Hoạt hóa và di chuyển của tế bào gốc tủy răng người: Vai trò trong lành tổn thương tủy răng

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh có sự hiện diện của tế bào gốc/chưa biệt hóa trong tủy răng. Tuy nhiên còn ít nghiên cứu về vị trí của những tế bào này trong tủy răng cũng như sự hoạt hóa và di chuyển của chúng để đáp ứng với tổn thương tủy. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm chứng tỏ sự hoạt hóa và di chuyển của dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử dụng mô hình nuôi cấy răng người. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đánh giá vai trò của nguyên bào sợi tủy răng khi bị tổn thương trong tân tạo mạch máu, một quá trình diễn ra sớm trong lành thương của tủy răng và có thể cần thiết cho sự di chuyển của tế bào chưa biệt hóa. Kết quả: Qua mô hình nuôi cấy răng in vitro, nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy tổn thương tủy răng đã kích thích sự tăng sinh và di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa ở vùng xung quanh mạch máu đến vùng tổn thương tủy. Khi bị tổn thương, nguyên bào sợi tủy răng tiết ra các yếu tố tăng trưởng mạch máu giúp tủy lành thương hoàn toàn. Kết luận: Tân tạo mạch máu có thể cần thiết cho các tế bào gốc/chưa biệt hóa di chuyển đến vùng có sang thương.

pdf6 trang | Chia sẻ: thuyduongbt11 | Ngày: 11/06/2022 | Lượt xem: 263 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Hoạt hóa và di chuyển của tế bào gốc tủy răng người: Vai trò trong lành tổn thương tủy răng, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 63 HOẠT HÓA VÀ DI CHUYỂN CỦA TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI: VAI TRÒ TRONG LÀNH TỔN THƯƠNG TỦY RĂNG Trần Hùng Lâm*, Odile Téclès**, Mathieu Sylvie**, About Imad** TÓM TẮT Nhiều nghiên cứu đã chứng minh có sự hiện diện của tế bào gốc/chưa biệt hóa trong tủy răng. Tuy nhiên còn ít nghiên cứu về vị trí của những tế bào này trong tủy răng cũng như sự hoạt hóa và di chuyển của chúng để đáp ứng với tổn thương tủy. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm chứng tỏ sự hoạt hóa và di chuyển của dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử dụng mô hình nuôi cấy răng người. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đánh giá vai trò của nguyên bào sợi tủy răng khi bị tổn thương trong tân tạo mạch máu, một quá trình diễn ra sớm trong lành thương của tủy răng và có thể cần thiết cho sự di chuyển của tế bào chưa biệt hóa. Kết quả: Qua mô hình nuôi cấy răng in vitro, nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy tổn thương tủy răng đã kích thích sự tăng sinh và di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa ở vùng xung quanh mạch máu đến vùng tổn thương tủy. Khi bị tổn thương, nguyên bào sợi tủy răng tiết ra các yếu tố tăng trưởng mạch máu giúp tủy lành thương hoàn toàn. Kết luận: Tân tạo mạch máu có thể cần thiết cho các tế bào gốc/chưa biệt hóa di chuyển đến vùng có sang thương. Từ khóa: tế bào gốc/chưa biệt hóa, tủy răng, tổn thuơng tủy, tân tạo mạch máu. ABSTRACT ACTIVATION AND MIGRATION OF HUMAN DENTAL PULP STEM CELLS: ROLE IN DENTAL PULP HEALING Tran Hung Lam, Odile Téclès, Mathieu Sylvie, About Imad * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 63 - 68 Several lines of evidence strongly suggest the presence of resting progenitor/stem cells in the dental pulp. However, little is known about activation and migration of these cells in response to pulp injury. The objective of this work was to investigate the activation and migration of these progenitor/stem cells in response to pulp injury in their tissue of origin. Besides, we also evaluated the role of pulp fibroblasts in angiogenesis, an early step of pulp healing and may be necessary for migration of progenitor