Khảo sát tác động kháng Salmonella và Shigella của một số phối hợp chalcon dị vòng và kháng sinh

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 431 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG SALMONELLA VÀ SHIGELLA CỦA MỘT SỐ PHỐI HỢP CHALCON DỊ VÒNG VÀ KHÁNG SINH Trần Hồng Thoại Nga*, Nguyễn Thị Cẩm Vi **, Trần Cát Đông*, Trần Thành Đạo* TÓM TẮT Mở đầu: Flavonoid là hợp chất gần đây thường được nhắc đến về khả năng kháng khuẩn và hiệp đồng với kháng sinh ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn đề kháng. Trong đó chalcon tuy là nhóm phụ của flavonoid, nhưng có nhiều dẫn chất đã được báo cáo có tác dụng sinh học rất đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, Mục tiêu: Khảo sát tác dụng kháng Salmonella và Shigella của một số dẫn chất chalcon dị vòng tổng hợp được và khả năng phối hợp với kháng sinh trên các chủng vi khuẩn nêu trên. Phương pháp: Tác động kháng khuẩn của các flavonoid được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Tác động hiệp đồng kháng khuẩn của các flavonoid với kháng sinh được định tính bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa. Định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của các flavonoid với kháng sinh trên Salmonella và Shigella bằng phương pháp bàn cờ. Kết quả: Các dẫn xuất chalcon dị vòng F4 và F5 phối hợp với kháng sinh doxycylin và cefuroxin có tác dụng hiệp đồng trên Salmonella. Ngoài ra, các phối hợp giữa F4 và doxycyclin; F4 và cefuroxim; F5 và doxycyclin có tác dụng hiệp đồng trên Shigella. Kết luận: Đã tổng hợp được một số chất chalcon có tác động kháng khuẩn trên Salmonella và Shigella, trong đó có hai chất chalcon dị vòng F4 và F5 có tiềm năng hiệp đồng với kháng sinh trên hai vi khuẩn này. Từ khóa: Chalcon, kháng sinh, tác dụng hiệp đồng, phương pháp bàn cờ. ABSTRACT INVESTIGATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF SOME COMBINATIONS OF HETEROCYCLIC CHALCONE AND ANTIBIOTIC AGAINST SAMONELLA AND SHIGELLA Tran Hong Thoai Nga, Nguyen Thi Cam Vi , Tran Cat Đong, Tran Thanh Đao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 431 - 436 Background: Flavonoids have recently been interested because of their potentially antimicrobial activities and synergic effects with antibiotics against resistant bacteria. Objectives: Investigate antimicrobial activities alone and on the combination with antibiotics against Salmonella and Shigella of some synthetic heterocyclic chalcone derivatives. Methods: Antimicrobial activities of chalcone derivatives were determined by agar diffusion method. Checkerboard method was used to determine type of synergic effect of combination of chalcone derivatives with antibiotics. Results: Among the six heterocyclic chalcone derivatives the compounds of F4 (1-(pyridine-2-yl)-3-(3- hydroxyphenyl)-2-propene-1-one)) and F5 (1-(furane-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-one) showed potentially synergic effect with doxycylin and cefuroxim against tested Salmonella. Combinations of F4 and *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Trường Đại học Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Thành Đạo ĐT: 0903716482 Email: thanhdaot@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 432 doxycycline; F4 and cefuroxim; F5 and doxycyclin are the most potential against tested Shigella. Conclusions: In this work, six heterocyclic chalcon derivatives have been synthesized and two of them demonstrated positive synergism with antibiotics against Salmonella and Shigella. Keywords: Chalcone, antibiotic, synergic effect, checkboard methods. ĐẶT VẤN ĐỀ Sự ra đời của kháng sinh trong thế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể các mối đe dọa về các bệnh truyền nhiễm. