Bước đầu tinh sạch carrageenan thu nhận từ rong sụn (kappaphycus alvarezii) nuôi trồng tại cam ranh, Khánh Hòa

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008 30 BƯỚC ĐẦU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii) NUÔI TRỒNG TẠI CAM RANH, KHÁNH HÒA INITIAL RESEARCH ON PURIFYING CARRAGEENAN EXTRACTED FROM Kappaphycus alvarezii SEAWEAD IN CAM RANH, KHANH HOA Vũ Ngọc Bội1, Nguyễn Văn Ninh2 1 Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang 2 Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh Tóm tắt Carrageenan là một polysaccharid được thu nhận từ rong sụn, có thành phần cấu tạo chủ yếu từ các gốc D-galactose và 3-6 anhydro galactose liên kết nhau bằng liên kết βD (1-4) và αD (1-3) galactosid luân phiên nhau [1]. Đáng chú ý, trong gốc D-galactose được sulphate hóa, dựa vào số nhóm sulphate và vị trí đính trên mạch carbon mà phân ra các loại tồn tại trong tự nhiên như: làm da, iota, kappa. Sử dụng phương pháp sắc ký cột trao đổi ion để tinh sạch carrageenan theo phân đoạn. Sau khi giữ carrageenan trên cột dùng dung dịch NaCl 3mol rửa giải thu phân đoạn có hàm lượng carrageenan cao nhất. Abstract Carrageenan is a linear polysaccharide extracted from Kappaphycus alvarezii seawead. Carrageenan is a large molecule being made up of 3.6-anhydro-D-galactose and D-galactose residues linked with alternating (1 3) linkages and (1 4) linkages. In addition, sulfate ester groups may be present on some or all galactose units. Depending on the position and the amount of sulfate ester groups, carrageenans can be classified according to Kappa, iota, or lambda carrageenans. Carrageenans can be purified by ion exchange chromatography. Carrageenans in the ion exchange column can be released by eluting the column with 3M NaCl solution. I. MỞ ĐẦU Rong sụn (Kappaphycus alvarezii Maxwell Doty, 1972) được du trồng vào Việt Nam từ những năm 1993[1]. Hiện nay, rong sụn được nuôi trồng tại các tỉnh ven biển Việt Nam từ Đà Nẵng đến Kiên Giang; tại Khánh Hòa rong sụn được nuôi trồng nhiều ở Cam Ranh, vịnh Vân Phong, Ninh Hòa và xung quanh đảo Trường Sa. Rong sụn thường được trồng theo mô hình kết hợp với nuôi các loài thủy sản khác, đây là dạng mô hình nuôi trồng kết hợp đang được quan tâm phát triển ở nước ta hiện nay. Sản lượng rong sụn ở nước ta vào khoảng 300.000 tấn/năm, phần lớn rong sụn được phơi khô và xuất khẩu dạng nguyên liệu thô. Trên thế giới rong sụn được dùng làm nguyên liệu để thu nhận carrageenan. Carrageenan là polysaccharid được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như trong chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, và đặc biệt là dùng trong dược phẩm. Để có thể sử dụng carrageenan trong dược phẩm người ta đòi hỏi carrageenan phải có độ tinh sạch cao. Tuy vậy, với phương pháp xử lý, nấu chiết thông thường, carrageenan thu được thường chứa nhiều tạp chất như các lọai glucid khác, khoáng và có thể còn chứa cả một số tạp chất vật lý. Do vậy việc nghiên cứu tinh chế carrageenan nhằm loại bỏ các tạp chất để thu nhận carrageenan có độ tinh khiết cao là rất cần thiết trong công nghệ. VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008 31 Trong bài báo này chúng tôi chỉ trình bày một phần nghiên cứu của chúng tôi về quá trình tinh sạch carrageenan để sử dụng cho lĩnh vực dược phẩm. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là carrageenan thu nhận từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii Maxwell Doty, 1972) nuôi trồng tại Khánh Hòa. Carrageenan thu nhận từ rong sụn theo quy trình nầu chiết như sau: Rong nguyên liệu → Rửa sạch → Xử lý KOH → Trung hòa bằng acid acetic → Rửa lại → Nấu chiết → Lọc → Kết tủa bằng cồn → Sấy khô → Bao gói. Carrageenan khô thu được (Hình 1) dùng làm nguyên liệu cho quá trình tinh sạch sau này. Hình 1. Hình ảnh về carrageenan 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân tích hoá học - Xác định hàm lượng tro tổng số bằng phương pháp nung theo tiêu chuẩn TCVN 5105- 90 [3]. - Xác định ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldal theo tiêu chuẩn TCVN 3705-90 [3]. - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [3]. - Định lượng hàm lượng ion kim loại: Fe2+, Cu2+, bằng máy quang phổ hấp phụ nguyên tử (AAS) [9]. - Xác định hàm lượng galactose tổng số theo phương pháp Duebois (1956) so màu ở bước sóng 484 - 490nm, trên máy so mầu UV- Vis [4]. 2.2.2. Phương pháp tinh sạch carrageenan Chuẩn bị cột trao đổi ion: Cân 5g DEAE sephadex G50, ngâm làm trương nở trong nước cất, nhồi lên cột kích thước 60 x1,5cm và tiến hành cân bằng cột [2][4][6][5]. Cân 5g carrageenan thô hòa tan trong 100ml nước cất, lọc thu dịch trong và tiến hành bơm mẫu carrageenan lên cột. Đẩy carrageenan ra khỏi cột trao đổi bằng dung dịch rửa giải có nồng độ NaCl thay đổi từ 0,5 – 5 mol, tốc độ chạy cột 4ml/phút. Tách carrageenan theo 10 phân đoạn, chọn phân đoạn có hàm lượng carrageenan cao nhất để phân tích hàm lượng sulphate và hàm lượng 3- 6 anhydro – galactose có trong carrageenan. Loại muối ra khỏi carrageenan tinh sạch bằng cách kết tủa bằng ethanol 96%; Rửa tủa carrageenan bằng aceton. 2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng carrageenan Lấy 1ml mẫu thử thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử toluidine blue 0,01mg/ml để 30 phút và so màu ở bước sóng 620nm. Dựa vào đường chuẩn tính hàm lượng carrageenan có trong mẫu [4]. 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng sulphate có trong carrageenan Lấy 10ml dung dịch thử, thêm 1ml dung dịch HCl 6M, tiếp tục thêm 5ml sorbitol 70%, sau đó thêm 1mg BaCl2 tinh thể và lắc đều, để khoảng 2 phút và so màu ở bước sóng 470 nm. Dựa vào đường chuẩn carrageenan để tính hàm lượng carrageenan có trong mẫu và đường chuẩn K2SO4 để tính hàm lượng SO4 có nồng độ từ 10-50µg/ml [4], [6]. 2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng 3-6 anhydro- galactose có trong carrageenan. Lấy 1ml dung dịch thử và 10ml recorcinol – acetan, lắc đều và giữ ở 20oC trong 4 phút. Sau đó tiếp tục nâng nhiệt của hỗn hợp lên 80oC, trong khoảng 10 phút. Làm lạnh để đưa hỗn hợp về 50oC và so màu trên máy UV-VIS ở bước sóng 555nm [4]. Dựng đường chuẩn galactose trong khoảng 10 - 50µg galactose /ml. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008 32 Dựa vào đường chuẩn galactose để xác định hàm lượng 3-6 anhydro- galactose có trong carrageenan. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tinh sạch carrageenan qua cột trao đổi ion DEAE sephadex Tiến hành tách carrageenan qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 cột 60 x1,5cm, nhiệt độ tách 60oC. Sau khi nạp carrageenan lên cột, tiến hành rửa trôi các tạp chất không gắn trên cột như các ion kim loại, một số tạp chất khác bằng nước cất. Sau đó rửa giải carrageenan ra khỏi cột bằng dung dịch rửa giải có nồng độ NaCl thay đổi từ 0,5 – 5 mol, tốc độ chạy cột 4ml/phút, thu 10 phân đoạn. Kết quả tinh sạch carrageenan được biểu diễn ở hình 2. Từ hình 2 cho thấy, khi dùng nồng độ NaCl rửa giải thay đổi tuyến tính từ 0,5 ÷ 5M, lần lượt hàm lượng carrageenan được tách ra biến đổi tương ứng với 10 đỉnh. Khi gradient nồng độ NaCl thay đổi từ 0,5 ÷ 3M hàm lượng carrageenan đẩy ra khỏi cột trao đổi ion tăng theo nồng độ NaCl, tại nồng độ NaCl 3M hàm lượng carrageenan đẩy ra khỏi cột đạt giá trị cực đại, tiếp tục tăng nồng độ NaCl từ 3,5 ÷ 5mol hàm lượng carrageenan tách ra khỏi cột giảm xuống rất nhanh. Như vậy nồng độ NaCl thích hợp cho quá trình rửa giải carrageenan ra khỏi cột cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm) là 3M. 0 ,2 0 0 ,2 1 0 ,2 1 0 ,2 2 0 ,2 2 0 ,2 3 0 ,2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 H àm lư ợ n g(m g/ m l) 0 , 0 0 , 5 1 , 0 1 , 5 2 , 0 2 , 5 3 , 0 3 , 5 4 , 0 4 , 5 5 , 0 5 , 5 P h â n đ o ạ n N ồ n g đ ộ N aC l (m o l) N a C l C a r r a g e e n a n Hình 2. Sắc ký đồ quá trình tinh sạch carrageenan trên cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm) 3.2. Xác định hàm lượng sunfat trong carrageenan tinh chế Tính chất đặc biệt của carrageenan thể hiện ở nhóm chức sulphate (OSO3-), đây là nhóm gắn liền trên mạch carbon của phân tử carrageenan. Kết quả phân tích hàm lượng sulphate trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 được biểu diễn trên hình 3. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008 33 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H àm lư ợ n g(m ic ro ga m /m l) 0 1 2 3 4 5 6 N ồn g độ N aC l ( m o l) NaCl Sulphate Hình 3. Sự biến đổi hàm lượng sulphate trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm) Từ kết quả phân tích ở hình 3 cho thấy, khi dùng muối NaCl để rửa giải carrageenan qua cột trao đổi ion, tương ứng với sự thay đổi của hàm lượng carrageenan tách ra khỏi khỏi cột thì hàm lượng sulphate trong carrageenan cũng có sự khác biệt ở một số phân đoạn. Trong các phân đoạn tách ra qua cột tương ứng với nồng độ NaCl rửa giải từ 0,5-1M, hàm lượng sulphate trong carrageenan cũng có sự biến đổi chút ít. Tuy vậy, tại phân đoạn tương ứng với nồng độ NaCl rửa giải 3M carrageenan có hàm lượng sulphate cao nhất, tương ứng với hàm lượng carrageenan tách ra cao nhất, đồng thời tiếp tục tăng nồng độ muối lên 3,5-5 mol thì hàm lượng sulphate giảm mạnh. Nhìn chung, trong 3 phân đoạn đầu hàm lượng sulphate biến đổi có khác biệt với sự tăng hàm lượng carrageenan, nhưng về sau biến đổi tương ứng với hàm lượng carrageenan. 3.3. Xác định hàm lượng 3-6 anhydro trong chế phẩm carrageenan Tính chất tạo gel của carrageenan thể hiện ở nhóm chức anhydro (-OH), đây là nhóm gắn trên mạch carbon tại vị trí số 03 và 06 của phân tử carrageenan. Kết quả nghiên cứu được biểu diễn ở hình 4. 0,00 0,01 0,01 0,02 0,02 0,03 0,03 0,04 0,04 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H àm lư ợ n g(m g/ m l) 0 1 2 3 4 5 6 Phân đọan N ồn g độ N aC l ( m o l) NaCl 3-6 anhydro Hình 4. Sự biến đổi hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008 34 Từ hình 4 cho thấy, hàm lượng 3-6 anhydro tăng theo chiều tăng hàm lượng carrageenan được đẩy ra, tại phân đoạn thứ 6, tức phân đoạn đoạn tương ứng với nồng độ NaCl rửa giải 3M, hàm lượng carrageenan được tách ra nhiều nhất, tương ứng với hàm lượng sulphate và hàm lượng 3-6 anhydro cao nhất. Nhìn vậy sự biến đổi hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tỷ lệ với sự biến đổi của hàm lượng carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 (cột 60 x1,5cm). 