Khảo sát hoạt tính kháng viêm của các dẫn chất quang hoạt Cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon và Cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 122 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CÁC DẪN CHẤT QUANG HOẠT Cis-N-HEPTYL HEXAHYDRO PHTHALAZINON VÀ Cis-N-BENZYL HEXAHYDRO PHTHALAZINON Chương Ngọc Nãi*, Trần Quốc Duy**, Đặng Văn Tịnh**, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mục tiêu: Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã khám phá và phát triển những chất có hoạt tính ức chế phosphodiesterase (PDE) chọn lọc, đặc biệt trên PDE4 để điều trị bệnh viêm cấp tính và mạn tính. Hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã tổng hợp thành công các dẫn chất phthalazinon. Ở Việt Nam, các dẫn chất N-alkyl cis(+) và cis(-)-4-(3,4-dimethoxyphenyl) hexahydro phthalazinon đã được tổng hợp và tiêu chuẩn hóa thành công. Để tiếp tục công trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này nhằm sàng lọc chất có hoạt tính kháng viêm cao. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu:Dùng mô hình gây phù chân chuột bằng dung dịch carrageenan 1% để đánh giá tác động kháng viêm của các dẫn chất tổng hợp cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon (N1) và cis- N-benzyl hexahydro phthalazinon (N2). Đánh giá mức độ viêm bằng cách đo thể tích chân chuột bằng thiết bị Plethymometer mỗi ngày vào một giờ nhất định trong 6 ngày liên tiếp. Số liệu thu được được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0, dùng phép thống kê Mann-Whitney với p < 0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê để đánh giá sự khác biệt hiệu lực kháng viêm giữa các lô thử nghiệm và với chất đối chiếu. Kết quả: Các dạng đồng phân đối quang riêng lẻ và racemic của dẫn chất cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon và cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon đều có tác động kháng viêm, đặc biệt đồng phân dạng cis(+) có tác động mạnh hơn dạng cis(−). Đồng phân cis(+) của cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon tác động mạnh hơn đồng phân cis(+) của cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon. Liều lượng cũng ảnh hưởng đáng kể đến tác động kháng viêm. Dẫn chất cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon ở liều 60 μmol/kg và cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon ở liều 30 μmol/kg cho tác động ức chế phù tốt hơn. Kết luận: Các dạng đồng phân đối quang riêng lẻ và racemic của dẫn chất cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon và cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon đều có tác động kháng viêm, đặc biệt đồng phân dạng cis(+) có tác động mạnh hơn dạng cis(−) và dạng racemic. Đồng phân đối quang cis(+) của dẫn chất thế N-heptyl có triển vọng phát triển nguyên liệu làm thuốc mới. Từ khóa: cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon, cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon, phosphodiesterase,tác động kháng viêm. ABSTRACT ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY INVESTIGATION OF NEW CHIRAL Cis-N-HEPTYL HEXAHYDRO PHTHALAZINONE AND Cis-N-BENZYL HEXAHYDRO PHTHALAZINONE DERIVATIVES Chuong Ngoc Nai, Tran Quoc Duy, Dang Van Tinh, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 122 - 127 Objective: In recent years, some researchers have focused on the discovery and development of potent and selective phosphodiesterase (PDE) inhibitors, especially to PDE4 ones for treatment of acute and * Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS. Chương Ngọc Nãi ĐT: 0913799068 Email: diemnhim@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 123 chronic inflammatory diseases. Today, there are a number of researches reporting procedure for syntheses of several potent N-alkyl phthalazinone derivatives. In Vietnam, new chiral N-alkyl cis(+) and cis(−)-4-(3,4- dimethoxyphenyl) hexahydro phthalazinone derivatives were synthesized and standardized successfully. The aim of our study was to investigate anti-inflammatory activity of these compounds for screening substances with high anti-inflammatory activity. Subjects and Methods: This study used the model of induced edema in hind paw of the mice by carrageenan 1% to evaluate the anti-inflammatory activities of the synthesized new chiral cis-N-heptyl hexahydro phthalazinone (N1) and cis-N-benzyl hexahydro phthalazinone (N2) derivatives. The measurement of foot volumes was carried out following the Plesthymographic method. Mice were observed paw volume assessment within 6 consecutive days. The data was evaluated by MannWithney test using Minitab 16.0. Differences in anti- inflammatory activity between groups were considered significantly when p < 0.05. Results: Both enantiomer and racemic forms of the cis-N-heptyl and cis-N-benzyl hexahydro phthalazinone had anti-inflammatory activity. In particular, cis(+)-enantiomers showed higher anti-inflammatory activity, whereas their (-)-counterparts showed weaker activity. Moreover, the anti-inflammatory activity of cis(+)- enantiomer of the cis-N-heptyl hexahydro phthalazinone was higher than that of cis(+)-enantiomer of the cis-N- benzyl hexahydro phthalazinone. The dosage also influenced significantly on anti-inflammatory activity. The cis- N-heptyl hexahydro phthalazinone with the dose of 60 μmol/kg and the cis-N-benzyl hexahydro phthalazinone with the dose of 30 μmol/kg showed better inhibition of paw edema. Conclusion: The enantiomer and racemic forms of the cis-N-heptyl hexahydro phthalazinone and cis-N- benzyl hexahydro phthalazinone had anti-inflammatory activity, especially cis(+)-enantiomer of the N-heptyl substitution may be considered as a candidate to develop new potent anti-inflammatory drug substance. Keywords: cis-N-heptyl hexahydro phthalazinone, cis-N-benzyl hexahydro phthalazinone, phosphodiesterase,anti-inflammatory activity. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã khám phá và phát triển những chất có hoạt tính ức chế phosphodiesterase (PDE) chọn lọc, đặc biệt trên PDE4 để điều trị bệnh viêm cấp tính và mạn tính. Hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã tổng hợp thành công các dẫn chất phthalazinon có hoạt tính (1,4,3). Ở Việt Nam, các dẫn chất N-alkyl cis(+) và cis(-)-4-(3,4-dimethoxyphenyl) hexahydro phthalazinon đã được tổng hợp và tiêu chuẩn hóa. Để tiếp tục công trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này nhằm sàng lọc chất có hoạt tính kháng viêm cao. ĐỐI TƯỢNGPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu N1S6:Cis(+)-2-(N-heptyl)-4-(3,4- dimethoxyphenyl)-4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2H- phthalazin-1-on N1R6:Cis(−)-2-(N-heptyl)-4-(3,4- dimethoxyphenyl)-4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2H- phthalazin-1-on N1Ra6:Cis(±)-2-(N-heptyl)-4-(3,4- dimethoxyphenyl)-4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2H- phthalazin-1-on N2S6:Cis(+)-2-(N-benzyl)-4-(3,4- dimethoxyphenyl)-4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2H- phthalazin-1-on N2R6:Cis(−)-2-(N-benzyl)-4-(3,4- dimethoxyphenyl)-4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2H- phthalazin-1-on N2Ra6:Cis(±)-2-(N-benzyl)-4-(3,4- dimethoxyphenyl)-4a,5,6,7,8,8a-hexahydro-2H- phthalazin-1-on Thú vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực trưởng thành, chủng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 124 Swiss albino, nặng từ 22-25 g do Viện vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp. Chuột được nuôi cho thích nghi với môi trường ít nhất 2 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm. Tất cả thử nghiệm được tiến hành từ 8 giờ đến 16 giờ. Hóa chất Chất đối chiếu rolipram (Sigma Aldrich)(2,4). Carrageenan 1%(Sigma Aldrich) được pha trong dung dịch nước muối sinh lý, natri carboxymethyl cellulose, tween 80, dung dịch chống thấm ornano imbidente (Ugo Basile, Ý). Trang thiết bị Máy đo thể tích chân chuột Plethymometer model 7140 (Ugo Basile, Ý). Cân phân tích AND model HR 2000 (Nhật). Cân kỹ thuật Sarito model CP4202S (Nhật). Phương pháp nghiên cứu Dùng mô hình gây phù chân