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, những lợi ích này đã và đang bị hủy hoại nghiêm trọng bởi sự xuất hiện và lây lan của các chủng vi khuẩn kháng với các loại thuốc rẻ tiền và hiệu quả của thế hệ đầu tiên, từng được xem như là sự lựa chọn hàng đầu. Một số bệnh nhiễm khuẩn hiện phổ biến có tỉ lệ đề kháng kháng sinh cao như: bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng đường hô hấp, viêm màng não, nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và nhiễm trùng tại bệnh viện. Một số ví dụ quan trọng bao gồm Streptococcus pneumoniae kháng penicillin, enterococci kháng vancomycin, Staphylococcus aureus kháng methicillin, Salmonella đa đề kháng và Mycobacterium tuberculosis đa đề kháng. Hậu quả là nhiễm trùng do vi khuẩn đã đề kháng không đáp ứng với điều trị, dẫn đến bệnh kéo dài và nguy cơ tử vong cao. Điều trị thất bại cũng dẫn đến làm tăng số người bị nhiễm bệnh trong cộng đồng(12). Khi vi khuẩn trở nên đề kháng với các kháng sinh thế hệ đầu tiên, điều trị đã được chuyển sang các kháng sinh thế hệ hai hoặc ba, có giá thành đắt, ví dụ như các loại thuốc trị bệnh lao đa đề kháng đắt hơn 100 lần các loại thuốc thế hệ đầu dùng để điều trị các thể không để kháng. Do đó, việc tìm ra những hoạt chất mới có ý nghĩa rất quan trọng và cũng là nhiệm vụ cấp bách của ngành Dược Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Trong những năm gần đây, việc tìm ra những chất kháng khuẩn có sẵn trong thiên nhiên có khả năng tăng cường tác dụng chống lại vi khuẩn của các kháng sinh thế hệ đầu ngày càng được quan tâm. Trong một số nghiên cứu gần đây cho thấy sự đồng vận lá trà xanh và kháng sinh trên một số vi khuẩn họ enterobacter như Salmonella, Shigella, E. coli(9) Flavonoid cũng là một hợp chất thường được nhắc đến về khả năng kháng khuẩn và hiệp đồng với kháng sinh ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn đề kháng(1,5,6,7). Trong đó, chalcon tuy là một nhóm phụ của flavonoid nhưng gần đây có nhiều dẫn chất được báo cáo có tác dụng sinh học rất đa dạng. Nhiều hợp chất trong nhóm này có tác động kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do và có các đặc tính kháng viêm, giảm đau(8,11). Nhằm tiếp tục nghiên cứu sâu thêm các hợp chất chalcon cả về cấu trúc và hoạt tính sinh học, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tổng hợp một số dẫn chất chalcon dị vòng (Hình 1) và khảo sát tác dụng kháng Salmonella và Shigella. Hình 1. Cấu trúc một số chalcon dị vòng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 433 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Các đĩa giấy kháng sinh mua từ công ty Nam Khoa: ampicillin (Am) 10 μg/đĩa; cefuroxim (Cu) 10 μg/đĩa; doxycyclin (Dx) 30 μg/đĩa; bactrim (Bt) 30 μg/đĩa. Các chủng vi khuẩn Shigela sp và Salmonella sp. do Bộ môn Vi Sinh - Ký sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn mua từ công ty Merck: môi trường phân lập và giữ gốc vi khuẩn: Tryptic Soy Agar (TSA); môi trường hoạt hóa vi khuẩn: canh thang Tryptic Soy Broth (TSB); môi trường thử nghiệm kháng sinh: Mueller-Hinton Agar (MHA). Các chalcon thử nghiệm (xem Bảng 1) được tổng hợp tại bộ môn Hóa Dược- Khoa Dược- ĐH Y Dược TP.HCM) theo tài liệu đã công bố(11) Phương pháp Định tính tác động kháng khuẩn các flavonoid bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch(10), đường kính vùng ức chế của các kháng sinh thử nghiệm được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ(4). Định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn của các flavonoid với kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch(2). Định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của các flavonoid với kháng sinh trên vi khuẩn bằng phương pháp bàn cờ(2). Đánh giá kết quả: các phối hợp có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm sẽ được chọn để tính chỉ số ức chế riêng phần FIC (fractional inhibitory concentration), dựa theo công thức sau(2,3). Trong đó: MIC: nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration); FIC < 0,5: hiệp đồng; 0,5 2: đối kháng. Bảng 1. Danh pháp và cấu trúc chalcon dị vòng khảo sát tác dụng sinh học STT Danh pháp Công thức Ký hiệu 1 1-(pyridin-2-yl)-3-(2-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F1 2 1-(furan-2-yl)-3-(2-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F2 3 1-(thiophen-2-yl)-3-(2-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F3 4 1-(pyridin-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F4 5 1-(furan-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on O O OH F5 6 1-(thiophen-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F6 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 434 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả định tính tác động kháng khuẩn của các chalcon dị vòng thử nghiệm Các chalcon thử nghiệm được pha thành các dung dịch mẹ trong dimetyl sulfoxid (DMSO), sau đó pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/mL với môi trường MHA sao cho nồng độ chất trợ tan DMSO là 2%. Cho khoảng 8 - 10 μL dung dịch trên vào lỗ đã đục trên mặt thạch. Tiến hành song song với mẫu chứng chứa DMSO. Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37 oC trong 16-18 giờ. Đọc kết quả bằng mắt thường, ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn (mm) trong Bảng 2. Bảng 2. Định tính tác động kháng khuẩn của chalcon trên Shigella và Salmonella Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)Vi khuẩn thử nghiệm F1 F2 F3 F4 F5 F6 Am* Cu* Dx* Bt* Shigella sp 7 5 0 8 8 3 0 29 12 24 Salmonella sp 0 0 0 4 4 0 24 22 21 30 *Xác định đường kính vòng vô khuẩn của các kháng sinh dung phương pháp kháng sinh đồ với các đĩa giấy tẩm kháng sinh. Trên vi khuẩn Shigella, các chất F1, F2, F4, F5 và F6 có tác động ức chế, trong khi trên vi khuẩn Salmonella chỉ có 2 chất F4, F5 có hoạt tính kháng khuẩn yếu. Kết quả định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn của kháng sinh và các chất thử nghiệm Các dẫn chất chalcon được pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/ml với nồng độ chất trợ tan DMSO là 2% rồi nhỏ khoảng 8-10 μL vào lỗ trên mặt thạch. Đặt đĩa kháng sinh lên bề mặt thạch sao cho khoảng cách từ tâm đĩa kháng sinh đến tâm giếng chứa chất thử lớn hơn tổng bán kính vòng kháng khuẩn riêng phần của kháng sinh và của chất thử nghiệm 1-2 mm. Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Song song tiến hành trên mẫu chứng là lỗ chỉ chứa DMSO. Đọc kết quả dựa vào sự lan rộng vòng vô khuẩn hướng vào nhau giữa 2 chất thử nghiệm phối hợp (xem Bảng 3 và 4). Bảng 3. Định tính tác dụng hiệp đồng trên Shigella Chalcon thử nghiệm Kháng sinh F1 F2 F3 F4 F5 F6 Ampicillin (Am) - - - - - - Cefuroxim (Cu) - - - + + - Doxycyclin (Dx) - - - + + - Bactrim (Bt) - - - - - - Các cặp Dx và F4, Dx và F5, Cu và F4, Cu và F5 có tác dụng hiệp đồng trên Shigella. Bảng 4. Định tính tác dụng hiệp đồng trên Salmonella Chalcon thử nghiệm Kháng sinh F1 F2 F3 F4 F5 F6 Ampicillin (Am) - - - - - - Cefuroxim (Cu) - - - + + - Doxycyclin (Dx) - - - + + - Bactrim (Bt) - - - - - - Các cặp Dx và F4, Dx