Các axit béo cyclopropenoic trong dầu hạt thực vật Việt nam: Hibiscus Sabdariffa Lin.vàGnetum Latifolium Blume

Tạp chí Hóa học, T. 40, số ĐB, Tr. 93 - 99, 2002 Các axit béo cyclopropenoic trong dầu hạt thực vật Việt nam: Hibiscus Sabdariffa Lin. và Gnetum Latifolium Blume Đến Tòa soạn 1-7-2002 Phạm Quốc Long1, Đon Lan Ph−ơng1, K.Vosmann2, K. Aitzetmuller2 1Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên Trung tâm KHTN&CNQG 2 Viện nghiên cứu Hóa - Lý chất béo, Muenster - CHLB Đức Summary Cyclopropenoic fatty acids ( CPEFA ): malvalic acid and sterculic acid have been found in seed oil of Hibiscus Sabdariffa Lin. and Gnetum Latifolium Blume of Vietnam by GC with AgNO3/ MeOH rearrangement derivatization. The contents of CPEFA were in Hibiscus Sabdariffa Lin. (18:CE 1.33%; 19:CE 0.50%) and Gnetum Latifolium Blume (18:CE 32.50%; 19:CE 8.86%). Structure of malvalic acid and sterculic acid were confirmed by GC-MS of their ether rearrangement products and discussed also. I - Mở Đầu bản của Durbetaki [7], ph−ơng pháp phản ứng hóa học của Halphen [8, 9], ph−ơng pháp phân Các axit béo cyclopropenoic (CPEFA) luôn tích bởi cộng h−ởng từ hạt nhân (NMR) [10], có mặt trong dầu các hạt thực vật bậc cao, và đ* và ph−ơng pháp phân tích bằng sắc kí khí (GC) đ−ợc phát hiện từ hơn 30 năm nay [1, 2]. Các của các dẫn xuất CPEFA sau khi phản ứng với tài liệu đ* chỉ ra rằng có 2 dạng CPEFA th−ờng AgNO3/ MeOH [11 - 13]. gặp trong thực tế là: axit sterculic (9,10 - Trong thời gian gần đây, nhờ có sự phát methylene-9-octadecenoic) và axit malvalic triển v−ợt bậc của các kĩ thuật phân tích sắc kí (8,9-methylene-8-heptadecanoic), ngoài ra khí mao quản có kết hợp với phổ khối l−ợng những axit hay tìm thấy cùng có mặt với các (GC-MS), nên việc phân tích và nhận dạng các CPEFA trong nhiều loại hạt thực vật khác là: CPEFA đ* dễ dàng, nhanh và chính xác hơn rất dihydrosterculic và dihydromalvalic [3, 4]. nhiều [14]. Theo các tài liệu đ* công bố ở trên, Những axit loại này đều có một vòng nhỏ tồn các CPEFA phổ biến hay có mặt trong dầu hạt tại trong mạch dài cácbon là cấu trúc phân tử các họ thực vật: Malvaceae (ngành của axit béo, chính chúng là nguyên nhân kìm Angiospermae) và Gnetaceae (ngành h*m hàng loạt các enzym quyết định của các Gymnospermae). Bài báo này đề cập đến các quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể sống, và có kết quả phân tích về các CPEFA có trong dầu nhiều bằng chứng cho thấy chúng là độc và có hạt 2 cây: Hibiscus Sabdariffa Lin. (Họ thể là tác nhân gây ung th− cho động vật bậc Malvaceae) và Gnetum Latifolium Blume (Họ cao [5, 6]. Gnetaceae) của Việt Nam có sử dụng các kĩ Đ* có nhiều ph−ơng pháp nghiên cứu và thuật phân tích hiện đại GC và GC-MS đ* nêu ở nhận dạng các CPEFA: từ các ph−ơng pháp cơ trên [14]. 93 II - Nguyên liệu v ph−ơng pháp phân tích trên máy sắc kí khí HEWLETT PACKARD 5890 Series II theo chế độ: Cột 1. Nguyên liệu mao quản CP- Sil 88, 100 m/0,25ID/ 0,2 àm, ch−ơng trình nhiệt độ: 155oC - 220oC Mẫu hạt thực vật đ−ợc thu thập tại Việt nam (1,5oC/phút), Injector 250oC, detector 250oC, và đ−ợc các nhà sinh vật học phân loại, định tên khí mang H . Tiếp theo điều chế dạng khoa học: hạt Dâm bụt dấm Hibiscus 2 methylester CPEFA sau phản ứng với AgNO3 Sabdariffa Lin. (thu 6/1999 tại Hòa Bình), và /MeOH: 5 mg metyleste CPEFA tr−ớc phản hạt Gắm núi đá Gnetum Latifolium Blume (thu ứng đem hòa tan trong 0,5 ml AgNO3 b*o hòa 11/2000 tại Yên Bái). Các mẫu hạt sau khi đ−ợc trong MeOH khan, phản ứng đ−ợc giữ ở 30oC chọn lọc, bảo quản ở điều kiện tiêu chuẩn (4oC, trong 2 giờ, sau đó xử lí với 1 ml H2O, chiết 2 độ ẩm không đổi), và đ−ợc mang sang Viện lần bằng với 0,5 ml petrol ete-làm khan thu nghiên cứu Hóa - Lý chất béo CHLB Đức để đ−ợc hỗn hợp dẫn xuất các metyleste CPEFA phân tích. sau phản ứng với AgNO3/MeOH và đem phân 2. Phân tích sắc kí khí (GC) tích trên sắc kí khí, điều kiện nh− đ* mô tả ở trên có so sánh với hệ chất chuẩn. Chiết xuất dầu béo từ các mẫu hạt thực vật đ−ợc thực hiện theo ph−ơng pháp tiêu chuẩn 3. Phân tích GC-MS ISO/DIS 659: 1988. Nhận dạng các CPEFA Các dẫn xuất của metyleste các CPEFA tr−ớc và sau phản ứng với AgNO / MeOH đ−ợc 3 sau phản ứng với AgNO /MeOH đ−ợc phân tích xác định d−ới dạng metyleste của các axit béo 3 để chứng minh cấu trúc trên máy GC-MS của trên sắc kí khí (GC) theo ph−ơng pháp tiêu h*ng HEWLETT- PACKARD Model 5890 chuẩn ISO/FDIS 5590 : 1998. Trong thực nghiệm 10 mg dầu béo đ−ợc hòa tan với 1 ml Series II/5989 A (Palo Alto.CA), cột mao quản Petrol ete trong lọ nhỏ nút kín, bổ sung 25 àl OV-1 Fused silica (30 m/0,25ID/ 0,25 àm, dung dịch natri metanolat trong metanol (2 Macherey-Nagel, Duren- Germany ), EI : 70 eV, khí mang He tốc độ 1,0 ml/phút, chạy mol/l ) và lắc kĩ trong 1 phút. Thêm vào 20 mg o o o monohidrat sunphat hiđrônatri loại sạch, lắc kĩ ch−ơng trình 140 C/5 phút , 140 C - 260 C tốc độ: 4oC/phút, 260oC/5 phút, Split 1: 20, Injector và đem li tâm ở chế độ 5000 v/phút trong 1 o phút. Dịch trong, sạch ở pha trên thu đ−ợc là 280 C. Sử dụng phổ dữ liệu chất chuẩn. dạng methylester của các CPEFA tr−ớc phản Sơ đồ phân tích các CPEFA đ−ợc biểu diễn ứng với AgNO3 /MeOH đ−ợc tách riêng và đem trên hình 1: Mẫu dầu hạt Tổng metyleste của các axit béo bình th−ờng + CPEFA tr−ớc phản ứng với AgNO3 / MeOH Phân tích sắc kí khí (GC) So sánh Tổng metyleste của các axit béo bình th−ờng Phân tích sắc kí khí (GC) + CPEFA dẫn xuất sau phản ứng với AgNO3/MeOH Phân tích cấu trúc các dẫn xuất CPEFA bằng GC-MS Hình 1: Sơ đồ tiến hành công việc phân tích các CPEFA 94 Để phân lập và nhận dạng các CPEFA đ* sử dụng gần đây là: phản ứng của các methyl có nhiều tài liệu đề cập đến nhiều ph−ơng pháp CPEFA với AgNO3 b*o hòa trong MeOH có kết khác nhau nh−: ph−ơng pháp phân lập hóa học, hợp kĩ thuật phân tích bởi GC và GC-MS [14, phản ứng ôxi hóa với các tác nhân khác nhau, 15]. Khi đó đối với mỗi chất sẽ có 2 sản phẩm phản ứng no hóa nối đôi bằng xúc tác, phản ứng dẫn xuất metoxy ete và 2 sản phẩm dẫn xuất đặc hiệu (Halphen test), phản ứng với axít, phản isomers enonic t−ơng ứng nh−: từ metyl ứng với mercaptans, cũng nh− sử dụng các mavalate 18 : CE sẽ tạo 2 sản phẩm metoxy ph−ơng pháp phổ khác nhau nh−: IR ether (18: CM1 + 18: CM2) và 2 sản phẩm dẫn NMR,MS...