3.4. Đánh giá độ sạch của chế phẩm carrageenan sau khi tinh sạch qua cột trao đội ion DEAE sephadex G50 Carrageenan được tạo thành từ các galactose mạch thẳng với mức độ sulphat hóa khác nhau nên thành phần monosaccharid trong carrageenan chủ yếu là galactose. Kết quả phân tích hàm lượng monosaccharid, hàm lượng các ion kim loại, và các tạp chất khác của carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 được trình bày ở bảng 1 và hình 5. Bảng 1. Kết quả xác định hàm lượng các tạp chất trong carrageenan tinh chế Hàm lượng protein (µg/g) Hàm lượng nitơ tổng số Mn2+ (µg/g) Pb2+ (µg/g) Zn2+(µg/g) Hg2+(µg/g) Vết 0 Vết Vết Vết Vết 5 10 15 20 min 0 500 1000 3, 6- a n hy dr o g a la c t o s e g a la c t o s e g lu c o s e x y lo s e 6- m e t hy l ga la c t o s e Hình 5. Hàm lượng đường tổng số trong chế phẩm carrageenan tinh Nhận xét và thảo luận Kết quả phân tích thành phần các chất trong carrageenan tách ra ở bảng 1 và hình 5 cho thấy carrageenan sau khi tinh chế có độ tinh sạch cao không chứa các tạp chất chứa nitơ và các ion kim loại. Mặt khác, thành phần chủ yếu chế phẩm carrageenan chính là các loại đường galactose và các dẫn xuất của galactose như 6 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản - số 04/2008 35 methyl galactose hay 3,6 anhydro galactose. Hàm lượng các lọai monosaccharid có trong chế phẩm carrageenan (tính theo đơn vị phần trăm theo tổng số mol monosaccharid có trong mẫu) như sau: hàm lượng xylose 1,7%; 3,6 anhydro galactose 4,56%; 6-metyl galactose 2,9%; galactose 4,48%mol; glucose 0,3%mol. Mặt dù có sự xuất của glucose với hàm lượng 0,3%mol nếu so sánh với các thành phần khác có trong carrageenan thì thành phần này rất thấp. Do đó, có thể xem trong chế phẩm carrageenan sau tinh chế đạt tiêu chuẩn sạch dùng cho dược phẩm. IV. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau: 1) Nồng độ muối NaCl thích hợp cho quá trình rửa giải carrageenan tinh sạch qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 là 3M. 2) Hàm lượng sulphate và hàm lượng 3-6 anhydro trong carrageenan tách ra qua cột trao đổi ion DEAE sephadex G50 có sự tương ứng với hàm lượng carrageenan tách ra. 3) Chế phẩm phẩm carrageenan sau tinh chế không chứa các tạp chất chứa nitơ, các ion kim loại đạt tiêu chuẩn sạch dùng cho dược phẩm. Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân để phân tích cấu trúc của chế phẩm carrageenan sau tinh chế để biết cấu trúc phân tử của carrageenan thuộc dạng nào. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fred Van De Velde, Gerhard A. De Ruiter (1950), Wageningen Centre for Food Sciences and TNO Nutrition and Food Research Institute, Carbohydrate Technology Department, Present address NIZO food research, PO Box 20, 6710 BA Ede, The Netherlands. 2. Heukeshoven J., Dernick R. (1985), Simplifled method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining, Electrophoresis, 103-112. 3. J. Jayaraman (1998), Laboratory manual in biochemistry, Wiley Eastern Limited. 4. Rodolpho M., Albano and Paulo, A. S. Mouriio (1986), Isolation, Fractionation, and Preliminary Characterization of a Novel Class of Sulphateed Glycans from the Tunic of Styelaplicata (Chordata Tunicata)*, The Journal Of Biological Chemistry - The American Society of Biological Chemists, Inc. 5. Rushizky, G.W., Bartos(1964), Chromatography of mixed oligonucleotides on DEAE-Sephadex, Biochemistry 3, pp. 626-629. 6. Terho, T. T., Kartiala, K. (1971), Method for determination of the sulphate content of glycosaminoglycans, Anal. Biochem., 41: 471 - 476. 7. Đống Thị Anh Đào (1999), “Nghiên cứu phân tích hàm lượng Carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii) ở biển Ninh Thuận”, Tạp chí Khoa học công nghệ, Hà Nội. 8. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, NXB. Nông nghiệp Tp.HCM 9. Nguyễn Thị Thu Vân (2004), Phân tích định lượng, NXB. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh