nghiên cứu về chitinase ở một số loài thực vật khác cũng như các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. Từ đó có những hiểu biết sâu hơn về chitinase, so sánh đánh giá sâu hơn về tính chất, hiệu quả thủy phân chitin của chitinase từ các nguồn khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân protein cá bằng enzym protease từ B.sutilis.s 5, Luận án tiến sĩ sinh hóa học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh. 3. Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân Protein bằng protease nội tạng cá, mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ Protein thực phẩm, Luận án Tiến sĩ, Đại học Thủy sản, Nha Trang. 4. Lê Ngọc Tú (Chủ biên), La Ăn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên,(2000), Hóa sinh học công nghiệp, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 5. Abeles, F.B., R.P. Bosshart, L.E. Forrence, and W.H. Habig. (1970), Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves. Plant Physiol. 47: 129_134. 6. Collinge, D.B., K.M. Kragh, J.D. Mikkelsen, K.K. Nielsen, U. Rasmussen, and K. Vad. (1993), Plant chitinases. Plant J. 3: 31_40. 7. Klaus-D. Spindler. (1997), Chitinase and chitosanase assays, Universitat Ulm, Germany. 8. Punja, Z.K. and Y.Y. Zhang. (1993), Plant chitinases and their roles in resistance to fungal disease. J. Nematol. 25: 526_540. 9. Wen-Chi Hou, Ying-Chou Chen and Yaw-Huei Lin.(1998), Chitinase activity of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam var. Tainong 57), 39: 93-97, Institute of Botany, Academia Sinica, Nankang, Taipei 115, Taiwan, Republic of China, Department of Bioengineering, Tatung Institute of Technology, Taipei 115, Taiwan, Republic of China.