Luận văn Nghiên cứu cố định enzyme urease trên bề mặt rắn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE TRÊN BỀ MẶT RẮN SVTH : VÕ KHÔI NGUYÊN MSSV : 60301890 CBHD : TS. TRẦN BÍCH LAM KS.VŨ THỊ KIM HẠNH BỘ MÔN KỸ THUẬT THỰC PHẨM TP Hồ Chí Minh, 01/2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Bích Lam và KS.Vũ Thị Kim Hạnh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Cám ơn quý thầy cô bộ môn Kỹ thuật Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quí báu của mình giúp tôi hoàn thành tốt chương trình học. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tp HCM, Tháng 1/2008 Võ Khôi Nguyên MỤC LỤC Đề mục Trang Trang bìa………………………………………………………………………………………………..……………………….……………………….i Nhiệm vụ luận văn Lời cảm ơn…………………………………………………………………………………………..………………………………………………….ii Mục lục……….……………………………………………………………………………………..…………………………….………………..……iii Danh sách hình vẽ……….………………………………………………………………..………………….…………………………………vi Danh sách bảng biểu……….…………………………………………………..…………………………………………………………….viii Giới thiệu.……………………………………………………………………………………………..…………………………………………………ix CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………………………………………………………………………………1 1.1. Tổng quan về enzyme urease…………………………………………………………………………………………………..1 1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme urease…………………………………………………………………………………….1 1.1.2 Cấu tạo…………………………………………………………………………………………………………………………………………….2 1.1.3 Cơ chế xúc tác……………………………………………………………………………………………………………………………...3 1.1.4 Cơ chất của enzyme urease…………………………………………………………………………………………………….5 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme urease…………………………………………………….5 1.1.6 Nguồn thu nhận enzyme urease…………………………………………………………………………………………….8 1.1.7 Ứng dụng của enzyme urease…………………………………………………………………………………………………9 1.2. Sơ lược về enzyme cố định………………………………………………………………………………………………………..10 1.2.1 Giới thiệu………………………………………………………………………………………………………………………………………..10 1.2.2. Các phương pháp cố định enzyme……………………………………………………………………………………….12 1.3. Tổng quan về enzyme urease cố định…………………………………………………………………………………..15 1.3.1 Giới thiệu………………………………………………………………………………………………………………………………………..15 1.3.2. Các phương pháp cố định enzyme urease………………………………………………………………………..15 1.3.3 Tính chất của enzyme urease cố định………………………………………………………………………………….19 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………28 2.1. Nguyên liệu……………………………………………………………………………………………………………………………………..28 2.1.1 Enzyme urease……………………………………………………………………………………………………………………………..28 2.1.2 Vật liệu cố định…………………………………………………………………………………………………………………………….28 2.1.3 Hóa chất………………………………………………………………………………………………………………………………………….30 2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………………………………………………………………….31 2.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu………………………………………………………………………………………..31 2.2.2 Khảo sát xác định phương pháp cố định enzyme urease…………………………………………….32 2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị……………………………………………………………………………………………………………..36 2.2.4. Xác định hiệu suất cố định enzyme urease cố định lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị…………………………………………………………………………………………………………………………………………..39 2.2.5 Khảo sát tính chất của enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………40 2.2.6 Các phương pháp phân tích……………………………………………………………………………………………………..43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………………………………………………………………………………………….…47 3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị…………………………………………………………………………………….………………………47 3.1.1 Khảo sát xác định phương pháp cố định enzyme urease lên ống thủy tinh………..47 3.1.2 Aûnh hưởng của độ dày màng chitosan……………………………………………………………………………….49 3.1.3 Aûnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde…………………………………………………………………………..50 3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch glutaraldehyde………………..51 3.1.5 Ảnh hưởng của pH của dung dịch enzyme urease………………………………………………………..52 3.1.6 Aûnh hưởng của thời gian ngâm…………………………………………………………………………………………….54 3.2 Xác định hiệu suất cố định enzyme urease trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55 3.3 Khảo sát tính chất của enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị……………………………………………………….………………………………………………………………………………………………..56 3.3.1 Khảo sát tính chất động học của enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị………………………………………………………………………………………………………………………………………..56 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị…………………………………………………………………………………………………………………………….59 3.3.3 Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme urease cố định trên màng chitosan……………..61 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị………………………………………………………………………………………………………………………………………..63 3.3.5 Khảo sát khả năng tái sử dụng của đến enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị……………………………………………………………………………………………………………………………..65 3.3.6 Khảo sát độ bền bảo quản đến enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị………………………………………………………………………………………………………………………………………..66 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………………………69 4.1. Kết luận................................................................................................................69 4.2. Kiến nghị..............................................................................................................69 Tài liệu tham khảo……………………………………………………………………………………………………………………………….71 Phụ lục…………………….……………………………………………………………………………………………………………………………….81 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Enzyme urease............................................................................................................1 Hình 1.2: Tinh thể urease...........................................................................................................2 Hình 1.3: Trung tâm hoạt động của urease.................................................................................3 Hình 1.4: Cơ chế xúc tác của urease..................................................................................... ....4 Hình 1.5: Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của urease tự do và cố định............................... ...23 Hình 1.6: Độ bền nhiệt của urease tự do và cố định tại nhiệt độ 70oC trong đệm pH 7..........24 Hình 1.7: Nhiệt độ tối ưu của enzyme ureae tự do và cố định trong đệm pH 6.5....................24 Hình 1.8: Aûnh hưởng của pH đến enzyme cố định trên màng trao đổi ion .............................25 Hình 1.9: Aûnh hưởng của pH đến enzyme urease cố định........................................................25 Hình 2.1: Cấu tạo của chitosan…………………………………………………………………………………………………………………………28 Hình 2.2: Công thức cấu tạo của glutaraldehyde………………………………………………………………………………………30 Hình 2.3: Tổng quát về sơ đồ nghiên cứu……………………………………………………………………………………………………31 Hình 2.4: Sơ đồ phương pháp tạo enzyme cố định trong gel gelatin bằng phương pháp nhốt……………………………………………………………………………………………………………………………….……………………………………………33 Hình 2.5: Sơ đồ phương pháp cố định enzyme urease bằng liên kết đồng hóa trị ………….………..36 Hình 3.1: Khảo sát các loại màng …………………………………………………………………………………………………………………47 Hình 3.2: Khảo sát thể tích rút chitosan để tạo màng……………………………………………..…………………………….50 Hình 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ GA ……………………………………………………………………………………..50 Hình 3.4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong GA ……………………………………………….52 Hình 3.5: Khảo sát ảnh hưởng của pH của dung dịch enzyme urease đến hoạt tính urease cố định………………………………………………………………………………… ……………………………..………………………………………………………….53 Hình 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định urease……..……………………………………………………….55 Hình 3.7 : Đồ thị biểu diễn sự biến đổi vận tốc thủy phân của urease cố định và urease tự do khi thay đổi nồng độ cơ chất urea………………………………………………………………………………..……………………………….56 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa 1/V và 1/[S] của urease cố định và urease tự do.………………………………………………………………………………………………………………..……………………………………………………………..57 Hình 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme cố định và enzyme tự do………….……..60 Hình 3.10: Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme cố định và enzyme tự do ở 550C…..…………..…...62 Hình 3.11: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến enzyme cố định và enzyme tự do………………………….64 Hình 3.12: Khảo sát số lần tái sử dụng của màng……….………………………………………………………………………….65 Hình 3.13: Độ bền bảo quản của enzyme urease cố định và urease tự do………….…………………………66 Hình 3.14: Phản ứng của protein và Coomassie Brilliant Blue-G250..………………………………….……….81 Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn NH3…………..…………………………………………………….………83 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn protein.………………………………………………………….………..84 Hình 3.17: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm log(hoạt tính enzyme urease) theo thời gian của enzyme urease tự do và urease cố định trên màng chitosan ở 550C………………………….………….………..86 Hình 3.18: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm log(hoạt tính urease) theo thời gian của enzyme urease cố định trong các dung dịch bảo quản và enzyme urease tự do.……….…………….…………..87 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tính chất của một số loại urease từ các nguồn khác nhau.......................................9 Bảng 1.2: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme........................................14 Bảng 1.3: Một số phương pháp cố định enzyme urease ..........................................................17 Bảng 2.1: Chỉ tiêu chất lượng của gelatin……………..…………………………………………………………..……………………..29 Bảng 2.2: Một số tính chất hóa lý của glutaraldehyde…………………………………………………….…………………..30 Bảng 2.3: Dãy ống nghiệm trong phương pháp xác định hoạt tính enzyme urease tự do……….44 Bảng 3.1: Các thông số động học của urease cố định và urease tự do.…………………………………………58 Bảng 3.2: Kết quả hằng số tốc độ vô hoạt enzyme k và thời gian “bán hủy” t1/2 của enzyme urease cố định và enzyme urease tự do ở 550C.……………………………………………………..………………………………63 Bảng 3.3: Kết quả hằng số tốc độ vô hoạt enzyme k và thời gian “bán hủy” t1/2 của enzyme urease cố định trong các dung dịch bảo quản và enzyme urease tự do ……….……………………………..68 Bảng 3.4: Dãy ống nghiệm dùng để thiết lập đường chuẩn protein……………………………………………….82 Bảng 3.5: Kết quả xác định vận tốc thủy phân urea của enzyme urease tự do……….………………..85 Bảng 3.6: Kết quả xác định vận tốc thủy phân urea của enzyme urease cố định……………………..85 GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, chất lượng cuộc sống con người ngày càng tăng. Do đó, yêu cầu đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng trở nên bức thiết. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường vẫn còn xuất hiện rất nhiều các sản phẩm thực phẩm được bổ sung các chất hóa học gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Một trong những vấn đế bức xúc hiện nay là việc bổ sung urea vào thực phẩm. Chính vì vậy, những nghiên cứu phát triển các phương pháp phân tích urea, đặc biệt là các phương pháp phân tích nhanh đang thu hút sự chú ý rất lớn từ các nhà khoa học. Một trong những phương pháp đang rất được quan tâm đó là việc sử dụng các kit thử cũng như biosensor dùng để phân tích urea bằng phương pháp enzyme. Bên cạnh đó, việc sử dụng urea biosensor trong các phân tích y học là rất phổ biến để đánh giá chức năng của thận...Tuy nhiên, phần lớn urea biosensor sử dụng ở Việt Nam là nhập khẩu. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu cố định enzyme urease trên bề mặt rắn” nhằm tạo tiền đề cho việc nghiên cứu cố định enzyme urease lên sensor. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát xác định phương pháp cố định enzyme urease đồng thời tiến hành khảo sát một số tính chất của enzyme urease cố định. Nội dung nghiên cứu bao gồm: Khảo sát phương pháp cố định enzyme urease. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị. Khảo sát tính chất của enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu được một số kết quả rất khả quan. Chúng tôi hi vọng rằng đề tài này sẽ là bước đầu phát triển cho việc nghiên cứu tạo ra điện cực sinh học trong tương lai ở nước ta.