Đánh giá HER2 trong ung thu vú bằng phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang và lai tại chỗ gắn bạc

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  75 ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP  LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG VÀ LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC  Đoàn Thị Phương Thảo*, Phan Đăng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung*  TÓM TẮT  Giới thiệu: Tình trạng HER2 trong ung thư vú giữ vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định  điều trị, giúp cho các nhà lâm sàng tiên đoán đáp ứng hóa trị liệu, có hoặc không đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ  định  cho  điều  trị  kháng  thể  đơn  dòng  trastuzumab.  Phương  pháp  lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  (FISH),  được  ASCO/CAP xác định  là tiêu chuẩn vàng để khảo sát  tình  trạng HER2. Bộ môn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y  Dược triển khai phương pháp này từ năm 2009 đến nay. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp FISH đòi hỏi  phòng xét nghiệm phải rất chuyên biệt, phải có kính hiển vi huỳnh quang, hơn nữa thời gian lưu trữ tiêu bản  quá ngắn nên không  thể xem xét  lại khi cần  thiết. Song song với phương pháp FISH,  từ năm 2012 Bộ môn  chúng tôi đã ứng dụng thêm phương pháp lai tại chỗ gắn bạc hai màu (D‐ISH), với phương pháp này các tiêu  bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học và đặc biệt tiêu bản có thể lưu trữ lâu dài. Phương pháp này cũng  đã được FDA chấp thuận cho khảo sát HER2 vào tháng 6/2011. Mục tiêu của nghiên cứu này, chúng tôi khảo  sát đối chiếu kết quả D‐ISH với kết quả FISH (tiêu chuẩn vàng) để có thể phát triển thêm một kỹ thuật mới với  nhiều ưu điểm hơn. Đây  là kết quả bước đầu khi  thực hiện phương pháp D‐ISH để khảo sát  tình  trạng gen  HER2 trong ung thư vú.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang: dùng bộ kít PathVysion  HER‐2 DNA Probe. Phương pháp  lai tại chỗ gắn bạc (D‐ISH): dùng bộ  INFORM HER2 Dual  ISH DNA  Probe. Dùng  trên máy nhuộm  tự  động. Phương  pháp Hóa Mô Miễn Dịch:  bộ Pathway  (Ventana Medical  Systems Inc, Tucson, Ariz) dùng trên máy nhuộm tự động.  Kết quả: Khảo sát 67 mẫu ung thư vú xâm lấn, trong đó có 47 mẫu được thực hiện đồng thời D‐ISH,  FISH và HMMD. 20 mẫu thực hiện D‐ISH và HMMD. Tương hợp giữa kết quả của hai phương pháp lai  với kết quả HMMD gần như tuyệt đối trong nhóm HER2(‐) và HER2(3+), nhóm HER2(2+) thì tỉ lệ khuếch  đại dưới 20%. Tương hợp giữa kết quả FISH và Kết quả D‐ISH  là 100% cả nhóm không khuếch  đại và  khuếch đại gen HER2.  Kết  luận: Trong nghiên cứu này, sự phù hợp giữa IHC và D‐ISH, FISH  là trung bình. Sự phù hợp  giữa kết quả FISH và D‐ISH là 100% cho cả trường hợp khuếch đại và không khuếch đại. Phương pháp D‐ ISH là phương pháp được chấp nhận để đánh giá HER2, kết quả nghiên cứu này đã cho thấy phương pháp  D‐ISH có  thể xác  định  được  tình  trạng HER2 với  tỉ  lệ  tương hợp hai kết quả FISH và D‐ISH  là 100%.  Ngoài ra, xét nghiệm D‐ISH dễ sử dụng vì khảo sát được dưới kính hiển quang học, tín hiệu màu không  phân hủy theo thời gian, mẫu có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài. Phương pháp FISH  hoặc D‐ISH nên được thực hiện cho tất cả các bệnh nhân cần điều trị bằng trastuzumab.  