và F5, Cu và F4, Cu và F5 có tác dụng hiệp đồng trên Salmonella. Giá trị MIC của kháng sinh và chất thử nghiệm riêng rẽ trên Shigella và Salmonella Các bột kháng sinh được cân chính xác và pha trong nước cất vô trùng. Các chất thử nghiệm chalcon được pha thành các dung dịch mẹ trong DMSO, sau đó pha với môi trường MHA sao cho nồng độ chất trợ tan DMSO là 2% để đạt nồng độ mong muốn trong các giếng. Nồng độ các chất thử nghiệm và kháng sinh được pha loãng giảm dần ½ trong phiến 96 giếng. Chấm 1-2 μl huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn bị, ủ ở nhiệt độ 37 oC trong thời gian 16- 18 giờ. Đọc kết quả: giá trị MIC được tính cho giếng có nồng độ chất thử thấp nhất vi khuẩn thử nghiệm không mọc được (xem Bảng 5). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 435 Bảng 5. Xác định MIC của kháng sinh và chalcon thử nghiệm trên Shigella và Salmonella MIC của kháng sinh và chalcon (µg/ml) Chủng VK Am Cu Dx F1 F2 F3 F4 F5 F6 Shigella 128 8 16 512 1024 - 32 32 1024 Salmonella 8 16 4 - - - 1024 512 - Các chất F4, F5 có tác động cả trên 2 chủng vi khuẩn thử nghiệm, mạnh trên Shigella (32 μg/ml), yếu trên trên Salmonella (>512 μg/ml). Các chất F1, F2, F6 có tác động yếu trên Shigella (>512 μg/ml) và không tác động trên Salmonella. Định lượng tác dụng hiệp đồng của dẫn chất chalcon và các kháng sinh trên phiến 96 giếng Trên vi khuẩn Shigella Tiến hành phối hợp chất thử nghiệm và kháng sinh phối hợp trên phiến 96 giếng theo nguyên tắc pha loãng ½, trong đó giếng đầu tiên có nồng độ bằng hoặc gấp đôi giá trị MIC của mỗi chất trong phối hợp. Tính giá trị FIC theo công thức (1), kết quả xem Bảng 6 và Bảng 7. Trong các phối hợp trên, chúng tôi xác định có 2 cặp phối hợp có tác dụng hiệp đồng trên Shigella, có giá trị FIC < 0,5: Doxycyclin và F4 (1-(pyridine-2-yl)-3-(3- hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Doxycyclin và F5 (1-(furan-2-yl)-3-(3- hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Trên vi khuẩn Salmonella Trong các phối hợp trên, đã xác định có 2 cặp phối hợp có tác dụng hiệp đồng trên Shigella, có giá trị FIC < 0,5: Doxycyclin và F4 (1-(pyridin-2-yl)-3-(3- hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Cefuroxim và F4 (1-(pyridin-2-yl)-3-(3- hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Bảng 6. Giá trị FIC khi phối hợp kháng sinh và chalcon trên vi khuẩn Shigella MIC (µg/ml) STT Các phối hợp Riêng rẽ Phối hợp FIC Kết luận kiểu phối hợp Mức giảm giá trị MIC của kháng sinh trong phối hợp (lần) Cu 8 2 1 F4 32 16 0,75 Cộng hợp 4 Cu 8 2 2 F5 32 8 0,5 Cộng hợp 4 Dx 16 1 3 F4 32 8 0,3125 Hiệp đồng 16 Dx 16 4 4 F5 32 4 0.375 Hiệp đồng 4 Bảng 7. Giá trị FIC khi phối hợp kháng sinh và chalcon trên vi khuẩn Salmonella MIC (µg/mL) STT Các phối hợp Riêng rẽ Phối hợp Gía trị FIC Kết luận kiểu tác động Mức giảm giá trị MIC của kháng sinh trong phối hợp (lần) Cu 16 0,25 1 F4 1024 64 0,07 Hiệp đồng 64 Cu 16 8 2 F5 512 256 1 Cộng hợp 2 Dx 4 0,25 3 F4 1024 128 0,187 5 Hiệp đồng 16 Dx 4 1 4 F5 512 256 0,75 Cộng hợp 4 Liên quan cấu trúc tác dụng Các chalcon có vòng A là furfuran hoặc pyridin có tác dụng kháng khuẩn trung bình trên Shigella và Salmonella, đặc biệt, hoạt tính tăng lên đáng kể trên Shigella nếu có thêm nhóm thế hydroxyl ở vị trí 3 của vòng B. Chalcon có tác dụng hiệp đồng với cefuroxim và doxycyclin trên Shigella trong cấu trúc có nhóm thế hydroxy ở vị trí 3 trên vòng B. Ngược lại, các chalcon có vòng A là thiophen không có hoặc có tác dụng kháng khuẩn kém và không có tác dụng hiệp đồng với cefuroxim hay doxycyclin trên Shigella và Salmonella. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 436 KẾT LUẬN Trong báo cáo này chúng tôi đã ghi nhận lần đầu tiên về tính kháng khuẩn của các dẫn xuất chalcon tổng hợp trên hai vi khuẩn đường ruột là Salmonella và Shigella. Kết quả cho thấy có F4 và F5 là các chalcon dị vòng có tìm năng hiệp đồng với kháng sinh doxycyclin và cefuroxim trên vi khuẩn Shigella và Salmonella. Phối hợp giữa F4 với cefuroxim và doxycyclin là các phối hợp có tác dụng mạnh trên Salmonella, thể hiện ở khả năng làm giảm MIC của kháng sinh tương ứng là 64 lần và 16 lần. Phối hợp giữa F5 với cefuroxim và doxycyclin là các phối hợp có tác dụng trung bình trên Salmonella, khả năng cộng lực kháng Salmonella thể hiện ở khả năng làm giảm MIC của kháng sinh tương ứng là 2 lần và 4 lần. Phối hợp giữa F4 và doxycyclin là phối hợp có tác dụng mạnh trên Shigella, khả năng hiệp lực thể hiện ở khả năng làm giảm MIC của kháng sinh 16 lần. Các phối hợp giữa F4 và cefuroxim; F4 và doxycyclin; F5 và doxycyclin là các phối hợp có các dụng trung bình trên Shigella, giảm MIC kháng sinh 4 lần. Cảm ơn: Các tác giả cảm ơn quĩ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted) đã hỗ trợ kinh phí nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alcaraz L. E.; Blanco S. E.; Puig O.N.; Tomas F.; Ferretti F. H. (2000). Antibacterial activity of Flavonoids against methicillin- resistant Staphylococcus aureus strains. Journal of Theoretical Biology, 205(2), 231-240. 2. Bajaksouzian, S., Visalli M. A., Jacobs M. R., and Appelbaum P. C.. (1997). Activities of levofloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin, alone and in combination with amikacin, against acinetobacters as determined by checkerboard and time-kill studies. Antimicrob. Agents Chemother. 41:1073– 1076. 3. Bonapace C. R., White R. L., Friedrich L. V., and Bosso J. A.. (2000). Evaluation of antibiotic synergy against Acinetobacter baumannii: a comparison with E-test, time-kill, and checkerboard methods. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 38:43– 50. 4. CLSI (2008). Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing; Informational supplement. M100-S18. 5. Mandalari, G., Bennett R. N., Bisignano G., et al. (2007). Antimicrobial activity of flavonoids extracted from bergamot (Citrus bergamia Risso) peel, a byproduct of the essential oil industry. J Appl Microbiol. 103(6), 2056-64. 6. Miller, Alan L. (1996). Antioxidant Flavonoids: Structure, Function and Clinical Usage. Alternative Medicine Review. 2(1), 103-111. 7. Nazrul Islam S. K., Gray A. I., Waterman P. G., et al. (2002). Screening of eight alkaloids and ten flavonoids isolated from four species of the genus Boronia (Rutaceae) for antimicrobial activities against seventeen clinical microbial strains. Phytother Res. 16(7), 672-4. 22 8. Nielsen S. F., Larsen M., (2004). Antibacterial chalcones- bioisosteric replacement of 4’-hydroxy group. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12(11), 3047-3054. 9. Tiwari, T. P., Bharti S. K., Kaur H. D., et al. (2005), "Synergistic antimicrobial activity of tea & antibiotics", Indian J Med Res. 122(1), 80-4. 33 10. Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2002). Xây dựng mô hình đánh giá chất có tiềm năng kháng khuẩn. Y Học TP. Hồ Chí Minh, 6(1), 309 - 313. 11. Trần Lê Ánh Thùy, Nguyễn Thị Thảo Như, Đỗ Tường Hạ, Võ Thị Anh Thư, Trần Thành Đạo. Tổng hợp và hoạt tính kháng vi sinh vật một số dẫn chất Chalcon dị vòng. Tạp chí Y hoc TP.HCM, Phụ bản của Số 1, Tập 14, 2010, Tr 110-116 12. WHO (2002). Antimicrobial resistance. tại trang web (truy cập thông tin ngày 10/11/2010):