cells. Results: Using a tooth culture model, our study demonstrated that pulp injury stimulated the proliferation and migration of perivascular progenitor/stem cells to injury site. After pulp amputation, pulp fibroblasts secreted angiogenic factors helping a complete pulp healing. Conclusion: Angiogenesis may be necessary for migration of progenitor/stem cells. Key words: progenitor/stem cells, dental pulp, pulp injury, angiogenesis. MỞ ĐẦU Trong nha khoa phục hồi, khi có những tổn thương do bệnh lý hay điều trị, ngà phản ứng hoặc ngà sửa chữa có thể được thành lập tùy *: Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh **: Laboratoire IMEB, Khoa Nha, Đại học Méditerranée, Cộng hòa Pháp Tác giả liên lạc: TS. Trần Hùng Lâm ĐT. 0907773375, Email: drtranhunglam@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 64 thuộc vào thể tích của tủy răng (Smith và cs, 1995; Tziafas và cs, 2000)(4,7). Sự hình thành này giúp giới hạn những thương tổn gây ra bên trong răng. Những nguyên bào ngà có thể sống sót khi sang thương sâu răng nhẹ, chúng sẽ tiết ra lớp ngà phản ứng. Trái lại, khi sang thương lớn và lớp nguyên bào ngà bị phá hủy, chúng sẽ được thay thế bởi một dòng tế bào mới nguồn gốc tủy răng: nguyên bào ngà thế hệ thứ 2 chế tiết ra lớp ngà sửa chữa. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nguyên bào ngà thế hệ thứ 2 được biệt hóa từ dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa hiện diện trong tủy răng (About và cs, 2000; Gronthos và cs, 2000)(1,2). Tuy nhiên còn ít nghiên cứu về vị trí của những tế bào gốc này trong tủy răng cũng như sự hoạt hóa và di chuyển của chúng để đáp ứng với tổn thương tủy(3). Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm chứng tỏ sự hoạt hóa và di chuyển của dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử dụng mô hình nuôi cấy răng người. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đánh giá vai trò của nguyên bào sợi tủy răng khi bị tổn thương trong tân tạo mạch máu, một quá trình diễn ra sớm trong lành thương của tủy răng và có thể cần thiết cho sự di chuyển của tế bào chưa biệt hóa. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thực hiện tại la bô IMEB, Khoa Nha, Đại học Méditerranée, Cộng hòa Pháp từ tháng 09-2004 đến 09-2006. Răng cối thu nhận từ bệnh nhân có điều trị chỉnh nha (có sự đồng ý của bệnh nhân hay cha mẹ nếu bệnh nhân dưới 18 tuổi và phù hợp với luật pháp của Cộng hòa Pháp) được sử dụng để nghiên cứu sự hoạt hóa và di chuyển của tế bào gốc chưa biệt hóa sau khi tạo sang thương vào tủy răng. Răng nhổ được đem trực tiếp đến la bô nghiên cứu trong môi trường MEM (minimum essential medium) có thêm 300UI/ml penicillin, 300 g/ml streptomycin, 0.75 g/ml amphotericin B. Răng được rửa sạch với dụng cụ vô trùng sau khi đã loại bỏ dây chằng nha chu và bao mầm răng. Sang thương tủy răng được sửa soạn với mũi khoan kim cương (đường kính 016) và tay khoan siêu tốc (300 000 vòng/phút) dưới nước bơm rửa vô trùng lạnh. Răng không có tạo xoang và tạo xoang vào ngà (không có tổn thương tủy) được sử dụng làm nhóm chứng cho nghiên cứu tăng sinh tế bào. Răng được nuôi cấy trong hộp nuôi cấy 4 lỗ (Nonclon, Nunc, Roskilde, Đan Mạch). Phần thân răng cố định trên một sợi kẽm, phần chóp ngập trong dung dịch nuôi cấy nhưng không chạm đáy hộp nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy là MEM có thêm 10% huyết thanh phôi bò, 200UI/ml penicillin, 200 g/ml streptomycin, 0.5 g/ml amphotericin B. Để khảo sát sự tăng sinh tế bào, răng được nuôi trong môi trường MEM có chứa BrdU (1mg/ml) trong 1 ngày. Sau đó, để kiểm tra sự di chuyển tế bào, răng được nuôi cấy trong môi trường có BrdU trong 1 ngày, sau đó, tiếp tục nuôi trong cùng môi trường nhưng không có BrdU trong 1 ngày, 2 tuần và 4 tuần. Khảo sát mô học và hóa mô miễn dịch Sau giai đoạn nuôi cấy, răng được cố định trong dung dịch formol 4% và khử khoáng trong dung dịch gồm sodium formiate 3,4% và acid formic 17% đến khi khử khoáng hoàn toàn cho xử lý mô học. Các răng được xử lý qua cồn và xylene và cuối cùng được nhúng trong sáp paraffin. Hóa mô miễn dịch thực hiện trên các lớp cắt bề dày 7m với kháng thể đơn dòng anti-BrdU. Nhuộm máu với kit streptavidine-biotin (LSAB, Dako Corp, CA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mẫu chứng không có kháng thể nguyên phát đều âm tính. Phương pháp đánh giá vai trò của nguyên bào sợi trong tân tạo mạch máu Nguyên bào sợi tủy răng được lấy từ các răng cối lớn thứ ba như đã mô tả trước đây (About và cs., 2000)(1). Sau khi nhổ, răng được rửa sạch và loại bỏ phần chóp. Tủy răng được cắt thành những mảnh nhỏ và nuôi trong đĩa nuôi cấy có đường kính 100mm (Becton Dickison Labware, NJ, USA). Khi hộp đầy tế bào, thực hiện chọn lọc tế bào với men Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 65 Trypsine/EDTA. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường có trộn thêm huyết thanh phôi bò nồng độ 10%, 2mM glutamine, 100UI/ml penicillin/streptomycine và 0,25 μg/ml amphotericin B. Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người nuôi trong môi trường chuyên biệt cung cấp bởi nhà sản xuất. Tủ nuôi cấy tế bào có nồng độ CO2 là 5%. Môi trường nuôi cấy được thay hằng ngày. Nguyên bào sợi được nuôi trong môi trường EGM. Các tổn thương nguyên bào sợi được thực hiện trực tiếp với dao mổ vô trùng trên đĩa nuôi cấy. Sau 5 giờ tiếp xúc với nguyên bào sợi bị tổn thương, môi trường này được sử dụng để nuôi tế bào nội mô trên khung ngoại bào Matrigel. Môi trường nuôi cấy không có tiếp xúc với nguyên bào sợi được sử dụng làm nhóm chứng. Sau 24 giờ, sự thành lập cấu trúc dạng ống của tế bào nội mô được đánh giá định lượng bằng cách đo chu vi của cấu trúc dạng ống thành lập trên các ảnh chụp từ kính hiển vi. Mỗi nhóm chọn 30 quang trường một cách ngẫu nhiên để thực hiện đo đạc. Chu vi cấu trúc dạng ống được phân tích với phần mềm Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, USA). Thí nghiệm trung hòa các yếu tố tăng trưởng mạch máu Hai kháng thể trung hòa có nồng độ 20μg/ml (R&D Systems, Lille, France) được sử dụng là anti-VEGF và anti-FGF-2. Kháng thể trung hòa được thêm vào trong môi trường nuôi cấy có tiếp xúc với nguyên bào sợi tổn thương. Môi trường này sau đó được sử dụng để nuôi tế bào nội mô và đánh giá chu vi cấu trúc dạng ống của tế bào nội mô như mô tả trên đây. Phân tích thống kê Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần. Test phi tuyến tính Mann-Whitney được sử dụng để kiểm định các giả thuyết, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0,05. KẾT QUẢ Sự tăng sinh tế bào gốc/chưa biệt hóa Sau khi tạo sang thương vào tủy và nuôi cấy với BrdU trong một ngày, nhuộm màu tập trung ở nhân tế bào vùng quanh mao mạch. Hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể anti-BrdU biểu hiện một thang độ: nhuộm màu BrdU rất đậm ở mạch máu bao quanh tổn thương và giảm khi xa khỏi tổn thương (hình 1). Hình 1: Tế bào gốc tăng sinh biểu hiện một thang độ sau khi tạo sang thương vào tủy răng. Sau một ngày nuôi cấy với BrdU, nhuộm màu tập trung ở nhân tế bào vùng quanh mao mạch. Nhuộm màu đậm ở mao mạch quanh sang thương (B và C) và giảm khi xa sang thương (B và D). Chú thích: c: xoang sang thương; d: ngà; p: tủy, mũi tên chỉ mạch máu. Thanh thước đo ở hình A: 1mm; hình B: 100 m; hình C và D: 50m. Sự di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa Sau khi nuôi cấy hai tuần, nhuộm màu tế bào tách biệt khỏi mạch máu và ở gần vùng tổn thương. Tại thời điểm 4 tuần, nhuộm màu miễn dịch chỉ còn được thấy ở vùng tổn thương (hình 2). Mẫu răng chứng Răng không có tạo tổn thương hay chỉ có xoang vào ngà không có bất kì sự bắt màu nào quanh mao mạch (hình 3). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 66 Hình 2: Sự di chuyển tế bào sau khi tạo sang thương. Răng được nuôi cấy trong môi trường có BrdU trong một ngày sau đó răng tiếp tục nuôi cấy không có BrdU trong vòng 2 và 4 tuần. Sau 2 tuần, nhuộm màu tế bào được thấy ở bên ngoài mạch máu gần tổn thương (A và B). Sau 4 tuần, nhuộm màu miễn dịch chỉ còn được thấy ở vùng sang thương tủy. Thanh thước đo ở hình A và C: 1mm; hình B và D: 100m. Hình 3: Nhóm răng chứng sau khi tạo xoang vào ngà. Răng nuôi cấy với BrdU trong 1 ngày để kiểm tra tính đặc hiệu của kết quả quan sát được ở sang thương tủy. Không có sự nhuộm màu tế bào nào quan sát được. Thanh thước đo hình A và B: 1mm; hình C và D: 50m. Vai trò của nguyên bào sợi trong tân tạo mạch máu Nguyên bào sợi tủy răng kich thích tân tạo mạch máu thông qua những yếu tố tăng trưởng hòa tan được. Trong hầu hết các trường hợp quan sát, không có sự tổ chức của tế bào nội mô nuôi với môi trường chứng, tức là không có tiếp xúc với nguyên bào sợi (hình 4A). Một vài sự tái tổ chức có thể được quan sát nhưng chu vi cấu trúc dạng ống rất nhỏ. Môi trường nuôi cấy sau 5 giờ tiếp xúc với nguyên bào sợi lành mạnh hay có tổn thương gây nên những thay đổi rõ rệt về hình thái tế bào nội mô và sự thành lập cấu trúc dạng ống (Hình 4B và 4A). Tuy nhiên, chu vi cấu trúc dạng ống hình thành trong môi trường tiếp xúc với nguyên bào sợi tổn thương lớn hơn so với nguyên bào sợi nguyên vẹn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 67 Việc đo chu vi cấu trúc dạng ống cho thấy một sự tăng có ý nghĩa thống kê là 49,95% (p<0,05) trong môi trường có tiếp xúc với nguyên bào sợi so với môi trường chứng (không có bất kì tiếp xúc nào với nguyên bào sợi). Hơn thế nữa, chu vi cấu trúc dạng ống còn tăng 36,97% với môi trường có tiếp xúc với nguyên bào sợi tổn thương so với nguyên vẹn (p<0,05) (Hình 5A). Chu vi cấu trúc dạng ống giảm khi thêm các kháng thể trung hòa FGF-2 và VEGF Việc thêm các kháng thể trung hòa FGF-2 và VEGF vào môi trường tiếp với nguyên bào sợi có tổn thương làm giảm chu vi cấu trúc dạng ống so sánh với khi không có thêm kháng thể trung hòa. Chu vi giảm 20,86% khi thêm kháng thể trung hòa VEGF, giảm 31,14% khi thêm kháng thể trung hòa FGF-2 và giảm 44,13% khi thêm cả hai loại kháng thể trung hòa. Sụ khác biệt có ý nghĩa thống kê khi cả hai loại kháng thể được sử dụng (p<0,05) (Hình 5B). Hình 4: Tác động của tiếp xúc gián tiếp giữa nguyên bào sợi và tế bào nội mô. Cấu trúc dạng ống của tế bào nội mô được nuôi trong môi trường chứng (không có tiếp xúc với nguyên bào sợi) (A); có tiếp xúc với nguyên bào sợi nguyên vẹn (B) và với nguyên bào sợi có tổn thương (C). Hình ảnh được chụp trực tiếp từ kính hiển vi đối pha, thanh thước đo = 200μm. Hình 5: Tác động của các yếu tố tăng trưởng mạch máu tiết ra bởi nguyên bào sợi trên chu vi cấu trúc dạng ống của tế bào nội mô. A. Chu vi cấu trúc dạng ống được đo và thể hiện theo % của nhóm chứng (không có tiếp xúc với nguyên bào sợi). B. Hiệu quả của kháng thể trung hòa. Chu vi cấu trúc dạng ống được đo và thể hiện theo % của nhóm không có thêm kháng nguyên. * p<0,05 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 68 BÀN LUẬN Khả năng đáp ứng của phức hợp ngà tủy với các tình trạng bệnh lý hay tổn thương bằng cách bồi đắp lớp ngà cấp ba đã được biết đến từ lâu. Những tổn thương nhẹ kích thích nguyên bào ngà sống sót tại vùng tổn thương tăng hoạt động tổng hợp và chế tiết để tiết ra lớp ngà phản ứng (Smith và cs, 1995; 2001)(5). Mặt khác, trong trường hợp bệnh lý làm chết lớp nguyên bào ngà, sự tái tạo ngà diễn ra qua việc thành lập lớp ngà sửa chữa nhờ một thế hệ mới của các tế bào giống nguyên bào ngà (odontoblast-like cells) (Tziafas và cs, 1995; 2000) (6,7). Do đó, không như ngà phản ứng, tạo thành ngà sửa chữa là một chuỗi các quá trình sinh học phức tạp hơn, phụ thuộc nhiều yếu tố bao gồm hiện diện của tế bào gốc/chưa biệt hóa cũng như các tín hiệu sinh học phân tử thuận lợi để kích thích quá trình tăng sinh, di chuyển và biệt hóa của thế hệ tế bào giống nguyên bào ngà. Cơ chế tế bào và sinh học phân tử bên dưới điều hòa chuỗi các sự kiện dẫn đến hình thành ngà sửa chữa đã là đề tài của nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo (About và cs, 2000; Smith và cs, 2001; Tziafas và cs, 2000)(1,5,7). Tuy nhiên vẫn còn rất ít hiểu biết về những giai đoạn sơ khởi của quá trình này, nhất là tăng sinh và di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa cũng như tân tạo mạch máu cần thiết cho lành thương tủy và di chuyển tế bào. Nghiên cứu này cho thấy sự hoạt hóa của tế bào gốc/chưa biệt hóa đáp ứng với tổn thương tủy. Điều này được chứng minh qua liên quan giữa vị trí tổn thương và cường độ của nhuộm màu tế bào, đậm ở gần tổn thương và giảm đi khi rời xa tổn thương. Sau khi tế bào tăng sinh, di chuyển tế bào đến vùng tổn thương cần thiết để bảo vệ tủy nhờ sự thành lập ngà sửa chữa. Kết quả còn chỉ rõ những tế bào này di chuyển đến vùng tổn thương và thay thế nguyên bào ngà hoại tử. Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra sau khi bị tổn thương, nguyên bào sợi tủy răng đóng một vai trò quan trọng trong tân tạo mạch máu bằng cách tiết ra FGF-2 và VEGF, kích ứng thành lập cấu trúc dạng ống của tế bào nội mô. Kết quả được khẳng định với các kháng thể trung hòa FGF-2 và VEGF làm giảm chu vi cấu trúc dạng ống của tế bào nội mô. Chu vi cấu trúc dạng ống đã được mô tả có thể phản ánh khả năng tân tạo mạch máu (Salani và cs, 2000). Hiệu ứng tân tạo mạch máu đạt được với môi trường sau một thời gian tiếp xúc ngắn với nguyên bào sợi (sau 5 giờ). Sự phóng thích yếu tố tăng trưởng mạch máu diễn ra nhanh và thích hợp với thay đổi diễn ra trong tủy sau tổn thương. Một khi tủy răng bị tổn thương, sự di chuyển tế bào chưa biệt hóa đến vùng tổn thương cần thành lập mạch máu mới. KẾT LUẬN Nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy tổn thương tủy răng đã kích thích sự tăng sinh và di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa ở vùng xung quanh mạch máu đến vùng tổn thương tủy. Khi bị tổn thương, nguyên bào sợi tủy răng tiết ra các yếu tố tăng trưởng mạch máu giúp tủy lành thương hoàn toàn. Tân tạo mạch máu có thể cần thiết cho các tế bào gốc/chưa biệt hóa di chuyển đến vùng có sang thương. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. About I, Bottero MJ, de Denato P, Camps J, Franquin JC, Mitsiadis TA (2000). Human dentin production in vitro. Exp Cell Res 258(1):33-41. 2. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S (2000). Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 97(25):13625-30. 3. Salani D, Taraboletti G, Rosano L, Di Castro V, Borsotti P, Giavazzi R, Bagnato A (2000). Endothelin-1 induces an angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo. Am J Pathol 157(5):1703-11. 4. Smith AJ, Cassidy N, Perry H, Begue-Kirn C, Ruch JV, Lesot H (1995). Reactionary dentinogenesis. Int J Dev Biol 39(1):273- 80 5. Smith AJ, Lesot H (2001). Induction and regulation of crown dentinogenesis: embryonic events as a template for dental tissue repair? Crit Rev Oral Biol Med 12(5):425-37. 6. Tziafas D (1995). Induction of reparative dentinogenesis in vivo: a synthesis of experimental observations. Connect Tissue Res 32(1-4):297-301. 7. Tziafas D, Smith AJ, Lesot H (2000). Designing new treatment strategies in vital pulp therapy. J Dent 28(2):77-92.