Từ  khóa: hóa mô miễn dịch,  lai  tại  chỗ huỳnh quang  (FISH),  lai  tại  chỗ gắn bạc hai màu  (D‐ISH),  HER2.  *Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM  Tác giả liên lạc: TS Đoàn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418  Email: thaodtpdhyd@gmail.com  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  76 ABSTRACT  EVALUATION OF HER2 STATUS IN BREAST CANCER BY FLUORESCENCE IN SITU  HYBRIDIZATION, DUAL IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOHISTOCHEMICTRY  Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 76 ‐ 82  Introduction: The application of FISH and D‐ISH methods to determine HER2 status in breast cancer in  order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate.  Methods:  FISH: Human  epidermal  growth  factor  receptor  2  (HER2)  fluorescence  in  situ  hybridization  (FISH) is a quantitative assay for selecting breast cancer patients for target therapy. D‐ISH: Our objective was to  apply  an  automated  dual  in  situ  hybridization  (D‐ISH)  application  for  HER2  gene  and  chromosome  17  centromere (CEN 17) in invasive breast carcinomas. (1) HER2 copies via silver in situ hybridisation (SISH) and  (2) Chromosome 17 (CEN17) copies via chromogenic Red in situ hybridisation (Red ISH) on a single slide. The  recognition of amplified HER2 copies which may require microscopic examination using objectives as high as  40X to 60X.  Result: 67 invasive breast cancer samples performed simultaneously IHC and FISH or D‐ISH. Including 47  samples were carried out simultaneously D‐ISH, FISH and IHC. 20 samples performed simultaneously D‐ISH  and  IHC. The concordance between results of  the  two methods  ISH with  results  IHC almost absolute among  HER2(‐)  and HER2(3  +). However,  in HER2(2  +),  the  amplification  rate  of HER2  gene  below  20%.  The  correlation between D‐ISH and FISH assays are 100%.  Conclusions:  In this study, the  concordance between IHC and D‐ISH, FISH assays  is  intermediate. The  concordance between FISH and D‐ISH was 100% for amplified and nonamplified cases. D‐ISH has become an  accepted method for HER2 testing, in this study, have shown that D‐ISH is an effective test for the determination  of HER2 status, with generally excellent concordance with FISH analysis. In addition, D‐ISH assays are easy to  use because they require only a standard bright‐field microscope and stained samples do not decay over time, that  we can be stored at room temperature. D‐ISH is, therefore, a viable alternative to FISH in laboratories in which  FISH testing is not, or cannot be, established. FISH or D‐ISH should be done for all patients in need of treatment  with Trastuzumab.  Keywords: IHC, FISH, D‐ISH, gene HER2  ĐẶT VẤN ĐỀ  Khuếch  đại gen HER2  là nguyên nhân  của  25% đến 30% ung thư vú(9,12), biểu hiện quá mức  của quá mức HER2 và/hoặc khuếch  đại gen  là  yếu  tố  tiên  lượng xấu,  thường kèm với  thụ  thể  nội tiết âm tính, tỉ lệ phân bào cao, nhân dị dạng,  đột biến gen p53 cho cả các trường hợp ung thư  vú di căn hoặc chưa. Tình trạng HER2 giúp cho  các nhà lâm sàng tiên đoán đáp ứng hóa trị liệu,  có hoặc không đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ  định  cho  điều  trị  kháng  thể  đơn  dòng  trastuzumab(1,7). Vì  