Đồ án Nghiên cứu tuyển chọn một sốchủng vi khuẩn Bacilluscó hoạt tính enzyme proteaza kiềm

i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS – TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS. Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Hà Nội, tháng 6 – 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Như ii MỤC LỤC Trang Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3 1.1. Đại cương về Bacillus ...............................................................................4 1.2. Protease...................................................................................................10 1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease ......................................................10 1.2.2. Ứng dụng của protease ....................................................................12 1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam ...........................................................................................................15 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................16 2.1 Đối tượng – Vật liệu.................................................................................17 2.1.1. Đối tượng .........................................................................................17 2.1.2. Vật liệu.............................................................................................17 2.1.2.1.Thiết bị ...........................................................................................17 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................18 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l):........................................................................................................18 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease................................18 2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường ..........................................................19 2.2. Các phương pháp nghiên cứu ..................................................................19 2.2.1. Phương pháp phân lập ......................................................................19 2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển ..................................................19 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn .....20 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc .................................20 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống .......................................20 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram.........................................................21 2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử ...............................22 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase..........................................22 iii 2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620nm ) ...............................................................................................22 2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein..............................23 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, BM.............................................................................................................24 2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM .............................................................25 Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................26 3.1. Phân lập chủng Bacillus ..........................................................................27 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc...............................................................27 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào ....................................................................28 3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase .............................................................30 3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba chủng Bs, Bm và BM.....................................................................................31 3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên môi trường không có chất cảm ứng ............................................................33 3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ........................................................................................................34 3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan...................................34 3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ..............................35 3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein...............37 3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ..............................................37 iv 3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .........................39 3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .................................................41 3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu amylaza ......................................................................................................41 3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza......................................................................................................44 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan.................................................47 3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu...................................................................................50 3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế ..51 3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men..............54 Phần IV KẾT LUẬN .......................................................................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................58 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs .........................................................................27 Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm........................................................................28 Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM.......................................................................28 Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs..............................................................................29 Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM .....................................................................29 Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm......................................................................30 Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM ....32 Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..................................................................................................................36 Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..................................................................................................................36 Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..............................................................................................................37 Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là cazein..........................................................................................................................39 Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là cazein......................................................................................................................40 Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein......................................................................................................................40 Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bs.....................................................................................................................42 Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bm ...................................................................................................................42 Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng BM...................................................................................................................43 Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bs.....................................................................................................................44 vi Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bm ...................................................................................................................45 Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng BM...................................................................................................................45 Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3.......................................................49 Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3.......................................................50 Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm và BM.........................................................................................................................51 Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong môi trường bột đậu tương có CaCO3 ..........................................................................55 vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra:...............31 Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có chất cảm ứng .....................................................................................................33 Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan.............34 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan ...........34 Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan...........35 Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein.....................38 Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein ...................38 Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein...................38 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi ..........................43 trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM ..................................................43 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM ...............................................................................46 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM ............................................................................................................48 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .....................................................48 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM .................................................................................52 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza trên môi trường có bột đậu tương ......................................................................53 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn. Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật... Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học kỹ thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình. Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản... là nhờ khả năng sinh enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng. 2 Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau: 1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọn các chủng Bacillus. 2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính cao. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 3 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đại cương về Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [ 10 ] Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 450C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C [11]. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 5 Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [13] . Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [13]. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 m. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [13]. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa khoảng 600C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên 6 có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm [1]. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [14]. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [12]. Đặc biệt, B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [15]. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 – 1,5)m có thể đến 2 m, dài từ 3 – 12 m, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi