Đặc điểm dấu ấn miễn dịch và di truyền tế bào trước và sau điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho người lớn

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  133 ĐẶC ĐIỂM DẤU ẤN MIỄN DỊCH VÀ DI TRUYỀN TẾ BÀO TRƯỚC  VÀ SAU ĐIỀU TRỊ BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO  NGƯỜI LỚN  Huỳnh Văn Mẫn*, Phan Thị Xinh*, Nguyễn Phương Liên*, Nguyễn Hà Thanh**, Nguyễn Tấn Bỉnh*  TÓM TẮT  Mục tiêu: Mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh bạch cầu cấp dòng  lympho người lớn trước và sau điều trị.  Đối  tượng  và  phương  pháp  nghiên  cứu: bệnh nhân  chẩn  đoán bạch  cầu  cấp dòng  lympho  (BCCDL)  người lớn từ 12/2009 đến 08/2012 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM có làm các xét nghiệm miễn  dịch và di truyền trước và sau điều trị; phương pháp mô tả loạt ca.  Kết quả: 28 bệnh nhân có làm đầy đủ các xét nghiệm miễn dịch và di truyền trước và sau điều trị, tỷ lệ  BBCDL T là 32%, tỷ lệ BBCDL B là 68%, tỷ lệ BBCDL Ph+ là 32%. Tỷ lệ chuyển vị t(4;11) và hoặc MLL‐ AF4+ là 11%, t(1;19) và hoặc E2A‐PBX1+ là 0%, t(12;21) và hoặc TEL/AML+là 0%. Sau điều trị, nhóm Ph+: 5  bệnh nhân cả FISH và RT‐PCR đều âm tính, 2 bệnh nhân FISH âm nhưng RT‐PCR còn dương yếu, 2 bệnh  nhân chưa đánh giá sau điều  trị; nhóm Ph‐: Tồn  lưu  tế bào ác  tính sau giai đoạn  tấn công  (MRD‐ minimal  residual disease): 0,003%‐1.014% tùy vào loại LAP (leukemic associated phenotyping). Ba bệnh nhân có MLL‐ AF4+ được xét nghiệm lại RT‐ PCR sau điều trị cho kết quả âm tính 2 bệnh nhân.  Kết luận: Nghiên cứu bước đầu cho thấy kỹ thuật miễn dịch và di truyền giúp ích nhiều cho quá trình chẩn  đoán, phân loại và theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.  Từ khóa: kỹ thuật miễn dịch, di truyền tế bào  ABSTRACT  IMMUNOPHENOTYPING AND GENETIC FEATURES BEFORE AND AFTER TREATMENT  ADULTS ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA  Huynh Van Man, Phan Thi Xinh, Nguyen Phuong Lien, Nguyen Ha Thanh, Nguyen Tan Binh   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 132 ‐ 136  Objective: The description  of  immunophenotyping  and genetic  abnormalities  in  the  adult  acute  lymphoblastic leukemia (ALL) patients before and after treatment.  Subjects and Methods: Patients diagnosed with adult ALL from 12/2009 to 08/2012 at the Blood  Transfusion  and Hematology Hospital  of HCMC  have  to  do  tests mmunophenotyping  and  genetic  before and after treatment; method described case series.   Results: 28 patients have made full immunophenotyping and genetics before and after treatment,  the proportion of T‐ ALL was 32%, the proportion of B‐ALL was 68%, the proportion of Ph + ALL was 32%.  The rate of t (4; 11) and or MLL‐AF4 + was 11%, t (1; 19) and or E2A‐PBX1 + was 0%, t (12; 21) and or  TEL‐ AML  + was  0%. After  treatment,  the Ph  +  group:  5  patients  both  FISH  and RT‐PCR were  negative, 2 patients with negative FISH, RT‐PCR weak positive, 2 patients have not  evaluated; Ph‐ *Bệnh viện Truyền máu ‐ Huyết học     ** Bộ môn Huyết học ‐ Truyền máu, Đại học Y Hà Nội  Tác giả liên lạc: ThS. BS. Huỳnh Văn Mẫn   ĐT:0975 449 818   Email: huynhvanman@yahoo.com   Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học   134 groups: MRD (minimal residual disease) after the  induction phase: 0, 003%  ‐1,014% depending on  the  type  of LAP  (leukemic  associated phenotyping); Three patients with MLL‐AF4 +  after  treatment gave  negative results for 2 cases.  Conclusion:  The  study  initially  showed  immunophenotyping  and  genetics much  help  for  the  diagnosis, classification and monitoring the treatment of ALL.  Keywords: immunophenotyping, genetic    ĐẶT VẤN ĐỀ  Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là một  rối  loạn ác  tính của  tế bào đầu dòng  lympho B  và  T.  Cũng  giống  như  các  bệnh máu  ác  tính  khác, khảo sát những bất thường nhiễm sắc thể  (NST), gen và dấu  ấn miễn dịch  tại  thời  điểm  chẩn  đoán  rất quan  trọng  cho phân  loại dòng,  phân nhóm  tiên  lượng, giúp  lựa  chọn phác  đồ  điều  trị  thích hợp và  là dấu ấn để  theo dõi  tồn  lưu tế bào ác tính trong quá trình điều trị (4). Tại  Bệnh  viện  truyền máu  ‐  huyết  học  TP HCM,  chúng  tôi  tiến  hành  khảo  sát  các  bất  thường  nhiễm sắc  thể và gen bằng phương pháp FISH  (Fluorescence  in  situ hybridization)  và RT‐PCR  (Reverse  transcription  polymerase  chain  reaction), đặt biệt là nhiễm sắc thể Philadelphia  (Ph+) trong BCCDL B để chọn phác đồ điều  trị  và theo dõi điều trị. Đối với trường hợp BCCDL  B Ph‐ và BCCDL T  thì chúng  tôi  theo dõi bằng  kỹ  thuật  tế  bào  dòng  chảy  (Flow  cytometry‐ FCM).   Mục tiêu nghiên cứu   Mục tiêu tổng quát  Mô  tả  đặc  điểm  dấu  ấn  miễn  dịch,  bất  thường về di  truyền  tế bào  trong bệnh BCCDL  người lớn trước và sau điều trị.  ‐Mục tiêu cụ thể  + Mô  tả  đặc  điểm  dấu  ấn miễn  dịch  bệnh  BCCDL  người  lớn  trước  và  sau  điều  trị  trong  nhóm nghiên cứu.  + Mô tả đặc điểm bất thường về di truyền tế  bào  trong BCCDL người  lớn  trước và sau điều  trị trong nhóm nghiên cứu.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca.  Đối tượng nghiên cứu  + Tiêu chuẩn chọn bệnh  Bệnh  nhân  được  chẩn  đoán BCCDL  người  lớn  từ  09/2009  đến  07/2012  tại  BV  TMHH  TP  HCM thỏa các tiêu chuẩn:   ‐ Có  làm các xét nghiệm dấu ấn miễn dịch,  sinh học phân tử  ‐  Điều  trị  đặc hiệu  theo phác  đồ GRAALL  2005  + Tiêu chuẩn loại trừ  ‐  Không  điều  trị  đặc  hiệu  theo  phác  đồ  GRAALL 2005   ‐ Không  làm  các  xét  nghiệm dấu  ấn miễn  dịch, sinh học phân tử   Phương pháp nghiên cứu  Thu  thập  số  liệu  dựa  vào  hồ  sơ  bệnh  án  trước và sau điều trị.  Tiêu chuẩn đánh giá  đánh  giá  lui  bệnh dựa  vào  tiêu  chuẩn  của  Hiệp hội  chống ung  thư quốc  tế  –UICC/WHO  bằng lâm sàng, huyết‐tủy đồ, xét nghiệm nhiễm  sắc thể (FISH), và RT‐PCR, xét nghiệm tồn lưu tế  bào ác tính bằng kỷ thuật tế bào dòng chảy.  Phương pháp thu thập và xử lý số liệu  Sử dụng phần mềm vi  sinh SPSS 16.0 FOR  WINDOW để xử lý và phân tích số liệu, với độ  tin  cậy  95%,  ngưỡng  P  =  0.05  được  chọn  có  ý  nghĩa thống kê.   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  135 KẾT QUẢ  Tổng  cộng  28  bệnh  nhân,  tuổi  bệnh  nhân  trong nhóm nghiên cứu từ 17‐59, trung bình 36  tuổi. Tỷ lệ nam: nữ là 1:1.  Đặc điểm FISH và RT‐PCR  ‐ Có  9  bệnh  nhân  (32%)  có  nhiễm  sắc  thể  Philadelphia  (+),  RT‐PCR  cho  kết  quả  6  bệnh  nhân biểu hiện Minor BCR‐ABL  (e1a2),  2 bệnh  nhân biểu hiện Major BCR‐ABL  (b3a2),  1 bệnh  nhân  biểu  hiện  cả  Major  BCR‐ABL  (b2a2)  và  Minor BCR‐ABL (e1a2).  ‐  3  bệnh  nhân  (11%)  có  t  (4;11), một  bệnh  nhân đa bội, một bệnh nhân có 3 NST 21, một  bệnh nhân có 4 NST12 và 4 NST 21.   ‐  13  bệnh  nhân  còn  lại  chưa phát  hiện  bất  thường.  Bảng 1: kết quả sinh học phân tử  Mã bệnh nhân Giới Tuổi Kết quả lúc chẩn đoán Kết quả sau điều trị FISH RT-PCR: BCR-ABL FISH RT- PCR BN 1 Nam 35 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-) BN 2 Nam 55 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-) BN 3 Nữ 21 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-) BN 4 Nữ 49 Ph+ Major (b3a2) Ph- (+) yếu BN 5 Nữ 25 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-) BN 6 Nữ 41 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (+) yếu BN 7 Nữ 28 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-) BN 8 Nam 54 Ph+ Major (b3a2) Chưa làm BN 9 Nam 58 Ph+ Major và Minor (e1a2 và b2a2) Chưa làm BN 10 Nữ 51 3 NST 21 (12,5%) (-) Tử vong BN 11 Nữ 42 t (4;11) MLL-AF4 (+) (-) (-) BN 12 Nam 41 4NST 12,21 Chưa làm BN 13 Nữ 36 t (4;11) MLL-AF4 (+) (-) (-) BN 14 Nữ 54 t (4;11) MLL-AF4 (+) (-) (+) BN 15 Nam 19 Đa bội Chưa làm Đặc điểm dấu ấn miễn dịch  Bảng 2: kết quả dấu ấn miễn dịch  Mã bệnh nhân Giới Tuổi Kết quả lúc chẩn đoán Kết quả sau điều trị (MRD) BN 1 Nam 35 Pre-B Không làm BN 2 Nam 55 Pre-B Không làm Mã bệnh nhân Giới Tuổi Kết quả lúc chẩn đoán Kết quả sau điều trị (MRD) BN 3 Nữ 21 Pre-B/ CD 33+ Không làm BN 4 Nữ 49 Common B Không làm BN 5 Nữ 25 Common B Không làm BN 6 Nữ 41 Common B Không làm BN 7 Nữ 28 Common B Không làm BN 8 Nam 54 Common B Không làm BN 9 Nam 58 Common B Không làm BN 10 Nữ 51 Pro-B Tử vong sau tấn công BN 11 Nữ 42 Pro-B 0.002%  0.010 % BN 12 Nam 41 Common B 0.005%  0.038% BN 13 Nữ 36 Mature B Tử vong sau tấn công BN 14 Nữ 54 Mature B/CD13+ 0,013  1,42% BN 15 Nam 19 Common B 0,007  0,026% BN 16 Nam 33 Pre-T 0,001  0,002% BN 17 Nam 34 Common T 0,001  0,005% BN 18 Nữ 32 Pre-T 0,002 0,031% BN 19 Nam 29 Common T 0,003  0,042% BN 20 Nam 17 Common T 0.002%  0.024% BN 21 Nữ 24 Common B 0.014%  0.59% BN 22 Nam 23 Common T 0.005%  0.024 % BN 23 Nam 24 Common T 0.003%  0.016% BN 24 Nữ 23 Common B 0,004  0,041% BN 25 Nam 47 Early T 0%  0.003% BN 26 Nữ 59 Common T 0.045%  1.014% BN 27 Nữ 37 Common B Chưa làm BN 28 Nam 22 Commom B Chưa làm Bảng 3: phân loại dưới nhóm theo dấu ấn miễn dịch  (DAMD)  Phân loại DAMD Số bệnh nhân N=28 Tỷ lệ Pro-B 2 7% Common B 12 43% Pre-B 3 11% Mature B 2 7% Pre-T 2 7% Early T 1 4% Common T 6 21% Phân  lớn bệnh nhân dòng B  là Common B  và dòng T là Common T  Bảng 4: Tồn lưu tế bào ác tính dựa vào FCM  Tồn lưu ác tính (MRD) Số bệnh nhân N=15 Tỷ lệ < 0,01% (nguy cơ rất thấp) 3 20% 0,01-0,1% (nguy cơ thấp) 9 60% 0,1-1% (nguy cơ trung bình) 1 6,7% Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học   136 ≥1% (nguy cơ cao) 2 13,3% Sau  điều  trị,  tồn  lưu  tế  bào  ác  (minimal  residue disease – MRD)  tính dựa vào FCM  chỉ  thực hiện ở bệnh nhân Ph‐ và kết quả chủ yếu ở  nhóm nguy cơ thấp.  BÀN LUẬN  *  Trong  nghiên  cứu  của  chúng  tôi,  tất  cả  bệnh nhân BCCDL B đều làm RT‐PCR 4 tổ hợp  gen:  BCR/ABL,  E2A/PBX1,  MLL/AF4  và  TEL/AML1; FISH 1 trong 4 chuyển đoạn t(9;22),  t(1;19), t(4;11), t(12;21) tương ứng để khẳng định  thêm. Bệnh nhân BCCDL T chúng tôi chưa triển  khai  kỹ  thuật  sinh  học  phân  tử  vì  những  đột  biến  ở  dòng  T  tần  suất  thấp  và  phức  tạp. Về  nhiễm sắc thể đồ, do kỹ thuật chưa hoàn chỉnh  nên  nhiều  trường  hợp  cấy  không mọc  vì  vậy  chúng  tôi  không  nêu  kết  quả  ở  đây. Kỹ  thuật  real  time PCR  đánh  giá  sau  điều  trị  chúng  tôi  chưa triển khai được.  Tỷ  lệ nhiễm  sắc  thể Ph+ khoảng 32%,  tỷ  lệ  t(4;11) khoảng 11%, tương đương với các nghiên  cứu khác và y văn(1,2,4). Vì số mẫu còn nhỏ nên  chúng tôi chưa gặp trường hợp nào t (1; 19) và t  (12;  21).  Theo  y  văn  tỷ  lệ  t(9;22)  (ph+)  khoảng 25‐30%,  t(4;11) khoảng 3‐7%,  t  (1; 19)  khoảng  2‐3%  và  t  (12;  21)  khoảng  0‐3%(8,4).  Tình  trạng  đa  bội  và  các  bất  thường  khác  chúng tôi chưa khảo sát bằng nhiễm sắc thể  đồ cho tất cả các trường hợp.  Sau điều trị, trong 9 bệnh nhân Ph+: 7 bệnh  nhân lui bệnh hoàn toàn về huyết tủy đồ, nhưng  bảy bệnh nhân FISH âm, 2 bệnh nhân RT‐PCR  còn dương, 2 bệnh nhân chưa hoàn  tất điều  trị  nên chưa đánh giá, 3 bệnh nhân có t(4;11) dương  cũng  lui bệnh hoàn  toàn về huyết  tủy đồ, có 2  bệnh nhân FISH va RT‐PCR âm, một bệnh nhân  FISH âm, tuy nhiên RT‐PCR còn dương.   *  Ứng  dụng  của  kỹ  thuật MFC  trong  việc  phát  hiện  MRD  ở  những  bệnh  nhân  bệnh  BCCDL đạt  lui bệnh về hình  thái nhờ vào việc  xác  định những kiểu dấu  ấn bất  thường  được  gọi  là  những  kiểu  hình  dấu  ấn  miễn  dịch  (DAMD) liên quan đến bệnh bạch cầu gọi tắt là  LAP  (Leukemia‐associated  phenotypes),  chỉ  hiện diện trên tế bào bạch cầu ác tính và không  hiện diện hoặc hiện diện không  thường xuyên  trên tế bào tạo máu bình thường. Kỹ thuật MFC  cho phép phát hiện 1 tế bào ác tính/10.000 tế bào  tuỷ xương bình thường(5,7,6,9).  Dựa vào các phương pháp  luận khác nhau,  người ta phân loại LAP như sau: kháng nguyên  khác  dòng  (cross‐lineage),  sự  biểu  hiện  kháng  nguyên không đồng bộ (asynchronous), sự hiện  diện  quá  mức  (overexpression),  sự  vắng  mặt  một kháng nguyên đặc hiệu của dòng  (antigen  absent expression), kháng nguyên lạc chỗ (etopic  antigen  expression),  kiểu  phát  xạ  bất  thường  (aberrant light‐scatter patters)(5,7,6,9).  Theo khảo sát của chúng tôi, tỷ lệ BCCDL B  là  68%, BCCDL T  là  32%,  và  tỷ  lệ dưới nhóm  tương với các nghiên cứu khác(3,6,9,4).  Sau  điều  trị,  9  trường  hợp  Ph+  chúng  tôi  không  khảo  sát  tồn  lưu  ác  tính  bằng  tế  bào  dòng chảy, vì những trường hợp này đã được  khảo  sát bằng FISH và RT‐PCR. Có  2  trường  hợp  tử  vong  trong  giai  đoạn  tấn  công.  Hai  trường  hợp  chưa  hoàn  tất  điều  trị  nên  chưa  khảo sát tồn lưu ác tính.  Có 15 trường hợp được khảo sát tồn  lưu ác  tính bằng kỷ  thuật  tế bào dòng  chảy  cho  thấy  20%  thuộc nhóm nguy  cơ  rất  thấp,  60%  thuộc  nhóm nguy cơ thấp, 6,7% thuộc nhóm nguy cơ  trung  bình,  13,3%  thuộc  nhóm  nguy  cơ  cao,  không khác biệt so với các nghiên cứu khác(5,7,6).   Vì có độ nhạy cao, kỹ thuật PCR vẫn đang là  công cụ chính để phát hiện số lượng nhỏ tế bào  MRD hiện nay.   KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  bước  đầu  cho  thấy  kỹ  thuật  miễn dịch và di  truyền giúp  ích nhiều cho quá  trình chẩn đoán, phân  loại và  theo dõi điều  trị  bệnh bạch cầu cấp dòng  lympho. Chúng  tôi đề  nghị hoàn thiện kỷ thuật nhiễm sắc thể đồ, triển  khai kỷ  thuật  real  time PCR và nghiên  cứu  số  mẫu lớn hơn, theo dõi thời gian sống, thời gian  tái phát,  để  hoàn  thiện  hơn  kỹ  thuật  sinh  học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  137 phân tử và dấu ấn miễn dịch phục vụ cho công  tác  chẩn  đoán  và  điều  trị  bệnh  bạch  cầu  cấp  dòng lympho.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh (2011), “Các bất thường  tế bào di truyền ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho tại  bệnh viện Bạch Mai”, Y học thực hành (783), số 9/2011, tr 121‐ 123.  2. Elia L, Mancini M, Moleti L, et al (2003), “A multiplex reverse  transcriptase‐polymerase  chain  reaction  strategy  for  the  diagnostic molecular  screening  of  chimeric  genes:  a  clinical  evaluation  on  170  patients  with  acute  lymphoblastic  leukemia”, Haematologica,, 88 (3): 275‐279.  3. Nguyễn Triệu Vân, Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Anh Trí và cộng  sự  (2006),  “Ứng dụng phương pháp miễn dịch  trong  chẩn  đoán phân loại một số thể bệnh của lơ xê mi cấp”, Y học thực  hành, 545, tr 90‐102.  4. Pui CH, McGraw‐Hill  (2006), William Hematology,  chapter  91, 7th Edition, pp1321‐1342.   5. Roshal  M,  Fromm  JR,  Winter  S,  Dunsmore  K,  Wood  BL  (2010),  “Immaturity  associated  antigens  are  lost  during  induction for T cell lymphoblastic leukemia: implications for  minimal  residual  disease  detection”,  Cytometry  B  Clin  Cytom, 78 (3): 139‐146.  6. San Miguel  JF, Ciudad  J, Vidriales MB, Orfao A,  Lucio  P,  Porwit‐MacDonald A, Gaipa G, van Wering E, van Dongen JJ  (1999), “Immunophenotypical detection of minimal  residual  disease  in acute  leukemia”, Crit Rev Oncol Hematol; 32  (3):  175‐185.  7. Shao  H,  Yuan  CM,  Xi  L,  Raffeld M, Morris  JC,  Janik  JE,  Stetler‐Stevenson  M  (2010),  “Minimal  residual  disease  detection  by  flow  cytometry  in  adult  T‐cell  leukemia/lymphoma”, Am J Clin Pathol, 133 (4): 592‐601.  8. Van  Dongen  JJ,  Macintyre  EA,  Gabert  JA,  et  al  (1999),  “Standardized  RT‐PCR  analysis  of  fusion  gene  transcripts  from chromosome aberrations in acute leukemia for detection  of  minimal  residual  disease.  Report  of  the  BIOMED‐1  Concerted Action:  investigation of minimal  residual disease  in acute leukemia”, Leukemia, 13 (12): 1901‐1928.  9. Vidriales  MB,  Perez  JJ,  Lopez‐Berges  MC,  Gutierrez  N,  Ciudad J, Lucio P, Vazquez L, Garcia‐Sanz R, del Canizo MC,  Fernandez‐Calvo  J, Ramos F, Rodriguez MJ, Calmuntia MJ,  Porwith A, Orfao A, San‐Miguel JF (2003), “Minimal residual  disease  in  adolescent  (older  than  14 years)  and  adult  acute  lymphoblastic  leukemias:  early  immunophenotypic  evaluation has high clinical value”, Blood, 101 (12): 4695‐4700.  Ngày nhận bài báo:     15 tháng 8 năm 2013  Ngày phản biện:     04 tháng 9 năm 2013  Ngày bài báo được đăng:   22 tháng 10 năm 2013