Đề tài Phương pháp phân tích Aflatoxin

Phương pháp phân tích Aflatoxin - 1 - LỜI NÓI ĐẦU Gần đây tình trạng mất an toàn thực phẩm được đề cập đến như một mối nguy hiểm đe dọa trực tiếp đến sức khỏe của cộng đồng. Các thông tin về nạn ngộ độc hàng loạt xảy ra ở nhiều nơi. Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc đó là do Aflatocxin. Bên cạnh Ochratoxin thì Aflatoxin cũng là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus. Trong thực tế, ở điều kiện thời tiết nóng và ẩm của Việt Nam thì các chủng nấm này sẽ phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản như ngô, lạc, đậu…, thức ăn gia súc, gia cầm ! Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 2 - MỤC LỤC 1.Tổng quan 1.1.Công thức ........................................................................................... 3 1.2.Nguồn gốc .......................................................................................... 4 1.3.Đặc điểm ............................................................................................ 5 1.4.Tác hại trong thực phẩm ..................................................................... 6 1.5.Tác hại đối với cơ thể ......................................................................... 7 1.6.Liều lượng cho phép ........................................................................... 8 2.Phân tích 2.1.Loại trừ aflatoxin bằng biện pháp phòng chống sinh học .................... 9 2.2.Nguyên lý phương pháp ...................................................................... 9 2.3.Dụng cụ .............................................................................................. 10 2.4.Hóa chất, thuốc thử ............................................................................. 10 2.5.Chuẩn bị ............................................................................................. 11 2.6.Định lượng.......................................................................................... 12 2.6.1.Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 12 2.6.2.Chiết suất .................................................................................. 12 2.6.3.Làm sạch mẫu bằng cột sắc kí ................................................... 12 2.6.4.Lớp sắc kí mỏng một chiều ....................................................... 13 2.6.5.Thử nghiệm sự khẳng định sự có mặt của aflatoxin ................... 14 2.6.6.Đánh giá kết quả ....................................................................... 14 2.7.Định lượng.......................................................................................... 15 2.7.1.Bằng mắt ................................................................................... 15 2.7.2.Bằng máy đo mật độ huỳnh quang ............................................ 15 2.8.Độ nhạy của phương pháp .................................................................. 16 3.Đề xuất giải pháp 3.1.Biện pháp phòng chống ...................................................................... 16 3.2.Hạn chế sự nhiễm aflatoxin ................................................................. 16 3.3.Kiểm tra .............................................................................................. 17 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 3 - 1.TỔNG QUAN : 1.1.Công thức: B1 (C17H12O6 ), B2 (C17H14O6 );G1 (C17H12O7 ); G2 (C17H14O7)….. Công thức cấu tạo Aflatoxin (B1,B2,G1,G2…) Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 4 - 1.2.Nguồn gốc : Trong số 200.000 loại nấm mốc khác nhau, khoảng 50 loài là có hại cho người và động vật. Các loại này có thể chia thành hai nhóm: Nhóm gây bệnh dịch và nhóm gây ngộ độc. Ðã từ lâu độc tố nấm ít được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu, kể cả các nước tiên tiến có đời sống cao. Tuy nhiên trong những năm 1920-1930 ở Anh và Liên Xô đã thấy xuất hiện nhiều trường hợp ngộ độc Alcaloit ở người, và gà mà chất này có trong lúa mạch, lúa mì. Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc. Ðến năm 1960 nhân một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra độc tố Anatoxin, một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus. Năm 1961, ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan. Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50-60% số mẫu đó có Aflatoxin. Ðồng thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình) cũng thấy có 30-50% số mẫu có độc tố Aflatoxin. Ở Việt Nam cho đến nay còn ít có những công thành công bố về vấn đề này. Theo kết quả của Viện VSDT đã nghiên cứu trên 29.381 mẫu lương thực thực phẩm thấy có 30 loại men mốc khác nhau, trong đó mốc Aspergillus chiếm tỉ lệ cao nhất (5,2 - 80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau. Trong số đó có 11 chủng có khả năng sinh độc tố. Năm 1984, theo tài liệu của Viện dinh dưỡng quốc gia đã nghiên cứu trên 200 mẫu gạo bán ở Hà Nội thấy ở 2 mẫu có nhiều nấm Aspergillus Flavus, một loại nấm có khả năng tạo ra Aflatoxin. Bảng : Các sản phẩm có thể nhiễm Aflatoxin. Các hạt ngũ cốc Ngô, thóc gạo, lúa mì, bo bo…. Hạt có dầu Lạc, bong, dừa, đậu tương, hướng dương…. Củ Sắn, khoai tây…. Sữa Sữa tươi, pho mat…. Thủy sản Cá, tôm …. Sản phẩm lên men Bia, nước giải khát, rượu vang… Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 5 - 1.3.Đặc điểm : Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200C, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp bao gồm 6 loại (B1, B2, G1, G2, M1 và M3). Aflatoxin B1 là loại cực độc. Một lượng 0,03 ppm aflatoxin B1 từ khô lạc gây ra u gan. Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus, các chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu... trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến từ lâu, và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Hình : Nấm Aspergillus Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh, nhiều khuẩn ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng, đặc biệt có vách ngăn ngang có một lổ nhỏ để cho tế bào chất thông thương qua lại giữa hai tế bào; Khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới. Có 2 hình thức sinh sản:  Sinh sản vô tính: Khuẩn ty hình thành một cọng mang bào tử (conidiophore) và bào tử đính (conidia) với cọng mang túi bào tử không vách ngăn và không xuất phát từ tế bào chân (foot cell). Túi hay bọng (vesicle) là tế bào đa nhân và phát triển bề mặt gắn liền với thể bình (phialide hay sterigmata). Thể bình với bậc 1 hay bậc 2, mỗi thể bình là cấu trúc đa nhân và trên đầu thể bình tạo thành một Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 6 - chuổi bào tử đính, những bào tử non ở trong và càng xa càng già; bào tử trưởng thành sẽ phóng thích vào không khí và nẩy mầm.  Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính chỉ được phát hiện ở một vài loài, chúng thành lập những bộ phận sinh dục là túi đực (hùng khí antheridia) và túi noãn (ascogonia).  Noãn phòng: Phát triển từ khuẩn ty ở thể có vách ngăn đồng thời tách ra một bộ phận gọi là cuống túi noãn (archicarp), ống noãn bào (trichogyne) kéo dài và tạo thành noãn phòng để kết hợp với giao tử, tất cả tế bào của cuống túi noãn là đa nhân và cuống lại giống như đồng tiền hay vòng xoắn.  Hùng cơ: Hùng cơ phát triển trong nhánh chung với túi noãn, sau đó nhánh này phát triển thành giao tử (pollinodium), nhành này tiến tới ống noãn bào và cắt phần ra gọi là hùng cơ, phần còn lại gọi là cuống hay thân (stalk), hùng cơ cũng là những tế bào đa nhân.  Phối hợp tế bào chất (plasmogamy): Đầu của hùng cơ tiếp xúc với ống noãn bào và vách tế bào của hai đầu này tan ra để hai tế bào chất này trộn với nhau.  Phát triển bao nang : Khi bắt đầu hợp nhân, nhân đơn bào trong túi noãn sẽ nhân đôi, mỗi tế bào nhị bội tạo ra sợi noãn (ascogenous hyphae), hai nhân của mỗi sợi noãn tiếp tục phân chia và tạo thành sợi noãn đa nhân, có vách ngăn ngang, cuối cùng tế bào cuống lại thành tế bào đơn nhân, như vậy trong mỗi tế bào có vách ngăn của sợi noãn có hai nhân và sẽ phát triển thành tế bào nang sau. Hai nhân trong nang sẽ tạo thành nhân tiếp hợp nhị và một gồm một bội; Nhân nhị bội trong nang giảm phân thành 4 nhân đơn bội và mỗi nhân đơn bội sẽ đẳng phân để cho 8 nhân đơn bội, mỗi nhân sẽ hình thành màng bao và phát triển thành một nang bào tử.Như vậy nang và bào tử nang phát triển từ sợi noãn và nhiều sợi noãn phát triển tạo ra một bao nang vách dầy chứa nhiều nang bên trong và nhiều bao nang nằm trong một túi lớn có vách gồm nhiều lớp tế bào gọi là túi bào tử (peridium), thể quả của bao nang gọi là Tử nang thể (Cleistothecium). Nang chứa 8 bào tử nang và khi bào tử nang trưởng thành thì vỏ nang vở ra và bào tử nang nằm trong Tử nang thể và khi nào Tử nang thể vở ra thì bào tử phóng thích ra bên ngoài.  