Đề tài Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái cây hoa huệ hương (Polianthes Tuberosel) in vitro

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. 28 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. 29 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 29 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. 29 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. 30 Bảng 3.1. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. 33 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.4. Ảnh hưởng ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy sau 8 tuần nuôi cấy 37 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Polianthes tuberose L. 13 Hình 2.1. Hoa Huệ Hương 26 Hình 2.2. Củ hoa Huệ Hương 26 Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 2mg/l Kinetin 36 Hình 3.2. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 4mg/l BA 39 Hình 3.3. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 41 Hình 3.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 41 Hình 3.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA 42 Hình 3.6. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 42 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS: Murashige and Skoog, 1962 BA: Benzyl adenin IBA: Indol butyric acid α-NAA: α-naphtyl acetic acid 2,4-D: 2,4 diclorophenoxy acetic acid IAA: Indol acetic acid LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa Huệ Hương được nhập vào nước ta từ rất lâu. Cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xóa đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này. Hiện nay, việc canh tác cây hoa Huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa này ngày càng thoái hóa. Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa Huệ Hương xuất hiện nhiều, đặc biệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hoa. Bệnh không làm cho cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ, hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân. Các triệu chứng bệnh do virus được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện ở cây hoa Huệ Hương ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân? Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn có của giống. Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng được nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng. Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu khó khăn của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bông trên cây hoa Huệ Hương, một giống hoa Huệ quý mang lại hiệu quả cao cho nông dân. Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ đã được tiến hành thử nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cây, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái. Kết quả nghiên cứu đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây hoa. Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa Huệ. 5. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình phát sinh hình thái của mầm ngủ trên củ hoa Huệ Hương. Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA, 2,4-D, IAA. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con. Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống. 1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào. Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tại độc lập. Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt hóa về chức năng khác nhưng không thành công. Điều đó đã giảm sự tin tưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong thời gian dài. Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thí nghiệm của ông. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng, dịch chiết nấm men. Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6). Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA. Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cây cà rốt, đây cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn. Bằng cách thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hóa trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng. Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn. Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp như naphthylacetiic acid (NAA), 2,4-Diclophenoxyacetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D đã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy. Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là 6-Furfuryl aminopurin (kinetin). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ 2. Năm 1957, Miller và Skoog đã công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ. Hiện nay, những kết quả này cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Miller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật. Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế báo thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai lang và hoa lan. Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là vi nhân giống. Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 1.3. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một quá trình định sẵn. 1.4. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những ưu điểm chính : - Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. - Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. - Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. - Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội). - Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen. - Có khả năng sản xuất quanh năm. - Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. - Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36 - 1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà. Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1945) đã chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952). Nguyên nhân của hiện tượng này là: - Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập. - Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus. - Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus. Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc cách mạng về hệ số nhân. Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973). Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau: - Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. - Cây có thể có những đặc tính không mong muốn. - Khả năng tạo đột biến tăng. - Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần. - Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ cho những mục đích sau: - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây than thảo. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm than gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen. 1.5. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau: - Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp. Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá…), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn… thậm chí cả mẫu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành…) cũng được dùng cho nuôi cấy. - Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy. Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, dòng lúa non… ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm. Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy. Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70 - 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lý bằng dung dịch diệt khuẩn. Đối với những mẫu có bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho them vào dung dịch khử trùng vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol…vì các chất này làm tăng tính bám dính của hóa chất khử trùng. Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy. Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy vì vậy việc lực chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hóa chất hay được sử dụng để khử trùng thì Calcium hypoclorite và natri hypoclorite là hay được sử dụng hơn cả vì có tính độc thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của Calcium hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5 - 15% và 0,5 - 2% trong thời gian 15 - 30 phút. Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay được dùng để thay thế. - Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển nuôi cấy theo định hướng. Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khác nhau. Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hóa chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hóa và chiều hướng phân hóa của tế bào. Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra : môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chính Murashige (1974) đã dung môi trường này để nuôi cấy nhiều loài cây trồng. Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau : muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chloride, nitrate, sulphate, chất tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi… Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng với nồng độ từ 10-1 M đến 10-6 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Auxin được thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo. Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (indol butyric acid), α-NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indool acetic acid). Cytokinin là nhóm phytohormone dẫn xuất của adenine, có vai trò sinh lý tương tự nhau. Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy… Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ. Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy là kinetin, BAP (benzylaminopurin) với nồng độ 10-4 - 10-7 M. Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằng này nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi. Ở