chuột bằng dung dịch carrageenan 1% (1,6,5). Chuột được phân lô sơ bộ theo thể trọng và thể tích chân, mỗi lô trung bình từ 8 -10 con. Chuột được tiêm dưới da vào gan bàn chân trái sau 0,025 ml dung dịch carrageenan 1%. Tiến hành đo thể tích chân chuột sau khi tiêm 3 giờ. Những chuột có thể tích chân sưng phù từ 50 -100 % được chọn và chia ngẫu nhiên thành các lô sao cho không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các lô. Lô trắng: chuột gây viêm nhưng không được điều trị, cho uống nước cất. Lô chứng: chuột được cho uống hỗn hợp tá dược natri carboxymethyl cellulose 2% và tween 80 0,2%, dùng điều chế hỗn dịch của chất thử nghiệm và chất đối chiếu. Lô đối chứng: chuột được cho uống hỗn dịch rolipram 10 mg/kg. Lô thử nghiệm: chuột được cho uống chất khảo sát được điều chế dạng hỗn dịch ở 2 liều là 30 và 60 µmol/kg. Đánh giá mức độ viêm bằng cách đo thể tích chân chuột bằng thiết bị Plethymometer mỗi ngày vào một giờ nhất định trong 6 ngày liên tiếp. Số liệu thu được được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0, dùng phép thống kê Mann-Whitney với p < 0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê để đánh giá sự khác biệt hiệu lực kháng viêm giữa các lô thử nghiệm và với chất đối chiếu. Đồ thị được vẽ với phần mềm Sigma plot 11. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 1:Độ sưng phù chân chuột của các lô (trung bình ± S.E.M, n = 8) Lô 3 giờ Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Trắng 69,69 ± 3,13 65,60 ± 4,67 63,92 ± 3,60 63,47 ± 5,37 57,77 ± 4,46 48,75 ±3,48 48,30 ± 5,00 Chứng 72,64 ± 3,31 67,82 ± 2,08 67,60 ± 1,59 64,16 ± 1,45 61,65 ± 3,39 55,52 ± 4,19 54,11 ± 3,50 Rolipram 70,96 ± 2,09 43,84** ± 2,13 40,55 ** ± 2,12 34,08** ± 2,09 29,92 ** ± 1,56 28,70** ± 2,26 26,28** ± 2,15 N1S6 30 68,86 ± 2,16 57,85 ± 4,83 59,16 ± 6,06 46,15* ± 5,47 45,65* ± 5,53 35,82* ± 5,68 35,76** ± 1,98 N1S6 60 68,94± 1,39 43,57** ± 3,29 42,35 ** ± 3,66 26,61** ± 2,96 21,00** ± 1,32 19,05** ± 1,79 19,18 ** ± 1,62 N1R6 30 69,04 ± 2,17 62,82 ± 4,86 61,41 ± 4,59 54,70 ± 5,80 52,44 ± 5,30 52,22 ± 5,02 47,74 ± 4,29 N1R6 60 67,83 ± 1,34 52,98** ± 2,17 64,61 ± 2,30 61,825 ± 3,72 39,91** ± 2,07 41,00* ± 2,30 39,26 ** ± 1,55 N1Ra6 30 68,90 ± 1,06 65,45 ± 1,14 64,54 ± 2,35 71,67* ± 2,11 65,83 ± 1,76 68,91** ± 1,74 63,87 ± 1,48 N1Ra6 60 68,95 ± 1,54 58,59** ± 2,85 55,71 ± 3,70 42,79 ± 4,72 28,83** ± 2,62 30,27* ± 2,92 28,17** ± 2,66 N2S6 30 67,15 ± 2,13 47,28** ± 2,26 43,41** ± 1,25 28,51** ± 2,23 43,66** ± 2,50 34,08* ± 1,37 29,33** ± 1,69 N2S6 60 69,6 9± 1,34 40,20** ± 1,52 59,40* ± 3,34 40,73** ± 2,89 39,30** ± 2,19 36,15** ± 2,66 36,35** ± 1,24 N2R6 30 68,14 ± 1,45 54,09**± 1,21 59,50 ± 3,63 47,20**± 3,01 58,45 ± 1,95 50,19 ± 3,09 50,50 ± 2,91 N2R6 60 69,44 ± 1,24 73,61 ± 1,86 73,61 ± 3,11 62,50 ± 1,86 62,06 ± 2,95 36,11* ± 1,24 36,11** ± 1,24 N2Ra6 30 68,65 ± 1,30 60,85 ± 1,81 65,58 ± 2,23 59,50* ± 1,21 34,99** ± 2,49 35,17* ± 1,21 34,85** ± 2,73 N2Ra6 60 68,43 ± 1,48 68,43 ± 1,48 58,83** ± 4,70 45,08** ± 1,52 52,27* ± 1,02 41,71 ± 3,47 50,87 ± 4,39 *: p < 0,05, **: p < 0,01: khác nhau có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 125 Hình 1: Độ sưng phù chân chuột ở các lô chứng, rolipram, N1S6 và N1R6 Hình 2: Độ sưng phù chân chuột ở các lô chứng, rolipram, N2S6 và N2R6 Hình 3: Độ sưng phù chân chuột ở các lô chứng, rolipram, N1Ra6 và N2Ra6 Hình 4: Độ sưng phù chân chuột ở các lô thử nghiệm N1S6, N2S6, N1R6 và N2R6 với liều 30 và 60 μmol/kg Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 126 Bảng 2:Tác động ức chế viêm của các chất khảo sát so với rolipram Chất thử % ức chế viêm so với rolipram 10 mg/kg Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Trung bình N1S6 30 36 20 57 42 63 57 46 N1S6 60 108 97 126 129 146 133 123 N1R6 30 13 11 36 13 2 -3 12 N1R6 60 66 -1 4 60 38 40 34 N1Ra6 30 1 -3 -27 -28 -98 -70 -38 N1Ra6 60 32 35 68 101 90 91 70 N2S6 30 84 87 116 49 71 86 82 N2S6 60 117 18 77 66 60 54 65 N2R6 30 53 19 54 -2 -7 -10 18 N2R6 60 -37 -41 3 -15 61 55 4 N2Ra6 30 22 -4 13 84 66 59 40 N2Ra6 60 43 25 61 19 33 -12 28 Nhận xét - N1S6: Liều 30 µmol/kg có tác động kháng viêm yếu hơn so với rolipram, khởi phát chậm (ngày 3), ổn định. Liều 60 µmol/kg có tác động kháng viêm mạnh hơn rolipram, khởi phát nhanh (ngày 1), ổn định. Liều lượng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, liều 60 µmol/kg cho tác động kháng viêm tốt hơn. - N1R6: Liều 30 µmol/kg hầu như không có tác động kháng viêm. Liều 60 µmol/kg cho tác động kháng viêm yếu hơn rolipram, khởi phát nhanh và không ổn định. Liều lượng không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả trị liệu. - N1Ra6: Liều 30 µmol/kg không có tác động kháng viêm, thậm chí còn làm tăng mức độ viêm. Liều 60 µmol/kg cho tác động kháng viêm yếu hơn rolipram, khởi phát nhanh và không ổn định. Liều lượng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, liều 60 µmol/kg cho tác động tốt hơn liều 30 µmol/kg. - N2S6: Liều 30 µmol/kg cho tác động kháng viêm yếu hơn rolipram, khởi phát nhanh và duy trì ổn định. Liều 60 µmol/kg cho tác động kháng viêm yếu hơn rolipram, khởi phát nhanh và duy trì khá ổn định. Liều lượng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, liều 30 µmol/kg cho tác động kháng viêm mạnh hơn liều 60 µmol/kg. - N2R6: Cho tác động kháng viêm yếu hơn hẳn rolipram ở cả 2 liều sử dụng. Liều lượng ảnh hưởng đến hiệu quả trị liệu, liều 30 µmol/kg mạnh hơn ở giai đoạn đầu, liều 60 µmol/kg mạnh hơn ở giai đoạn cuối của quá trình thử nghiệm. - N2Ra6: Liều 30 µmol/kg cho tác động kháng viêm yếu hơn rolipram, khởi phát chậm (ngày 3) và duy trì ổn định. Liều 60 µmol/kg cho tác động kháng viêm yếu hơn rolipram, khởi phát chậm và ngắn hạn. Liều lượng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị, liều 30 µmol/kg mạnh hơn ở giai đoạn sau, liều 60 µmol/kg mạnh hơn ở giai đoạn đầu. KẾT LUẬN Các dạng đồng phân đối quang riêng lẻ và racemic của dẫn chất cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon và cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon đều có tác dụng kháng viêm, đặc biệt đồng phân dạng cis(+) có tác dụng mạnh hơn dạng cis(−). Dẫn chất cis-N-heptyl hexahydro phthalazinon ở liều cao tác dụng mạnh hơn ở liều thấp. Dẫn chất cis-N-benzyl hexahydro phthalazinon thì ngược lại, ở liều cao tác động yếu hơn liều thấp. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc nghiên cứu liều lượng tối ưu ở mỗi chất thử nghiệm. Đồng phân đối quang cis(+) của dẫn chất N-heptyl có triển vọng phát triển nguyên liệu làm thuốc mới do có hoạt tính kháng viêm mạnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chuong Ngoc Nai, Vu Thi Thuy Ha, Nguyen Duc Tuan, Vo Phung Nguyen, Dang Van Tinh (2011), Anti-inflammatory Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 127 Activity Investigation of New Chiral N-alkyl Cis-tetrahydro phthalazinone Derivatives, Proceeding of The 7th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, December 14-16, 2011, Bangkok, Thailand, 449-452. 2. Daisuke H, Yukihito T, Yuko T, Haruhiko M (2006), Effect of orally administered rolipram, a phosphodiesterase 4 inhibitor, on a mouse model of the dermatitis caused by 2,4,6-trinitro-1- chlorobenzene (TNCB)-repeated application, European Journal of Pharmacology, 532(1-2): 128-137 3. Dang VT, Jin KC, Miyamoto M, Ikee Y, Masuda T, Sano S, Shiro M, Nagao Y (2006), Practical synthesis of new chiral cis- phthalazinones with potential for high phosphodiesterase inhibitory activity, Heterocycles, 68: 2133-2144. 4. Van der May M, Boss H, Hatzelmann A, Van der Laan IJ, Sterk GJ, Thibaut U, Timmerman H (2002), Novel selective PDE4 inhibitor. 3. In vivo antiinflammatory activity of a new series of N-substituted cis-tetra- and cis- hexahydrophthalazinones, Journal of Medical Chemistry, 45: 2520-2525. 5. Winter CA, Risley NGE (1962), Carrageenan-induced edema in hind paw of the rat as an assay for anti-inflammatory drugs, Proc Soc Exp Biol Med, 111: 544-547. 6. Winyard PG, Willoughby DA (2003), Inflammation protocols, Humana Press, 115-120. Ngày nhận bài báo: 13.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014