tình  trạng HER2 giữ vai  trò  rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định điều  trị, những bệnh nhân có kết quả dương tính giả  không những không được hưởng lợi từ các liệu  pháp điều trị mà còn có nguy cơ bị gây độc cho  cơ tim khi điều trị kháng thể đơn dòng(10) ngược  lại, những bệnh nhân âm tính giả sẽ không nhận  được điều trị thỏa đáng. Điều này, đã khiến các  nhà nghiên cứu tập trung chú ý vào độ nhạy và  độ đặc hiệu của các xét nghiệm khác nhau dùng  để  xác  định  tình  trạng HER2. Các  xét  nghiệm  đánh  giá  HER2  phải  là  định  lượng  hoặc  bán  định  lượng,  có khả năng  lặp  lại và phải  là xét  nghiệm phân biệt  rõ  ràng giữa  các  tế bào ung  thư vú xâm lấn có hoặc không khuếch đại/biểu  hiện quá mức HER2(5,8).  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  77 Để xác định tình trạng HER2, phương pháp  lai  tại  chỗ huỳnh quang  được xem như  là  tiêu  chuẩn vàng, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi  phải có kính hiển vi huỳnh quang và phòng xét  nghiệm  chuyên  biệt,  hơn  nữa  là  các  tiêu  bản  huỳnh quang không thể lưu trữ được lâu dài để  xem xét lại vì tín hiệu huỳnh quang sẽ mất dần.  Hiện nay, phương pháp  lai  tại chỗ gắn bạc  dựa trên nguyên tắc phản ứng men có thể thay  thế  được  kỹ  thuật  FISH  để  đánh  giá  cả  gen  HER2 và centromere của nhiễm sắc  thể 17  trên  cùng một  tiêu bản. Với phương pháp này,  tiêu  bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học  và đặc biệt  là  lưu  trữ  tiêu bản được  lâu dài, có  thể  chẩn  đoán,  hội  chẩn,  xem  xét  lại  khi  cần  thiết. Chính vì thế, sau một thời gian thực hiện  kỹ  thuật  FISH  để  khảo  sát  sự  khuếch  đại  gen  HER2  hiện  nay  bộ  môn  chúng  tôi  thực  hiện  thêm kỹ thuật D‐ISH để khảo sát sự khuếch đại  HER2 và công  trình nghiên cứu này  là kết quả  bước đầu.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng  Bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vú xâm  lấn tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược  TP. Hồ Chí Minh.  Tiêu chuẩn chọn  Chọn  những  trường  hợp  đã  thực  hiện  phương pháp FISH, HMMD trước đó, trong đó,  15  mẫu  HER2(‐),  17  mẫu  HER2(2+),  15  mẫu  HER2(3+).  Chọn  ngẫu  nhiên  20  các  trường  hợp  bệnh  nhân bị ung  thư vú  được  chẩn  đoán vào năm  2013,  chưa  có  kết  FISH  nhưng  có  kết  quả  HMMD.  Phương pháp  Hóa Mô Miễn Dịch:  thực hiện  trên máy  tự  động  Ventana,  sử  dụng  PATHWAY™  HER2  (clone CB11)  là một kháng  thể  đơn dòng phát  hiện kháng nguyên c‐2erbB  trong các mẫu ung  thư.  Đã  được  FDA  (Food  and  Drug  Administration) chấp thuận để đánh giá thụ thể  HER2.  Bộ môn Giải Phẫu Bệnh  đã  tham gia kiểm  định chất  lượng xét nghiệm HMMD HER2 với  tổ  chức  United  Kingdom  National  External  Quality Assessment  Service  (UK NEQUAS)  và  đã đạt kết quả tốt.  Người khảo  sát HMMD  độc  lập với người  khảo sát FISH, D‐ISH.  Đánh giá theo thang điểm của nhà sản xuất:  0: màng tế bào u xâm  lấn hoàn toàn không  bắt màu.  1(+):  màng tế bào u xâm lấn bắt màu rải  rác, nhạt.  2(+):  màng  tế  bào  u  xâm  lấn  bắt màu  hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥ 30%.  3(+):  màng  tế bào u xâm  lấn màu hoàn  toàn, dày, đậm ≥ 30%.  Lai  tại chỗ huỳnh quang (FISH)(13): dùng bộ  kít  PathVysion  HER‐2  DNA  Probe.  Đã  được  FDA  (Food  and  Drug  Administration)  chấp  thuận để đánh giá gen HER2.  FISH được thực hiện theo quy trình của nhà  sản xuất với thay đổi nhỏ. Bộ kit bao gồm đoạn  dò PathVysion DNA Spectrum Orange‐đặc hiệu  cho gen HER2 và đoạn dò Spectrum Green đặc  hiệu  cho  các  trình  tự DNA  tại  tâm  động  của  nhiễm sắc thể 17 (CEP17).  Bộ môn Giải Phẫu Bệnh  đã  tham gia kiểm  định chất  lượng xét nghiệm FISH HER2 với  tổ  chức United Kingdom National External Quality  Assessment  Service  (UK NEQUAS)  và  đã  đạt  kết quả chấp nhận được.  Cách  đánh  giá  tiêu  bản  FISH:  theo  hướng  dẫn của ASCO/CAP. Tín hiệu SpectrumOrange  và SpectrumGreen  được  đếm  trong 20 nhân  tế  bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường  hợp  tỉ  lệ chưa phân định được khuếch đại hay  không hoặc giáp biên,  chúng  tôi  đếm  thêm  40  nhân tế bào ung thư. Tổng số tín hiệu màu cam  (HER2)  và  tín  hiệu màu  xanh  lá  cây  (CEP17)  được ghi nhận và tính tỷ lệ HER2/CEP17.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  78 Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,0: Không khuếch đại.  Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0: Khuếch đại.  Nếu 1,8 ≤ Tỉ lệ HER2/CEP17≤ 2,2, đếm thêm  40 tế bào.  Lai tại chỗ gắn bạc (D‐ISH)(2): sử dụng bộ kít  INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe. Đã được  FDA  (Food  and  Drug  Administration)  chấp  thuận để đánh giá gen HER2.  Nguyên tắc  Trong bộ kít INFORM HER2 Dual ISH DNA  Probe, bao gồm các đoạn dò gen HER2 và đoạn  dò centromere của nhiễm sắc thể 17 (CEN17).  Đoạn  dò  gen HER2  sẽ  được  gắn  với  chất  đánh dấu  là bạc,  sẽ hiển  thị  là những  tín hiệu  màu đen trong nhân tế bào.  Đoạn dò centromere của nhiễm sắc thể 17 sẽ  được gắn với chất đánh dấu là chất màu, sẽ hiển  thị là những tín hiệu màu đỏ trong nhân tế bào.  Trên  tiêu bản  luôn  luôn có nội chứng đó  là  các tế bào sợi, tế bào nội mô, lymphô bào, các tế  bào  này  sẽ  có  hai  tín  hiệu  màu  đỏ  của  centromere của nhiễm sắc thể 17 và hai tín hiệu  màu nâu của gen HER2 trong nhân.  Kỹ thuật  Mẫu  mô  phải  được  cố  định  đúng  (được  ngâm vào formol 10%, pH 7 trong vòng 60 phút  sau khi mẫu mô rời khỏi bệnh nhân và thời gian  tối ưu là từ 6‐48g).  Mẫu  mô  sẽ  được  xử  lý  thường  quy,  cắt  mỏng 4μ.  Tiêu bản sẽ được  lai, nhuộm  tự động bằng  máy BenchMark® XT.  Cách  đánh  giá:  Theo  hướng  dẫn  của  ASCO/CAP  Tiêu  bản  được  khảo  sát  trên  kính  hiển  vi  quang học, ở các vật kính 20, 40, 60.  Các  tiêu  chuẩn  bắt  buộc  khi  khảo  sát một  tiêu bản D‐ISH.  1. Các  tín hiệu của gen HER2, CEN17 phải  hiện diện  trên  tế bào nội  chứng  (tế bào  sợi,  tế  bào nội mô, lymphô bào).  2. Chỉ khảo  sát  tín hiệu HER2, CEN17  trên  vùng tế bào ung thư xâm lấn.  3. Nhuộm nền phải  được phân  biệt  rõ  với  các tín hiệu.  Xác  định vùng  tế bào ung  thư  xâm  lấn và  đếm số  tín hiệu HER2, CEN17 của 20  tế bào u,  lấy tỉ lệ trung bình cộng của HER2/CEN17 sẽ xác  định được số bản sao của gen HER2.  Tín hiệu HER2 có màu đen nằm trong nhân,  có  thể  là  từng  tín hiệu riêng  lẻ hoặc  từng cụm.  Để  xác  định  mỗi  cụm  là  bao  nhiêu  tín  hiệu  thường  là do người khảo  sát  ước  lượng khi  so  sánh kích thước các cụm với các tín hiệu riêng lẻ.  Tỉ  lệ HER2/CEN17 < 2,0: Không khuếch đại  gen HER2.  Tỉ  lệ  HER2/CEN17  ≥  2,0:  Khuếch  đại  gen  HER2.  Nếu 1,8 ≤ Tỉ lệ HER2/CEP17≤ 2,2, đếm thêm  20 tế bào.  KẾT QUẢ  Chúng tôi khảo sát 67 mẫu ung thư vú được  làm  đồng  thời  HMMD  và  FISH  hoặc  D‐ISH  được kết quả như sau:  Kết quả hóa mô miễn dịch và FISH  Trong  nhóm  này  chúng  tôi  chọn  những  trường hợp vừa có kết quả HMMD vừa có kết  quả FISH, bao gồm 47 trường hợp.  Bảng 1: Kết quả hóa mô miễn dịch và FISH.  HMMD FISH Không khuếch đại gen HER2 Khuếch đại gen HER2 TC Âm tính 15 0 15 2+ 14 3 17 3+ 0 15 15 Tổng cộng 29 18 47 Trong  công  trình  nghiên  cứu  trước  đó  với  hơn 300 mẫu ung  thư vú có  thực hiện HMMD  và FISH, kết quả đã được công bố. Một số  tiêu  bản  làm  FISH  chúng  tôi  đã  gửi  đánh  giá  chất  lượng tại UK NEQUAS và kết quả là Chấp nhận  được.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  79 Chúng  tôi  chọn ngẫu nhiên  47  trường hợp  có HMMD 1+, 2+, 3+ và kết quả được trình bày  trên Bảng 1.  Kết quả FISH và D‐ISH  Bảng 2: Kết quả FISH và D‐ISH.  FISH D-ISH Không đánh giá được Không khuếch đại gen HER2 Khuếch đại gen HER2 TC Không khuếch đại gen HER2 13 16 0 29 Khuếch đại gen HER2 (2+) 6 0 12 18 Tổng cộng 19 16 12 47 Trong 47 mẫu  thực hiện đồng  thời FISH và  D‐ISH,  đối  với  D‐ISH  chúng  tôi  chia  nhỏ  ra  nhiều  nhóm, mỗi  nhóm  được  nhuộm  với một  quy trình khác nhau, để chọn ra quy trình tối ưu  nhất.  Có  19 mẫu  là  không  đánh  giá  được  do  nhuộm nền, không tín hiệu. Có 28 mẫu là đánh  giá được và tỉ lệ phù hợp giữa hai phương pháp  là 100%.  Kết quả hóa mô miễn dịch và D‐ISH  Sau khi tối ưu hóa được quy trình, chúng tôi  nhuộm tiếp 20 mẫu ung thư vú được chẩn đoán  vào năm 2013.  Sau  giai  đoạn  thực  hiện  trên  mẫu  bệnh  phẩm  vừa  có HMMD  vừa  có  FISH,  chúng  tôi  thực hiện D‐ISH ở những mẫu bệnh phẩm ung  thư vú được chẩn đoán năm 2013. Bảng 3, bao  gồm cả hai giai đoạn.  Bảng 3. Kết quả hóa mô miễn dịch và D‐ISH.  HMMD D-ISH Không đánh giá được Không khuếch đại Khuếch đại gen HER2 TC Âm tính 8 17 0 25 2+ 6 12 3 21 3+ 7 0 14 21 Tổng cộng 21 29 17 67 Trong  21  mẫu  không  đánh  giá  được  bao  gồm  cả 19 mẫu  trong giai  đoạn 1. Mặc dù,  đã  chuẩn  hóa  kỹ  thuật  trong  giai  đoạn  1,  nhưng  trong giai đoạn 2 khi thực hiện chúng tôi vẫn có  thêm 2 mẫu không đánh giá được.  Lý do các tiêu bản không đánh giá được  Nhuộm nền không phân biệt  được với  các  tín hiệu.  Tín hiệu không rõ, không có tín hiệu.  Có hoặc  tín hiệu HER2 hoặc  tín hiệu CEN  17.  BÀN LUẬN  Về kết quả HMMD  Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu trong  và ngoài nước ứng dụng nhiệu  loại kháng  thể  khác nhau, thực hiện theo nhiều cách khác nhau  công bố về tỉ lệ biểu hiện quá mức của thụ thể  HER2 trong ung thư vú. Tuy nhiên cho tới hiện  nay có hai xét nghiệm đã được FDA chấp thuận  dùng  để  xác  định biểu hiện quá mức  của  thụ  thể  HER2  trên  bệnh  nhân  ung  thư  vú:  HercepTest  (DakoCytomation,  Glostrup,  Đan  Mạch), Pathway (Ventana Medical Systems Inc,  Tucson, Ariz).  Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ  Pathway (Ventana Medical Systems Inc, Tucson,  Ariz) dùng trên máy nhuộm tự động. Qui trình  nhuộm máy đã giảm thiểu được nhuộm nền và  các tình trạng nhuộm không đặc hiệu.  Trong số 67 trường hợp, các các tiêu bản đều  có đủ biểu mô lành tính để đánh giá nhuộm nền  theo một số nghiên cứu của các tác giả Jacobs và  cộng  sự(6) và Lehr và cộng  sự(3,6). Biểu mô bình  thường có thể bắt màu ở màng đáy và màng bên  nhưng các bề mặt tế bào biểu mô và các tế bào  cơ biểu mô xung quanh ống luôn luôn âm tính.  Trong hai năm trở lại đây, Bộ môn Giải Phẫu  Bệnh  đã  tham  gia  kiểm  định  chất  lượng  xét  nghiệm Hóa Mô Miễn Dịch HER2 tại UKNEQAS  ICC  &  ISH  (UK  National  External  Quality  Assessment Service) và đã đạt kết quả tốt.  Về kết quả FISH  Ứng  dụng  kỹ  thuật  FISH  để  đánh  giá  sự  khuếch  đại  gen HER2  đã  được  Slamon nghiên  cứu  thành  công  và  năm  1997.  Đặc  biệt,  đến  tháng  9/1998  một  loại  kháng  thể  đơn  dòng  kháng  HER2  (Trastuzumab)  được  FDA  chấp  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  80 thuận cho điều trị ung thư vú giai đoạn trễ. Sau  đó rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ  thuật  lai  tại  chỗ  trên  mô  vùi  nến.  Hiện  nay,  phương  pháp  được  xem  là  “tiêu  chuẩn  vàng”  dùng để đánh giá tình trạng HER2 là FISH(13,6).  Chúng tôi dùng bộ kit Path Vysion, đã được  FDA chấp thuận.  Phần lớn các trường hợp chúng tôi đều thực  hiện  thành  công,  tuy  nhiên  có một  số  trường  hợp chúng tôi phải lặp lại nhiều lần mới đạt kết  quả. Quan  trọng nhất  là  thời gian khử protein  màng nhân phải phù hợp, nếu quá ngắn protein  màng  nhân  chưa  tiêu  hết  đưa  đến  đoạn  dò  không bắt  cặp  được nhưng nếu quá dài màng  nhân tan hết sẽ mất hết tín hiệu di truyền(13).  Thuận lợi khi thực hiện FISH: Phần lớn quy  trình là chúng tôi làm bằng tay, đặc biệt  là thời  gian khử màng nhân, chúng tôi có thể tăng hoặc  giảm tùy theo mẫu mô cho nên ít bị ảnh hưởng  hàng loạt ca. Tín hiệu rõ, sắc nét, đếm tín hiệu dễ  hơn.  Khó khăn: Phải khảo sát tiêu bản dưới kính  hiển vi huỳnh quang, chất huỳnh quang sẽ giảm  dần cho nên chúng tôi không thể xem xét lại khi  cần thiết.  Về kết quả D‐ISH  Đây  là  phương  pháp  tương  đối  mới,  đã  được FDA  chấp  thuận vào  tháng 6/2011, dùng  để khảo sát gen HER2 cho bệnh nhân ung  thư  vú.  Thuận lợi  Ưu điểm  lớn nhất của phương pháp D‐ISH  là có thể đánh giá số  lượng bản sao gen HER2,  CEN17 và các đặc điểm mô bệnh học cùng một  lúc vì vậy việc xác định chính xác vùng  tế bào  ung thư xâm lấn dễ dàng hơn. Ngoài ra, các tín  hiệu không bị phân hủy  theo  thời gian, do  đó  tiêu bản có thể được lưu trữ trong một thời gian  dài ở nhiệt độ phòng, có thể xem xét lại khi cần  thiết  và  có  thể  nhiều  người  khảo  sát  cùng  lúc  dưới kính hiển vi quang học nhiều đầu.  Khó khăn  Vì quá trình nhuộm thực hiện hoàn toàn tự  động bằng máy cho nên đòi hỏi những yêu cầu  nghiêm  ngặt  về  tính  đồng  bộ  của  mẫu  (thời  điểm  cố định,  thời gian  cố  định, dung dịch  cố  định). Đây là giai đoạn chìa khóa, nếu mẫu được  cố định trong dung dịch Formol 10%, pH=7, thời  điểm  cố định không quá 60 phút  sau khi mẫu  mô  rời  khỏi  người  bệnh  nhân  và  thời  gian  cố  định  từ 6‐48 giờ  thì kết quả  lai  rất  tốt. Những  mẫu không được cố định tốt thì khó có được kết  quả  tốt mặc dù  thay  đổi nhiều quy  trình khác  nhau nhưng vẫn chưa  tìm  thấy được quy  trình  thích hợp.  Bảng 4: So sánh những khó khăn và thuận lợi giữa các phương pháp đánh giá HER2 trong ung thư vú (4).  Phương pháp Ưu điểm Nhượ