Bào tử nang : vỏ bào tử Mỗi bào tử có đường kính khoảng 5 một đai mỏng bên ngoài và mỗi bào tử nang nẩy mầm cho một khuẩn ty mới. 1.4.Tác hại trong thực phẩm : Đối với thức ăn chăn nuôi nếu điều kiện chế biến bảo quản không tốt gây ra những thiệt hại cho ngành chăn nuôi, theo FAO có khoảng 25% lượng ngũ cốc cung Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 7 - cấp thế giới có chứa độc tố từ nấm, ở châu Á, tỷ lệ này còn cao hơn do các yếu tố về khí hậu và phương thức thu hoạch, chế biến, bảo quản kém. Thông thường trong những điều kiện phù hợp Aspergillus sẽ sinh ra Aflatoxin song không đủ lượng để gây ngộ độc nặng, nó làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng , vật nuôi tăng trưởng chậm, còi cọc, làm tăng tiêu tốn thức ăn, khả năng miễn dịch giảm, vật nuôi dể mắc bệnh. Độc tố gây hư hại tế bào gan, thận, gây ung thư làm tăng tỷ lệ chết ở thú non, suy giảm năng suất, sản lượng trứng. Và nếu con người ăn thịt có chứa Aflatoxin thì có thể bị ung thư gan Độc tính trên động vật thí nghiệm : Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp. Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô. Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến. 1.5.Tác hại đối với cơ thể : Bệnh gây ra do độc tố nấm trên người hay gặp ở các đối tượng có đời sống thấp, thức ăn cơ bản là ngũ cốc và các thức ăn thực vật giàu chất béo không được xử lý bảo quản tốt. Mặt khác điều kiện khí hậu nóng ẩm, tình trạng vệ sinh kém cũng là yếu tố thuận lợi cho nấm mốc phát triển sinh độc tố và gây bệnh. Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thư gan ở người (cũng như các động vật nhạy cảm) và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai. Điều cần ghi nhận là tác động bệnh lý của Aflatoxin có tính cộng hưởng với những tác nhân khác như : HBV, hoặc những độc tố di truyền. Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan - thể hiện một nhiễm độc cấp tính. Thường là do Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đó độc tố có độc tính mạnh nhất là B1, sau đó đến G1, rồi đến B2, và sau cùng là G2. Bên cạnh gan, các cơ quan khác như: phổi, thận, mạc treo, túi mật... cũng bị tổn thương ít nhiều. Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn.  Tác động qua lại với ADN và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp AND và ARN.  Ngừng tổng hợp ADN.  Giảm tổng hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin.  Biến đổi hình thái nhân tế bào.  Giảm tổng hợp protein. Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô tế bào gan. Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật và con người. Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 8 - phát. Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin. Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người. Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát. Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng Kwashiorkor, được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may bột lạc này đã bị nhiễm độc tố Aflatoxin. Trẻ đã ăn mỗi ngày 70-100g bột lạc bị nhiễm Aflatoxin với hàm lượng 0,5-1ppm ăn kéo dài trong 10 tháng, đến khi trẻ 4 tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan. Sinh thiết gan thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả 2 trẻ. Bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu là bệnh không do độc tố nấm Anatoxin gây ra, lần đầu tiên xuất hiện ở Xiberi (Liên Xô cũ) và một số vùng khác thuộc Liên Xô. Ở những vùng này thức ăn cơ bản là kê, lúa mì, lúa mạch. Sau này, các công trình nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh là nấm fusarium. Về lâm sàng bệnh thường tiến triển theo 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Kéo dài 3-6 ngày, biểu hiện đầu tiên là viêm niêm mạc miệng, họng... sau đó lan xuống dạ dày, ruột. Sang ngày thứ 3 có đi ngoài nhiều lần, đau bụng, nôn mửa. - Giai đoạn 2: còn gọi là giai đoạn bất sản của hệ bạch huyết và cơ quan tạo máu, kéo dài 15-30 ngày. Xét nghiệm máu: Bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm và thiếu máu rõ rệt. - Giai đoạn 3: Bạch cầu giảm nhiều, bệnh nhân có sốt nhẹ, xuất huyết dưới da, niêm mạc. Sau đó là viêm loét da cùng với những tai biến nhiễm khuẩn khác. Tỉ lệ tử vong cao tới 60-80% . 1.6.Chỉ tiêu cho phép : Ở Pháp quy định mức nhiễm Aflatoxin B1 trong sữa nước dùng cho trẻ em dưới 3 tuổi là ( 0.03ng/kg (ppb)); sữa nước thông dụng  0.05ng/kg. Vào năm 1997, Uỷ ban các chuyên gia về phụ gia thực phẩm của FAO/WHO (JECFA) đã đánh giá là việc giảm mức Aflatoxin trong tiêu chuẩn từ 20 ppb (phần tỷ) xuống 10 ppb sẽ giảm được 2 người chết do ung thư trong một năm trên một tỷ người. Năm 1997, EC đề nghị hài hoà mức Aflatoxin tối đa có thể chấp nhận được trong thực phẩm. Tiêu chuẩn mới này thay đổi trong khoảng từ 4 ppb cho ngũ cốc, các hạt và quả khô ăn ngay, đến 10 ppb cho các hạt cần chế biến tiếp. Đề nghị của EC làm các nhà xuất khẩu lo ngại về việc tiêu chuẩn mới có thể gây hạn chế thương mại. Một số nước xuất khẩu thực sự lo sợ bị tổn thất trong xuất khẩu của họ do tiêu chuẩn mới quá khắt khe. Các nước như Bôlivia, Peru, Ấn Độ, Acgentina, Canada, Urugoay, Úc và Pakistan đã yêu cầu EC đưa ra các đánh giá mối nguy hại cụ thể đối với tiêu chuẩn mới này. Kết quả của việc tham vấn với các đối tác thương mại về các quan ngại này Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 9 - là EC đã nới lỏng tiêu chuẩn dự kiến về Aflatoxin trong ngũ cốc, quả sấy khô và hạt các loại. Tiêu chuẩn về Aflatoxin trong lạc để chế biến tiếp được quy định ở mức 15 ppb (8 ppb cho B1), trong các loại hạt khác và quả khô để chế biến tiếp là 10 ppb (5 ppb cho B1). Đối với ngũ cốc, quả khô và các loại hạt dùng để ăn ngay cho người, tiêu chuẩn nghiêm ngặt hơn và quy định ở mức 4 ppb (2 ppb cho B1). Trong khi đó, các tiêu chuẩn về Aflatoxin của Codex được cho là thấp hơn nhiều so với các tiêu chuẩn của EC. Khi Codex đưa ra tiêu chuẩn riêng cho nhóm B1 của Aflatoxin thì người ta cho rằng Aflatoxin B1 chiếm đến 50-70% hoặc vào khoảng 7,5-10,5 ppb của tổng mức Aflatoxin 15 ppb. Tiêu chuẩn chung của Codex, do vậy, là vào khoảng 9 ppb. Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ qui định hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn gia súc như sau:  Bò giống, heo giống, gà trưởng thành không quá 100ppb (phần tỷ)  Heo thịt giai đoạn vổ béo: 200ppb  Bò thịt: 300ppb  Bò sữa và gia súc non: 20ppb 2.PHÂN TÍCH : Điều kiện tiến hành phân tích : ở phòng mát, tránh ánh nắng. Có nhiều phương pháp phát hiện aflatoxin, các phương pháp lý hoá học chủ yếu dựa trên tính chất phát huỳnh quang của bước sóng tử ngoại của aflatoxin. Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp sắc kí trên giấy với các hệ dung môi butanol-nước-acetic (20:1:19) hay chloroform – methanol (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dung môi chloroform – methanol (99:1 hay 93:7) hoặc chloroform –aceton (90;10 hay 85:15)… cũng có thể định lương alatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cột silicagel với các dung dịch rửa là clorofom và hỗn hợp 5% methanol-cloroform. Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện và định lượng aflatoxin với độ nhay cao là sử dụng HPLC với dung môi tách là acetonitril. Bên cạnh đó, các phương pháp sinh học cũng có khả năng phát hiện aflatoxin. 2.1. Loại trừ Aflatoxin bằng biện pháp phòng chống sinh học (ở đậu phộng). Sử dụng dòng Aspetggillus flavus không gây độc để làm mất tác dụng các dòng sản ra độc tố trong môi trường bằng cách “loại trừ mang tính cạnh tranh”. Cho đến nay các công trình nghiên cứu đã xác định được các đặc trưng của những dòng không gây độc và đã đạt được những thành công nhất định ở Mỹ và Australia. Tuy nhiên còn phải tiếp tục thử nghiệm và đánh giá hiện trường ở Australia, khảo sát việc áp dụng qui mô thương mại, thảo qui trình phổ biến và qui mô ứng dụng. Phải tiến hành chứng minh qui mô độ tin cậy, tính hiệu quả trước và sau thu Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 10 - hoạch, tính an toàn của phương pháp này và tiếp tục nghiên cứu về sự sống sót của dòng đối thủ cạnh tranh trong đất và tính ổn định quá trình không sản sinh ra độc tố. Ưu điểm của biện pháp phòng chống sinh học là làm giảm thiểu nhiểu loạn hệ sinh thái, sự ủng hộ của người tiêu dùng, không dùng công nghệ gen hoặc vi phạm an toàn thực phẩm và có khả năng sẳn sàng chuyển giao công nghệ cho các nước khác. Nhược điểm của phương pháp này là cần những hệ thống thí nghiệm aflatoxin rộng rãi và quản lý sản xuất nông nghiệp và chỉ có thể giảm thiểu aflatoxin chứ không loại trừ hoàn toàn. Các vấn đề nguy cơ thất bại và tính hiệu quả đối với nhiễm sau thu hoạch cũng được đặt ra. 2.2.Nguyên lý phương pháp sử dụng dụng cụ: Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết af