Đề tài Lên men ethanol với vi khuẩn zymomonas mobilis

ĐỒ ÁN MÔN HỌCCÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊN MEN ETHANOL VỚI VI KHUẨN ZYMOMONAS MOBILIS GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn SVTH : Văn Thị Ánh Minh Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn Zymomonas mobilis 1. Một số nguồn phân lập Z. mobilis 2. Đặc điểm nhận dạng: Là một loài vi khuẩn gram âm, có roi dài từ 1 – 1.4µm Không hình thành bào tử Một số loài có từ 1 -4 tiên mao. Không phát triển trên môi trường thạch hoặc nước thịt dinh dưỡng. Là loài vi khuẩn vi hiếu khí (kỵ khí không bắt buộc) Có thể lên men đường glucose và fructose Tạo ra số mol ethanol và CO2 bằng nhau Chứa khoảng 47.5 – 49.5% guanine và cytosine (G+C). Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn Zymomonas mobilis 3. Danh pháp Zymomonas mobilis Giống : Zymomonas Loài : Zymomonas mobilis Loài phụ Zymomonas mobilis subsp. mobilis Chủng tiêu biểu : ATCC 10988 (NCIB 8938, NNRL B-806, DSM 424, IMG 1655, L192) Loài phụ Zymomonas mobilis subsp. pomaceae Chủng tiêu biểu : ATCC 29192 (NCIB 11200) Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn Zymomonas mobilis 4. Thành phần hóa học của tế bào: 5. Điều kiện sinh trưởng: pH = 3.5 – 7.5 Nhiệt độ: 25 - 30oC Nồng độ ethanol là 5.5% Nồng độ glucose là 20% Nồng độ NaCl 1% Rất nhạy cảm với thuốc nhuộm (brilliant green, malachite green…) … Chương 1: Giới thiệu về loài vi khuẩn Zymomonas mobilis Chương 2: Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol bởi Zymomonas mobilis Cơ chế lên men chính của vi khuẩn Zymomonas từ nguồn cơ chất glucose và fructose là con đường Entner-Doudoroff. Con đường Entner – Doudoroff Do đó cân bằng chung của con đường KDPG là : Glucose  2 piruvat + ATP + NADH2 + NADPH2 Các enzyme của con đường Entner – Doudoroff có thể kháng cự tốt hơn với ethanol nên Z. mobilis có thể nhanh chóng hấp thu glucose và sản xuất ethanol nhiều hơn 15% w/v. Màng tế bào của Z. mobilis có chứa nhiều loại acid béo giúp nó chịu được nồng độ ethanol cao. Chương 2: Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol bởi Zymomonas mobilis Sự hình thành các sản phẩm phụ 1. Sản phẩm phụ là Acrolein 2. Sản phẩm phụ là sorbitol 3.Sản phẩm phụ là glycerol 3-phosphate, dihydroxyacetone và glycerol Chương 2: Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol bởi Zymomonas mobilis Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.1. Nồng độ đường ban đầu Hiệu suất lên men cực đại ứng với 15% (w/v) nồng độ đường ban đầu. Gia tăng nồng độ đường ban đầu từ 15–20% sẽ làm giảm hiệu suất lên men. Với 25 % (w/v) tất cả các chủng đều giảm khả năng hấp thu cơ chất và lên men ethanol. Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.2. Cơ chất 1.2.1. Glucose hoặc fructose Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.2. Cơ chất: 1.2.2. Hỗn hợp glucose và fructose Với cùng một nồng độ trong hỗn hợp glucose và fructose thì fructose được Z. mobilis hấp thu chậm hơn, do : Sự kìm hãm enzyme fructokinase bởi glucose. Enzyme glucose-fructose oxidoreductase xúc tác phản ứng hình thành sorbitol từ fructose, một chất giúp Z. mobilis chịu được áp suất thẩm thấu trong môi trường có nồng độ đường cao. Cơ chế tích lũy và chuyển hóa glucose và fructose ở Z. mobilis Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.2. Cơ chất: 1.2.3. Hỗn hợp glucose và xylose Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.2. Cơ chất: 1.2.3. Hỗn hợp glucose và xylose Tốc độ sinh trưởng, sử dụng cơ chất riêng, sản lượng sinh khối và sản xuất ethanol trên cơ chất là xylose của chủng Z.mobilis ZM4 (pZP5) tái tổ hợp thấp hơn trên cơ chất là glucose hoặc hỗn hợp glucose – xylose. Z. mobilis hấp thu đường glucose trước, còn xylose thì được hấp thu sau với tốc độ chậm hơn ●- Xylose;  - glucose; ■- ethanol; - sinh khối. - xylitol;  - acetic acid; □, glycerol; - acetoin. Sự lên men của chủng tái tổ hợp ZM4 (pZB5) trên các cơ chất khác nhau Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.2. Cơ chất: 1.2.4. Arabinose 3 L-arabinose + 3ADP + 3 Pi  5 ethanol + 5CO2 + 3ATP + 3H2O (mol) Hiệu suất ethanol lý thuyết là 0.51 g ethanol/g L-arabinose hoặc 1.67 mol ethanol/ mol L-arabinose. Có hơn 27g/lít ethanol được sản xuất ra trong môi trường có nồng độ glucose và arabinose ban đầu cao với pH =5.25. Do bị kìm hãm cạnh tranh bởi glucose nên arabinose sẽ bị hấp thu chậm hơn, khi glucose cạn kiệt, arabinose sẽ được hấp thu nhanh chóng ngay sau đó. Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.3. Nồng độ glucose Bảng 16 : Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol và sử dụng glucose bởi 2 chủng thuộc loài Z. mobilis trong lên men tĩnh (30oC, thời gian lên men 48 giờ và 72 giờ cho nồng độ glucose là 250g/l) Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.4. pH ban đầu Hiệu suất lên men đạt cực đại ở pH 7 và thấp nhất ở pH 4, chứng tỏ nếu gia tăng pH ban đầu thì sự hấp thu cơ chất và hiệu suất lên men cũng tăng. Do đó pH tối ưu cho sự lên men ethanol với Z. mobilis được chọn là 7. Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.5. Nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 30oC. Khi nhiệt độ của môi trường lên men tăng từ 30 – 36oC (nồng độ glucose không đổi trong hỗn hợp nhập liệu) thì nồng độ sinh khối giảm và tốc độ hấp thu glucose tăng dần. Khi tăng nhiệt độ khoảng 2 – 3oC, hiệu suất chuyển hóa glucose tăng từ 82% đến 90%. Tuy nhiên, nhiệt độ cao quá mức sẽ có nhiều glucose thất thoát trong canh trường, hiệu suất chuyển hóa giảm còn 65%. Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.6. Nồng độ ethanol ban đầu Nếu có ethanol ban đầu trong môi trường dinh dưỡng thì sẽ làm giảm sản xuất sinh khối, hấp thu cơ chất, sản xuất ethanol, hiệu suất và hệ số chuyển hóa đường. Cụ thể : Với môi trường là sucrose có 2.5% ethanol ban đầu thì hiệu suất ethanol giảm 48.8%, hiệu suất sinh khối giảm 25% và tổng lượng đường hấp thu giảm 28.3%. Với môi trường là glucose có 3% ethanol ban đầu thì hấp thu đường giảm 60 – 65%. (Moreau và cộng sự, 1997). Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men1.6. Nồng độ ethanol ban đầu Ở nồng độ ethanol rất cao (20%, wt/vol), sự lên men bị kìm hãm hoàn toàn. Thêm ethanol vào quá trình lên men sẽ ức chế khả năng lên men của tế bào Z. mobilis . Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis2. Phương pháp thực hiện2.1. Vi khuẩn tự do Khả năng kết bông của Z. mobilis : So với bông tụ của nấm men, bông tụ của Z. mobilis có thể chịu được điều kiện pH cao hơn (pH 6). Z. mobilis có thể sản xuất ra các polyme nhân tạo như polyarcylamide, polyethylenimine và chitosan hoặc các đại phân tử ngoại bào như polysaccharide (levan, cellulose). Những chủng Z. mobilis này có hiệu suất chuyển hóa glucose và fructose cao (gần 96%) và năng suất ethanol đạt cực đại ở độ pha loãng 0.9 – 1.8h-1. Hình ảnh Zymomonas mobilis ở trạng thái đơn lẻ và kết bông Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis2. Phương pháp thực hiện2.1. Vi khuẩn tự do Lên men liên tục : Nhiệt độ lên men trong thiết bị khoảng 27 – 37oC. Điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt (có thể sục một dòng khí trơ vào thiết bị). Nhờ khả năng kết bông, vi khuẩn sẽ nhanh chóng lắng xuống đáy thiết bị. Dung dịch chỉnh pH : KOH, NaOH hoặc HCl. Sử dụng thiết bị lên men tầng sôi (Fluidized Bed Reactor) : đạt nồng độ ethanol 58 – 60g/l với năng suất sản xuất ethanol là 28g/l.h trong 30 ngày. Hệ thống bồn lên men 1 và 2: bơm nhu động 3 : ống dẫn sản phẩm ra 4: bộ phận trao đổi nhiệt Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis2. Phương pháp thực hiện2.1. Vi khuẩn tự do Lên men bán liên tục : Với phương pháp này, tế bào sẽ kết bông và lắng xuống đáy thiết bị, ethanol được tháo ra và một dòng môi trường mới sẽ được cho vào thiết bị lên men một cách định kỳ. Sự tháo sản phẩm định kỳ được thực hiện nhờ lớp chất lỏng nổi trên bề mặt có chứa ethanol. Thể tích dòng lỏng có chứa ethanol nổi trên bề mặt có thể chiếm từ 60 – 90% thể tích của môi trường lên men. Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis2. Phương pháp thực hiện2.1. Vi khuẩn tự do Lên men bán liên tục : Một số lượng tế bào sẽ được giữ lại trong thiết bị với mong muốn là giữ được càng nhiều càng tốt. Khoảng 95 -99% tế bào vi khuẩn được giữ lại trong thiết bị sau khi tháo sản phẩm. Điều kiện môi trường : pH=5.0, T=30oC. Mô hình thiết bị lên men có tái sử dụng tế bào Z. mobilis Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis2. Phương pháp thực hiện2.2. Vi khuẩn cố định Lên men liên tục : Chất mang thường sử dụng là gel alginate,  – carrageenan. Mô hình thiết bị lên men liên tục FBR Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis2. Phương pháp thực hiện2.2. Vi khuẩn cố định Lên men liên tục : Phương pháp hấp phụ: Tế bào Z. mobilis được hấp phụ lên bề mặt của lớp chất mang và từ đó hình thành màng sinh học. Chất mang sử dụng : chất khoáng vermiculite (Bland và cộng sự), polypropylene hoặc các hợp chất dẻo, hạt nhựa cationit (thích hợp nhất) (Krug và Daugulis)… Nồng độ tế bào có thể đạt đến 74 g/l. Thiết bị: CSTR liên tục (Continuous Stirred Tank Reactor), CSTR trục quay,PBR (Packed Bed Reactor), TBR (Trickling Bed Reactor), FBR (Fluidized Bed Reactor). Mô hình một số thiết bị lên men liên tục Chương 3: Phương pháp lên men ethanol với Zymomonas mobilis3. Ứng dụng lên men ethanol trong công nghiệp Chương 4: So sánh lên men ethanol với vi khuẩn Z. mobilis và lên men ethanol với nấm men Saccharomyces cerevisiae Nhược điểm của nấm men: Thời gian lên men dài (30 – 70 giờ ứng với 9% -11% (v/v) ethanol đối với cơ chất là glucose). Tốc độ hấp thu và sản xuất glucose thấp. Có sự hình thành các sản phẩm phụ như: glycerol, amyl alcohol và các dầu rượu tạp khác. Hiệu suất chuyển hóa glucose thành ethanol thấp (85 – 91%). Nhạy cảm với nồng độ cơ chất (đường) và nồng độ sản phẩm cuối (ethanol). Chương 4: So sánh lên men ethanol với vi khuẩn Z. mobilis và lên men ethanol với nấm men Saccharomyces cerevisiae Một số ưu điểm của Z. mobilis là : Là một chủng vi sinh vật có khả năng lên men tự nhiên (Natural fermentative microorganism - GRAS) Tạo ra ít sinh khối tế bào Không cần cung cấp oxy Có thể kháng cự với các chất kìm hãm có trong sản phẩm thủy phân. Lên men ở pH thấp Có thể sinh trưởng ở nồng độ glucose cao Chương 4: So sánh lên men ethanol với vi khuẩn Z. mobilis và lên men ethanol với nấm men Saccharomyces cerevisiae Một số ưu điểm của Z. mobilis là : Tạo ra sản lượng ethanol cao từ glucose (95-98% hoặc 0.49-0.50 g/g) Khả năng chịu được nồng độ ethanol cao (13% ethanol từ 30% glucose) Hiệu suất sản xuất riêng cao (2-6 g ethanol / g chất khô.giờ) Tốc độ hấp thu đường glucose cao ( có thể lên đến 10 g glucose g/g chất khô.giờ) Chương 4: So sánh lên men ethanol với vi khuẩn Z. mobilis và lên men ethanol với nấm men Saccharomyces cerevisiae Nhược điểm của Z. mobilis là : Giới hạn cơ chất hẹp, không có khả năng chuyển hóa các polysaccharide phức tạp như: cellulose, hemicellulose và tinh bột thành ethanol. Tạo ra một số sản phẩm phụ như: sorbitol, acetoin, glycerol và acid acetic. Hình thành một loại polymer levan ngoại bào. Chương 4: So sánh lên men ethanol với vi khuẩn Z. mobilis và lên men ethanol với nấm men Saccharomyces cerevisiae Xin cám ơn thầy cô và các bạn đã quan tâm theo dõi