[15]. Trong tr−ờng hợp ở đây xuất isomers enonic (18: CC1+ 18: CC2), t−ơng CPEFA là 2 chất: Steculic và Malvalic axit có tự từ metyl sterculat 19: CE sẽ tạo 2 sản phẩm trong thành phần dầu 2 loại hạt: Hibiscus metoxy ete (19: CM1 + 19: CM2 ) và 2 sản Sabdariffa Lin. (Họ Malvaceae) và Gnetum phẩm dẫn xuất isomers enonic (19: CC1 + 19: Latifolium Blume (Họ Gnetaceae) của Việt CC2) [13], sơ đồ phản ứng tạo các chất dẫn xuất Nam, đ−ợc tiến hành phân tích và nhận dạng của CPEFA khi phản ứng với AgNO3 /MeOH bởi ph−ơng pháp rất có hiệu quả mà hay đ−ợc đ−ợc trình bày trên hình 2. CH3 (CH2)7 C C(CH2)6 COOCH3 CH3 (CH2)7 C C(CH2)7 COOCH3 O O Metyl malvalat 18: CE Metyl sterculat 198: CE AgNO3/MeOH AgNO3/MeOH CH3 (CH2)7 C CH(CH2)6 COOCH3 CH3 (CH2)7 C CH(CH2)7 COOCH3 Metoxy ete CH2OCH3 CH2OCH3 CH3 (CH2)7 CH C(CH2)6 COOCH3 CH3 (CH2)7 CH C(CH2)7 COOCH3 CH2OCH3 CH2OCH3 18: CM1 v& 18: CM2 19: CM1 v& 19: CM2 CH3 (CH2)7 C C(CH2)6 COOCH3 CH3 (CH2)7 C C(CH2)7 COOCH3 Enoic isome O CH2 O CH2 CH3 (CH2)7 C C(CH2)6 COOCH3 CH3 (CH2)7 C C(CH2)7 COOCH3 O H2C O H2C 18: CC1 v& 18: CC2 19: CC1 v& 19: CC2 Hình 2: Sơ đồ tạo các dẫn xuất của CPEFA III - Kết quả v thảo luận metyleste của các axit béo bình th−ờng+CPEFA dẫn xuất sau phản ứng với Hình 1 là sắc kí đồ (GC) tổng metyleste AgNO3/MeOH (b) và các số liệu so sánh chi của các axit béo bình th−ờng+CPEFA tr−ớc tiết (bảng 1) của 2 mẫu hạt phân tích. phản ứng với AgNO3/MeOH (a) và tổng Qua kết quả phân tích trên sắc kí khí (GC)- 95 Hình 1: Phổ sắc kí đồ (GC) dạng metyleste của dầu hạt Hibiscus Sabdariffa Lin. và Gnetum Latifolium Blume tr−ớc và sau phản ứng với AgNO3 /MeOH, pic đánh dấu (*) dự đoán là dẫn xuất ketone của axit béo số liệu chỉ ra ở bảng 1, ta thấy rõ ràng hàm phân tích nhận dạng các CPEFA có hàm l−ợng l−ợng của hầu hết các axit béo bình th−ờng cao ở mẫu hạt Welwitschia mirabilis (Châu Phi) tr−ớc và sau phản ứng không thay đổi - trừ các [8], với cùng ph−ơng pháp phản ứng với CPEFA. Cụ thể mẫu hạt Hibiscus Sabdariffa AgNO3/MeOH và phân tích trên GC và GC-MS Lin. có hàm l−ợng Malvalic 18: CE tr−ớc nh− trên. Kết quả cũng đ* đ−ợc chỉ ra trên bảng phản ứng là 1,33%, sau phản ứng đ* không còn 1 cho thấy hàm l−ợng 18: CE và 19: CE tr−ớc nữa mà chuyển thành 2 dạng sản phẩm metoxy phản ứng của mẫu hạt Welwitschia mirabilis là: ete (18: CM1 + 18: CM2 ) là 1,29%; và hàm 18: CE 6,0% và 19: CE 0,6%, sau phản ứng l−ợng Sterculic 19: CE tr−ớc phản ứng là 0,5 cũng chuyển hóa thành các dẫn xuất CPEFA %, sau phản ứng đ* chuyển thành 2 dạng dẫn đúng nh− dự kiến nh−: (18: CM1 + 18: CM2 ) xuất (19: CM1 + 19: CM2) là 0,59%. T−ơng tự là 5,6%; (19: CM1 + 19: CM2 ) là 0,6%. Nói đối với mẫu hạt: Gnetum Latifolium Blume, chung các isomer enonic tạo thành của mẫu dầu tr−ớc phản ứng hàm l−ợng Malvalic 18: CE là các hạt phân tích là rất thấp trong phản ứng với 32,50%, sau phản ứng đ* chuyển hết thành 2 AgNO3/MeOH ở trên, ví dụ nh− chỉ có 0,6% dạng sản phẩm metoxy ete (18: CM1 + 18: dạng (18: CC1 + 18: CC2) đ−ợc tạo thành ở hạt CM2 )là 28,62%; còn hàm l−ợng Sterculic 19: Gnetum Latifolium Blume, và có 0,12% dạng CE tr−ớc phản ứng là 8,86 %, sau phản ứng đ* (19: CC1 + 19: CC2 ) đ−ợc tạo thành ở hạt chuyển thành 2 dạng dẫn xuất (19: CM1 + 19: Hibiscus Sabdariffa Lin., còn ở hạt Welwitschia CM2) là 8,14%. Các kết quả trên đều phù hợp mirabilis không có sản phẩm dạng này. Các với sự giải thích quá trình phân mảnh tạo các phân tích khác về hàm l−ợng các CPEFA có dẫn xuất sản phẩm dạng metoxy ete của các trong các mẫu hạt: Hibiscus Sabdariffa Lin. CPEFA đ* nêu ra ở trên [13, 14]. Để đối chứng, (Họ Malvaceae) và Gnetum Latifolium Blume ta có thể khảo sát thêm các kết quả đ* đ−ợc (Họ Gnetaceae) ở các địa điểm khác nhau trên 96 thế giới trong hàng loạt các tài liệu [11, 12, 13, kết quả phân tích nhận đ−ợc ở trong bài báo 14, 15] cũng cho kết quả t−ơng đối phù hợp với này. Bảng 1: Hàm l−ợng metyleste axit béo + CPEFA tr−ớc và sau phản ứngvới AgNO3/MeOH Hibiscus Sabdariffa Gnetum Latifolium Welwitschia Các axit béo Lin. Blume mirabilis [ 8 ] a b a b a b Hàm l−ợng dầu hạt 16,86 (cả vỏ) 3,17 (nhân) 18,2 (cả vỏ) (% TL) 14:0 0,15 0,15 0,12 0,14 0,2 0,2 15:0 0,01 0,01 0,30 0,25 0,1 0,1 16:0 17,01 16,62 8,01 7,49 21,4 21,3 16:1n7 0,46 0,48 0,11 0,16 0,7 0,7 17:0 0,11 0,13 0,43 0,41 0,6 0,6 17:1n7 0,09 0,09 0,43 0,27 - - 18:0 2,76 2,73 9,22 8,77 2,7 2,7 Malvalic 18: CE 1,33 - 32,50 - 6,0 - 18:1n9 27,39 27,19 16,27 15,42 11,1 11,0 18:2n6 42,65 42,11 3,79 3,58 15,1 15,0 Sterculic 19: CE 0,50 - 8,86 - 0,6 - *Unknown 2,06 2,25 2,70 2,50 - - 18:3n3 0,29 0,29 3,74 3,41 33,5 33,6 20:0 0,41 0,42 1,79 1,92 0,2 0,2 20:1n9 0,06 0,05 0,50 0,51 0,1 0,1 18: CM1+18: CM2 - 1,29 - 28,62 - 5,6 19: CM1+19: CM2 - 0,59 - 8,14 - 0,6 22:0 0,30 0,46 1,06 1,07 0,2 - 18: CC1+18: CC2 - - - 0,60 - - 22:1n9 0,04 0,08 0,36 0,63 - - 19: CC1+19: CC2 - 0,12 - - - - Epoxy? 2,73 2,57 - - - 0,5 24:0 0,19 0,20 0,52 0,53 0,3 0,3 a. Hàm l−ợng axit béo bình th−ờng + CPEFA tr−ớc phản ứng với AgNO3/MeOH b. Hàm l−ợng axit béo bình th−ờng + dẫn xuất CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOH [8] số liệu đối chứng kết quả phân tích trên dầu hạt Welwitschia mirabilis (Gymnosperm) Cấu trúc của axit malvalic và axit sterculic mảnh các sản phẩm ete của chúng. Phổ khối đ−ợc xác nhận trên phổ GC-MS d−ới dạng phân MS các dạng phân mảnh của các sản phẩm 97 ether của axit malvalic và axit sterculic thể hiện của chúng. trên hình 2 đ* đ−ợc khảo sát chi tiết trong các tài liệu [12, 13]. Chúng có pic cơ sở là: m/z 85 IV - Kết luận và các pic tăng c−ờng ở m/z 55, 71, 81, 95. Ngoài ra pic ion phân tử ở m/z 326 (axit Đ* khảo sát hàm l−ợng 2 chất: axit steculic malvalic) và m/z 340 (axit sterculic), tự chúng và axit malvalic thuộc nhóm các CPEFA có đ−ợc xác nhận bởi sự bổ sung thêm metanol mặt trong thành phần dầu 2 loại hạt: Hibiscus vào CPEFA metyl este của chúng. ở đây cũng Sabdariffa Lin. (Họ Malvaceae) và Gnetum có mảnh đặc tr−ng của mảnh gốc mẹ trừ đi khối Latifolium Blume (Họ Gnetaceae) của Việt l−ợng 32 đơn vị đ−ợc giới thiệu trong phổ là: Nam. m/z 294 (axit malvalic) và m/z 308 (axit Sử dụng ph−ơng pháp phân tích nhanh rất sterculic), nó chỉ thị sự mất đi của metanol từ có hiệu quả là phản ứng của các metyl CPEFA ion phân tử. Một trong những dẫn xuất keton với AgNO3 b*o hòa trong MeOH có kết hợp kĩ đ−ợc dự đoán th−ờng xảy ra ở mức độ thấp thuật phân tích bởi GC để nhận dạng các dẫn [12], thể hiện ở pic đánh dấu (*) trong hình 1 và xuất metyl este của các CPEFA (axit malvalic bảng 1, nh−ng không thể đ−ợc xác nhận củng và axit sterculic) sau phản ứng với cố bởi phổ GC-MS bởi vì pic chuẩn đoán quan AgNO3/MeOH. Cấu trúc của chúng cũng đ−ợc trọng đ* biết có thể không có mặt trong phổ MS xác nhận trên phổ GC-MS. Hình 2: Phổ GC-MS của dẫn xuất metyleste của CPEFA sau phản ứng với AgNO3/MeOH Lời cám ơn: D−ới sự tUi trợ tUi chính của thực vật, Dr. B. Matthaus vU Dr. L. Bruhl trong DAAD cho chuyến đi công tác khoa học, công quá trình tiến hUnh công việc tại CHLB Đức. việc đ−ợc hoUn thUnh tại Phòng thí nghiệm dầu thực vật, Viện nghiên cứu Hóa - Lí chất béo, Ti liệu tham khảo Muenster - CHLB Đức, tác giả cũng chân thUnh cám ơn sự giúp đỡ tận tình của CN Nguyễn 1. C. R. Smith. Jr. Progress in the Chemistry Hữu Phú trong thu thập vU định tên mẫu hạt of Fats and other Lipids, Pergamon Press: 98 NewYork, Vol. XI, Part I, P. 139 - 177 392 (1987). (1970). 9. E. C. Colemanl. J. Assoc. off. Anal. Chem., 2. W. W. Christic. In Topics in Lipids Vol. 53, P. 1209 - 1213 (1970). Chemistry, Gunstone F.D., Ed: Logos 10. N. E. Pawlowski, et al. J. Am. Oil Chem. Press, London, Vol. 1, P. 1 - 50 (1970). Soc., Vol. 49, P. 387 - 392 (1972). 3. M. B. Bohannon, et al. Lipids, Vol. 13, P. 270 - 273 (1978). 11. E. L. Schneider, et al. J. Am. Oil chem. Soc., Vol. 45, P. 585 - 590 (1968). 4. J. R. Vickery. J. Am. Oil Chem Soc., Vol. 57, P. 87 - 91 (1980). 12. M. S. Ahmhad, et al. J. A. Chem. Phys. Lipids, Vol. 25, P. 29 - 38 (1979). 5. R. A. Phelps, et al. J. Food Sci. Vol. 44, P. 358 - 394 (1964). 13. Bianchini J. P. et al. Anal. Chem. Vol. 53, 6. Lê D. J et al, Cancer Res., Vol. 31, P. 960 - P. 2194 - 2201 (1981). 963 (1971). 14. K. Aitzetmuller et al. JAOSC, Vol. 75, No. 7. Durbetaki A., J. Anal. Chem. Vol. 28, P. 12, P. 1761 - 1765 (1998). 2000 - 2001 (1956). 15. W. C. William. Topics in Lipid Chemitry, 8. G. Halphen. J. Pharmacol , Vol. 6, P. 390 - Vol. 1, F.D (1969). 99