Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ở phụ nữ tiền mãn kinh

Chöông 3 ÑOÁI TÖÔÏNG – PHÖÔNG PHAÙP Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 49 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn 3.1. Ñoái töôïng nghieân cöùu Goàm 446 phuï nöõ tieàn maõn kinh vaø maõn kinh ñang soáng taïi TP-HCM vaø moät soá tænh khaùc, ñeán khaùm taïi phoøng khaùm Maõn kinh BV Töø Duõ. Tieâu chuaån choïn ñoái töôïng nghieân cöùu TaÁt caû phuï nöõ coù roái loaïn tieàn maõn kinh vaø maõn kinh töø 40 tuoåi trôû leân (khoâng naèm trong tieâu chuaån loaïi tröø). Töï nguyeän tham gia nghieân cöùu. Tieâu chuaån loaïi tröø Loaïi tröø nhöõng phuï nöõ: - Coøn trong tuoåi sinh saûn, chöa coù daáu hieäu tieàn maõn kinh. - Ñaõ caét töû cung vaø/hoaëc 2 phaàn phuï. - ÔÛ trong nhöõng tình traïng coù theå laøm thay ñoåi lipid vaø lipoprotein: + Ñang duøng thuoác: Thuoác ñieàu trò roái loaïn lipid vaø lipoprotein, lôïi tieåu Thiazid, Thuoác cheïn beta, caùc thuoác coù chöùa noäi tieát toá höôùng sinh duïc nhö androgen, estrogen… + Trong tình traïng vieâm nhieãm caáp tính, chaán thöông, phaãu thuaät. + Ñang maéc caùc beänh: Nhöôïc giaùp, HC thaän hö, beänh gan do taét maät. 3.2. Phöông phaùp nghieân cöùu Loaïi hình nghieân cöùu Tieàn cöùu – Moâ taû caét ngang. Côõ maãu Côõ maãu döôïc tính theo coâng thöùc: maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 50 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Do khoâng tìm ñöôïc nghieân cöùu naøo veà roái loaïn CHLP ôû phuï nöõ TMK vaø MK tröôùc ñaây, neân khoâng bieát tyû leä p veà roái loaïn CHLP ôû ñoái töôïng naøy laø bao nhieâu. Chuùng toâi choïn p = 0.5 vì luùc naày côõ maãu seõ lôùn nhaát (theo coâng thöùc treân vôùi p = 0.5 seõ lôùn nhaát ). Vôùi z =1.96 thì ñoä tin caäy laø 95%. d =0.05 p =0.5 Ta coù: n =384 Trong nghieân cöùu naøy n = 446, nhö vaäy côõ maãu ñuû lôùn ñeå caùc pheùp tính coù ñoä chính xaùc cao. Caùch choïn maãu Phöông phaùp laáy maãu lieân tieáp trong voøng 06 thaùng, ñöôïc söû duïng ñeå choïn caùc phuï nöõ tham gia nghieân cöùu. Phöông phaùp tieán haønh Soá lieäu ñöôïc thu thaäp döïa vaøo khaùm laâm saøng, baûng caâu hoûi vaø xeùt nghieäm sinh hoaù. • Baûng caâu hoûi Baûng caâu hoûi ñöôïc soaïn saün (baûng caâu hoûi naøy ñaõ ñöôïc tham khaûo yù kieán cuûa caùc chuyeân gia veà tim maïch vaø saûn phuï khoa veà noäi dung vaø hình thöùc), qua ñoù thu thaäp ñöôïc caùc döõ lieäu sau: - Ñaëc ñieåm ngöôøi ñöôïc hoûi. - Tieàn caên veà saûn phuï khoa. - Caùc yeáu toá nguy cô veà ñoäng maïch vaønh. maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 51 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn - Caùc tieâu chuaån loaïi tröø. • Khaùm laâm saøng Thu thaäp caùc soá lieäu: Caân naëng, chieàu cao, huyeát aùp. Phaùt hieän caùc beänh lyù naèm trong tieâu chuaån loaïi tröø. • XN Sinh hoùa - XN Cholesterol toaøn phaàn, Triglycerid, HDL-C vaø LDL-C hieän nay laø caùc xeùt nghieäm chính ñöôïc söû duïng thöôøng quy trong taàm soaùt roái loaïn lipid vaø lipoprotein maùu ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. - Kieåm tra ñöôøng huyeát khi ñoùi. Caùc xeùt nghieäm treân ñöôïc thöïc hieän taïi phoøng xeùt nghieäm BV Töø Duõ vôùi caùc ñieàu kieän sau: - Ñoái töôïng nghieân cöùu phaûi nhòn ñoùi ít nhaát 12 giôø. - Maùu ñöôïc laáy vaø ñònh löôïng trong voøng buoåi saùng. Ñònh löôïng caùc chæ soá lipid maùu: ( Taøi lieäu höôùng daãn söï duïng thuoác thöû cuûa haõng DiaSys-Ñöùc) -Cholesterol total (CT): Phương pháp Thử nghiệm cholesterol bằng kỹ thuật enzym, sử dụng cholesterol esterase và cholesterol oxidase và đo mật độ quang ở bước sóng khả kiến. Nguyên tắc Mẫu + Thuốc thử R1 (thuốc thử cholesterol) Cholesterol esterase thủy phân hoàn toàn các cholesterol ester trong huyết thanh và phóng thích ra cholesterol tự do và các acid béo. cholestrol esterase Cholesterol Ester ----------------------> Cholesterol + RCOOH maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 52 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Dưới sự hiện diện của oxygene và bị xúc tác bởi enzym cholesterol oxidase, cholesterol tự do phóng thích ra hydrogene peroxide. cholesterol oxidase Cholesterol + O2 ------------------------> H2O2 + Cholesterone Hydrogene peroxide sẽ tạo ra một phức hợp quinone màu đỏ. Nồng độ màu của chất này khi đo mật độ quang ở bước sóng 500nm tỷ lệ với nồng độ cholesterol trong mẫu thử. peroxidase 2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol --------------> 4H2O + 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone -Triglycerides (TG): Phương pháp Phương pháp thừ nghiệm triglycerides bằng glycerol phosphate oxydase (GPO) dựa trên sự xác định bằng enzyme của glycerol với GPO sau khi thủy phân bằng lipoprotein lipase phát hiện được triglycerides toàn phần, bao gồm mono và diglycerides, và các thành phần glycerol tự do Nguyên tắc Mẫu + Thuốc thử R1 (đệm/4-chlorophenol/enzym) Phản ứng: Triglycerides trong huyết thanh được phân giải thành glycerol và các acid béo tự do bởi enzym lipoprotein lipase (LPL). LPL Triglycerides + 3 H2O -----------> diglycerol + RCOOH Glycerol sau đó chuyển hóa thành glycerol-3-phosphate bởi enzym glycerol kinase (GK) dưới sự hiện diện của ATP và Mg2+. GK, Mg2+ Glycerol + ATP --------------> glycerol- 3- phosphate + ADP maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 53 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Glycerol-3-phosphate phản ứng với oxygen với sự hiện diện của glycerol-3-phosphate oxidase (GPO) để tạo nên hydrogen peroxide. GPO Glycerol-3-phosphate + O2 -------------------->dihydroxyacetone phosphate + H2O2 Hydrogen peroxidase sẽ tạo nên phúc hợp màu với 4-aminophenazone và 4- chlorophenol dưới sự xúc tác của enzym peroxidase (POD). POD H2O2 + 4-aminophenazone + 4-chlorophenol -----------> dihydroxyacetone + H2O2 Nồng độ màu của phức hợp tỉ lệ trực tiếp với nồng độ triglycerides trong mẫu thử và được đo bằng phương pháp điểm cuối của bước sóng 500 nm. -HDL Cholesterol (HDL-C): Phương pháp Các lipoprotein thường được định lượng bằng một trong các phương pháp sau: điện di, siêu ly tâm, và định lượng bằng kỹ thuật đo cholesterol sau khi tách HDL-cholesterol (High Density Lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng cao) ra khỏi LDL-cholesterol (Low Density Lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng thấp) và VLDL-cholesterol (Very Low Density Lipoprotein – lipoprotein tỉ trọng rất thấp). Các phương pháp khác nhau sử dụng các loại hóa chất gây tủa khác nhau. LDL được gây tủa bằng polyethylene glycol (PEG) và dextran sulfate. Hai enzym cholesterol esterase và cholesterol oxidase dưới sự hiện diện của PEG sẽ xúc tác phản ứng chọn lọc theo hướng tăng dần độ phản ứng của các lipoprotein: LDL < VLDL < HDL. Nguyên tắc Mẫu + Thuốc thử R1 (đệm) Dưới sự có mặt của ion magnesium, dextran sulfate sẽ chỉ tạo phức hợp tan với LDL, VLDL và chịu sự kìm hãm của PEG. maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 54 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Thêm thuốc thử R2 (PEG/4-amino-antipyrine/đệm). Phản ứng xảy ra: Cholesterol esters phản ứng tạo thành tạo thành cholesterol tự do và acid béo dưới sự xúc tác của enzym cholesterol esterase. PEG-cholesterol esterase HDL-cholesterol esters + H2O ---------------------> HDL-cholesterol + RCOOH Với sự có mặt của oxygen, cholesterol bị oxy hóa thành Δ4-cholestenone và hydrogene peroxide bởi enzym cholesterol oxidase. PEG-cholesterol oxidase HDL-cholesterol + O2 ----------------------------> Δ4-cholestenone + H2O2 Hydrogen peroxide phản ứng với 4-amino-antipyrine và sodium N-(2 hydroxy-3- sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (HSDA) tạo thành phức hợp màu tím xanh dưới sự xúc tác của enzym peroxidase. peroxidase 2 H2O2 + 4-amino-antipyrine + HSDA + H+ + H2O ----------> chất màu tím xanh + 5 H2O Nồng độ màu của phức hợp tỉ lệ trực tiếp với nồng độ HDL-cholesterol trong mẫu thử và được đo bằng phương pháp điểm cuối của bước sóng 500 nm. -LDL Cholesterol (LDL-C): Thoâng thöôøng, ngöôøi ta chỉ XN CT, TG vaø HDL-C, töø ñoù tính ra LDL-C theo coâng thöùc cuûa Friedwald : LDL-C (mmol/l) = CT - HDL-C - TG/ 2,2. Hoaëc LDL-C (mg/dl) = CT - HDL-C - TG/ 5. TG/ 5 = Cholesterol cuûa VLDL. Coâng thöùc naày chæ aùp duïng ñöôïc neáu TG < 4,5mmol/ 1 hoaëc < 400mg/dl. maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 55 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Taát caû XN treân ñöôïc thöïc hieän baèng maùy sinh hoaù töï ñoäng Hitachi 911, theá heä 1999-2003, thuoác thöû cuûa Haõng DiaSys (Ñöùc). Maùy ñöôïc ñònh chuaån haøng ngaøy baèng Serum control cuûa Coâng ty Bio-Rad (Myõ) ôû 2 möùc bình thöôøng vaø beänh lyù. Ñònh löôïng Elecsys β-CrossLaps: Vieäc ñònh löôïng Elecsys β-CrossLaps ñöôïc thöïc hiện treân maùy Mieãn dòch töï ñoäng Elecsys 2010 cuûa Haõng Roche Diagnostic (Ñöùc) baèng phöông phaùp Ñieän hoùa Mieãn dòch. Hình 3: Thöû nghieäm cô baûn cuûa β-CrossLaps/serum test Nguyeân taéc:”sandwich” (“keïp chaû”). Thôøi gian ño: 18 phuùt [35] -UÛ laàn 1: 50 μl huyeát thanh ñöôïc uû chung vôùi khaùng theå ñôn doøng khaùng β- CrossLaps biotinyl hoùa, khaùng nguyeân coù trong maãu thöû ñöôïc taùch khoûi caùc thaønh phaàn khaùc cuûa huyeát thanh. -UÛ laàn 2: Sau khi caùc vi haït coù phuû streptavidin vaø moät loaïi khaùng theå ñôn doøng ñaëc hieäu vôùi β-CrossLaps ñöôïc ñaùnh daáu vôùi 1 phöùc hôïp ruthenium ñöôïc cho maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 56 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn vaøo, moât phöùc hôïp “keïp chaû” ñöôïc taïo thaønh, phöùc hôïp naøy ôû daïng raén do bôûi phaûn öùng cuûa biotin vaø streptavidin. -Hoãn hôïp phaûn öùng ñöôïc cho vaøo coùng ño, nôi caùc vi haït ñöôïc töø tính hoùa gaén leân beà maët cuûa ñieän cöïc. Caùc chaát khoâng gaén keát ñöôïc loaïi boû vôùi dung dòch ProCell. Söï gia taêng hieäu ñieän theá cuûa ñieän cöïc seõ laøm gia taêng caùc tín hieäu hoùa phaùt quang, tín hieäu naøy ñöôïc ño bôûi 1 ñaàu ñoïc ña keânh. -Keát quaû ñöôïc tính toaùn döïa vaøo 1 ñöôøng cong chuaån döïng bôûi 2 ñieåm, hình daïng ñöôøng cong chuaån ñöôïc cung caáp bôûi barcode thuoác thöû. Caùc döõ lieäu thu thaäp : Ñaëc ñieåm cuûa ñoái töôïng nghieân cöùu: Hoï vaø teân – Tuoåi – Ñòa chæ – Ngheà nghieäp Döïa theo tuoåi, chia ñoái töôïng nghieân cöùu thaønh 4 nhoùm, ñeå so saùnh keát quaû lipid maùu cuûa ñoái töôïng nghieân cöuù vôùi nghieân cöùu cuûa Phaïm Thò Mai vaø nghieân cöùu cuûa PROCAM, ñoàng thôøi khaûo saùt söï roái loaïn lipid maùu theo söï tích tuoåi: N1: 40—49 tuoåi; N2: 50—59 tuoåi; N3: 60—69 tuoåi; N4: ≥ 70tuoåi. Tuoåi maõn kinh (tính ra thôøi gian maõn kinh). Caùc yeáu toá nguy cô beänh ñoäng maïch vaønh: - Chæ soá khoái cô theå (BMI: Body Mass Index). BMI= Caân naëng (kg) chia cho chieàu cao (m) bình phöông - Huyeát aùp. Taêng HA khi HA ≥ 140/90 mmHg hay ñang uoáng thuoác choáng taêng HA. - Ñöôøng huyeát khi ñoùi: maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 57 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Ñaùi thaùo ñöôøng khi khi ñöôøng huyeát khi ñoùi ≥126mg% hoaëc BN ñang ñieàu trò ÑTÑ [12]. - Caùc thoâng soá lipid vaø lipoprotein: CT, TG, LDL-C vaø HDL-C. -Chæ soá daáu aán tieâu xöông β-CrossLaps. Xöû lyù soá lieäu: Töø caùc döõ lieäu thu thaäp ñöôïc, phaân tích ñaëc ñieåm cuûa ñoái töôïng nghieân cöùu. Töø caùc thoâng soá lipid vaø lipoprotein thu thaäp ñöôïc: - Tính ra trò soá trung bình vaø ñoä leäch chuaån cuûa CT, TG, HDL-C vaø LDL-C cho töøng nhoùm theo tuoåi. - Tính chæ soá xô vöõa: CA= (CT—HDL)/HDL. - Tyû soá CT/HDL-C So saùnh vôùi trò soá lipid vaø lipoprotein cuûa nghieân cöùu trong vaø ngoaøi nöôùc: Choïn nghieân cöùu coù ñoái töôïng nghieân cöùu laø nöõ coù cuøng ñoä tuoåi. Trong nöôùc, so saùnh vôùi trò soá lipid cuûa phuï nöõ coù cuøng ñoä tuoåi trong nghieân cöùu veà söï thay ñoåi noàng ñoä lipid vaø lipoprotein huyeát thanh theo tuoåi vaø giôùi cuûa Phaïm Thò Mai (n = 2640) (1990) [18]. Töø ñoù ruùt ra ñöôïc: - Tyû leä roái loaïn cuûa töøng loaiï xeùt nghieäm - Söï lieân quan giöõa taàn suaát roái loaïn lipid vôùi thôøi gian MK. Nöôùc ngoaøi , so saùnh vôùi trị soá lipid cuûa ngöôøi phuï nöõ coù cuøng ñoä tuoåi ôû nghieân cöùu PROCAM (Propecctive Cardiovascular Munster Study) treân 3948 ngöôøi . Qua ñoù xem coù söï khaùc nhau naøo khoâng trong RLCH lipid giöõa phuï nöõ Vieät Nam vaø phuï nöõ Phöông Taây coù cuøng ñoä tuoåi. maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 58 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn Baûng 3.1: Caùc trò soá trung bình cuûa lipid ôû phuï nöõ bình thöôøng theo nghieân cöùu cuûa Phaïm Thò Mai Nhoùm tuoåi Cholesterol TP Tryglycerid HDL-C LDL-C 40-49 188 ± 32,7 79 ± 35,1 51 ±12,8 119 ± 1,2 50-59 192 ± 36,0 83 ±38,0 50 ± 12,8 122 ± 31,4 60-69 189 ±- 32,4 70 ± 27,5 50 ± 87,0 124 ±29,2 ≥70 175 ± 11,1 58 ±15,2 40 ± 11,0 97 ± 14,0 Baûng 3.2. Caùc trò soá trung bình cuûa lipid ôû phuï nöõ thay ñoåi theo tuoåi trong nghieân cöùu PROCAM Nhoùm tuoåi Cholesterol TP Tryglycerid HDL-C LDL-C 40-49 206,0±37,5 94,2±56,5 57,4 ± 14,6 129,8 ± 34,7 50-59 229,5 ± 42,5 105,3 ± 61,5 58,0±14,9 150,0± 39,4 60-69 248,5 ±41,2 120,0 ±83,3 58,4 ±15,0 166,8 ± 38,8 Nghieân cöùu PROCAM khoâng coù nhoùm tuoåi ≥70. Xaùc ñònh kieåu roái loaïn lipid • Theo kieåu De Gennes: • Theo Fredrickson (theo Baûng 2.3.) Rieâng veà HDL-C, döïa vaøo tieâu chuaån HDL-C thaáp ôû phuï nöõ Vieät Nam: HDL- C < 50mg/dl cuûa Phaïm Thò Mai [17]. Töø caùc thoâng soá Elecsys β-CrossLaps thu thaäp ñöôïc: Tính ra trò soá trung bình vaø ñoä leäch chuaån cuûa Elecsys β-CrossLaps cho töøng nhoùm theo tuoåi. maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 59 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn - Vì chöa coù soá lieäu nghieân cöùu veà Elecsys β-CrossLaps ôû Vieät Nam neân chuùng toâi tieán haønh so saùnh vôùi trò soá Elecsys β-CrossLaps cuûa nghieân cöùu ôû nöôùc ngoaøi [35]: Choïn ñoái töôïng nghieân cöùu laø nöõ coù cuøng ñoä tuoåi. n Mean SD Mean + 2SD -Tìm moái lieân quan giöõa tæ soá khoái cô theå (BMI) vaø daáu aán tieâu xöông Elecsys β-CrossLaps. -Tìm moái lieân quan giöõa soá naêm maõn kinh vaø daáu aán tieâu xöông Elecsys β- CrossLaps. -Tìm moái lieân quan giöõa maät ñoä xöông (BMD) vaø daáu aán tieâu xöông Elecsys β-CrossLaps. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu Soá lieäu ñöôïc nhaäp vaøo maùy tính vaø phaân tích thoáng keâ vôùi phaàn meàm SPSS version 17.0. Caùc bieán soá ñònh löôïng ñöôïc trình baøy vôùi soá trung bình vaø ñoä leäch chuaån neáu coù phaân phoái chuaån vaø ñöôïc trình baøy baèng trung vò vaø khoaûng töù phaân vò neáu phaân phoái bò leäch. Bieán soá ñònh tính ñöôïc trình baøy vôùi taàn soá tuyeät ñoái vaø tæ leä phaàn traêm. Ñeå so saùnh phaân phoái bieán ñònh tính giöõa caùc nhoùm, kieåm ñònh chi bình phöông ñöôïc söû duïng. Kieåm ñònh student t ñöôïc duøng ñeå so saùnh bieán soá ñònh löôïng Men ng/ml pg/ml ng/ml pg/ml ng/ml pg/ml 30-50 years 165 0.300 300 0.142 142 0.584 584 > 50-70 years 109 0.304 304 0.282 282 0.704 704 < 70 years 365 0.394 394 0.230 230 0.854 854 Women premenopausal 254 0.299 299 0.137 137 0.573 573 postmenopausal 429 0.556 556 0.226 226 1.008 1008 maõn kinh vaø maõn kinh Chöông 3 - Ñoái töôïng - phöông phaùp 60 Khaûo saùt roái loaïn chuyeån hoùa lipid, lipoprotein vaø daáu aán tieâu xöông ôû phuï nöõ tieàn giöõa 2 nhoùm vaø kieåm ñònh ANOVA ñöôïc duøng ñeå so saùnh bieán ñònh löôïng cuûa nhieàu hôn 2 nhoùm. Kieåm ñònh moái lieân quan giöõa 2 bieán ñònh löôïng söû duïng heä soá töông quan R cuûa Pearson. Kieåm ñònh ñöôïc xem laø coù yù nghóa thoáng keâ neáu giaù trò p < 0.05. maõn kinh vaø maõn kinh