Luận văn Nghiên cứu xác định các hợp chất phenol trong nước bằng phương pháp sắc kí lỏng – đầu dò điện hóa

PHẦN THỰC NGHIỆM 27 CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM [ 28 - 37 ] 2.1- Dụng cụ, hóa chất, nội dung và phương pháp nghiên cứu. 2.1.1- Dụng cụ. - Máy sắc kí lỏng –đầu dò điện hoá. + Máy LC Waters 1525. + Đầu dò điện hoá ECD Waters 2465 + Cột sắc kí pha đảo Phenominex C18. Kích thước cột: 150 x 2.00 mm, kích thước pha tĩnh: 5 micron. - Cột chiết SPE Strata C18 500 mg, 6 ml. - Máy bơm chân không - Máy siêu âm và đuổi khí. - Hệ thống cô quay. - Erlen 125 ml. - Bình cầu 25,100 ml. - Phểu chiết 2.5 lít. - Becher 50,100,250 ml. - Transferpipette 100 μl. - Pipet 1,2 ,5,10 ml. - Bình định mức 5, 10, 50, 100 ml. - Ong đong. - Thiết bị lọc nước dùng giấy lọc 0.45 µm. 2.1.2- Hoá chất - Acetonitril (HPLC, Mersk, Đức). - Metanol (HPLC, Merck, Đức). - MethylenCloride ( PA, Labscan, Ireland ) - Dietyl Eter (PA, Labscan, Ireland ) - n-Hexan (PA, Labscan, Ireland ) - Acid Acetic, Sodium Acetate (PA, Labscan, Ireland ) - Potasium cloride KCl ( Paranitrophenol, Mersk, Đức ). - Muối Na2SO3 (PA, Labscan, Ireland ) 28 - Khí N2 99% dùng để đuổi dung môi hữu cơ. - Nước cất hai lần. - Đệm Acetate được chuẩn bị bằng cách cân 2.0407 g CH3COONa.3H2O, pha trong 500 ml nước cất 2 lần rồi chỉnh về pH 5 bằng Acid Acetic, sau đó cho qua giấy lọc 0.45 :m. - Dung dịch KCl 0.5 M được chuẩn bị bằng cách cân 18.625 g KCl hòa tan trong 500 ml nước cất 2 lần, sau đó cho qua giấy lọc 0.45 :m. - Các chất chuẩn gốc Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, p-Nitrophenol, 2-Clorophenol, o-Nitrophenol có nồng độ 500 µg/ml được chuẩn bị bằng cách cân một lượng chính xác chất chuẩn rồi hòa tan trong 100 ml hỗn hợp dung môi Nước : Acetonitril ( 1:1 / v:v ). Dung dịch khảo sát được pha lõang từ dung dịch gốc với Nước : Acetonitril ( 1:1 / v:v ) đến nồng độ cần sử dụng. Trong quá trình thực nghiệm, nồng độ ( µg/ml ) các hợp chất Phenol chuẩn được sử dụng là 5.0, 2.0, 1.2, 0.9 … µg/ml. Đây là các nồng độ gần đúng, nồng độ đúng của các hợp chất Phenol được trình bày trong Bảng 2.1. Bảng 2.1: Giá trị nồng độ đúng của các hợp chất Phenol chuẩn. Nồng độ (µg/ml) 5.0 2.0 1.2 0.9 0.6 0.5 0.3 Resorcinol 5.02 2.008 1.2048 0.9036 0.6024 0.502 0.3012 Pyrocatechol 4.96 1.984 1.1904 0.8928 0.5952 0.496 0.2976 Phenol 4.98 1.992 1.1952 0.8964 0.5952 0.498 0.2988 Paranitrophenol 5.07 2.028 1.2168 0.9126 0.6084 0.507 0.33042 2-Clorophenol 5 2 1.2 0.9 0.6 0.5 0.3 Ortonitrophenol 5.13 2.052 1.2312 0.9234 0.6156 0.513 0.3078 29 Nồng độ (µg/ml) 0.1 0.05 0.01 0.005 0.002 0.001 Resorcinol 0.1004 0.0502 0.01004 0.00502 0.002008 0.001004 Pyrocatechol 0.0992 0.0496 0.00992 0.00496 0.001984 0.000992 Phenol 0.0996 0.0498 0.00996 0.00498 0.001992 0.000996 ParaNitroPhenol 0.1014 0.0507 0.01014 0.00507 0.002028 0.001014 2-cloroPhenol 0.1 0.05 0.01 0.005 0.002 0.001 OrtoNitroPhenol 0.1026 0.0513 0.01026 0.00513 0.002052 0.001026 2.1.3- Nội dung nghiên cứu Khảo sát và tối ưu thành phần pha động. Khảo sát và tối ưu hoá các thông số vận hành máy. Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Khảo sát tối ưu quy trình chiết và làm giàu các hợp chất Phenol. Ứng dụng quy trình xác định các hợp chất Phenol trong mẫu nước. 2.1.4- Phương pháp nghiên cứu Nhờ vào hoạt tính điện hoạt của các hợp chất Phenol, phương pháp sắc kí phân bố pha đảo với đầu dò điện hoá sử dụng điện cực Glassy Carbon vừa phát huy được thế mạnh của phương pháp cực phổ và sắc kí lỏng, vừa giảm được tính độc hại của phương pháp cực phổ cổ điển. Ngoài ra phương pháp này còn có ưu điểm so với phương pháp sắc kí khí với đầu dò khối phổ thường được dùng để xác định các hợp chất Phenol là thiết bị dùng để phân tích đơn giản và rẻ tiền hơn. 30 2.2- Kết quả và thảo luận 2.2.1- Phương pháp sắc kí phân bố pha đảo với chế độ đẳng dòng 2.2.1.1- Khảo sát và tối ưu hoá tỉ lệ thành phần pha động Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao theo cơ chế sắc kí phân bố pha đảo. Thời gian lưu của các hợp chất phụ thuộc chủ yếu vào sự tương tác ái dầu giữa mạch carbon của pha tĩnh và dây carbon của chất cần xác định. Thời gian lưu tăng theo tính ái dầu của chất phân tích. Mặt khác, khả năng phân ly của chất phân tích cũng có ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu. Các hợp chất phân ly thành ion sẽ được rửa giải trước các hợp chất trung tính. Do đó, dung dịch nghiên cứu trong phần khảo sát này gồm các hợp chất Phenol có độ phân cực khác nhau như Phenol, p-Nitrophenol, 2,4,6-triclorophenol, 2,3,5,6- Tetraclorophenol. Việc tối ưu hoá thành phần pha động trên cơ sở đảm bảo khả năng tách của mũi Phenol và p-Nitrophenol nhưng thời gian lưu của 2,4,6- Triclorophenol và 2,3,5,6-Tetraclorophenol không quá dài. Thứ tự rửa giải của các hợp chất trên sắc kí đồ và độ chọn lọc của phương pháp sắc kí thay đổi theo thành phần pha động. trong sắc kí phân bố pha đảo, pha động thường là hỗn hợp dung dịch đệm và các dung môi hữu cơ như Acetonitril ( ACN ) hoặc Methanol ( MeOH ). Để tối ưu thành phần pha động, một số hỗn hợp dung môi có thành phần được nêu ở Bảng 2.2 đã được khảo sát. Kết quả khảo sát được biễu diễn trên các Hình 2.1, 2.2, 2.3, 2.4. Bảng 2.2: Thành phần các pha động được khảo sát Thành phần pha động STT Acid Dung môi Tỉ lệ thể tích 1 H2SO4 10 mM MeOH 60:40 (v/v) 2 H2SO4 5 mM MeOH 60:40 (v/v) 3 H2SO4 5 mM ACN 60:40 (v/v) 4 Đệm Acetat pH 4 ACN 55:45 (v/v) 5 Đệm Acetat pH 5 ACN 55:45 (v/v) 6 Đệm Acetat pH 5 ACN: MeOH 55:40:5 (v/v/v) 31 32 Hình 2.1: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l. Mũi 1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Triclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol . Pha động: H2SO4 (ở các nồng độ khác nhau)-MeOH (60:40,v/v). Tốc độ dòng: 0.2ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V. Hình 2.2: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l. Mũi1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Nriclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol. Pha động: H2SO4 5mM-dung môi (MeOH hoặc ACN) (60:40,v/v). Tốc độ dòng: 0.2ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V. 33 Hình 2.3: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l. Mũi1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Triclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol. Pha động: Đệm (ở các pH khác nhau)-ACN (55:45,v/v). Tốc độ dòng: 0.2ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V. Hình 2.4: Sắc ký đồ của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1mg/l. Mũi1: Phenol, 2: p-Nitrophenol, 3: 2,4,6-Triclorophenol, 4: 2,3,5,6-Tetraclorophenol. Pha động: đệm pH5:ACN:MeOH (55:40:5,v/v/v)) . Tốc độ dòng: 0.2ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V. Kết quả khảo sát cho thấy: Khi pha động có thành phần gồm Methanol và H2SO4, nồng độ acid cao hơn có thời gian lưu của các hợp chất Clorophenol dài hơn (> 3000 giây) đồng thời các mũi này bị bành rộng, do đó độ nhạy cũng kém hơn so với kết quả thu được từ pha động có môi trường pH cao (Hình 2.1) Dựa vào kết quả khảo sát trên, pha động có pH cao hơn được chọn. Tuy nhiên các mũi đều có thời gian lưu tương đối dài. Do đó acid H2SO4 có nồng độ 5mM, đệm Acetate ở pH 4, 5 và Acetonitril ( Acetonitril thay cho Methanol để tăng khả năng rửa giải của dung môi pha động do có độ phân cực thấp hơn Methanol ) được chọn cho những khảo sát tiếp theo (Hình 2.1, 2.2, 2.3). Kết quả thực nghiệm cho thấy khả năng tách tốt, thời gian lưu của các mũi ngắn hơn, độ nhạy của tín hiệu thu được tốt với thành phần pha động gồm Acetonitril và đệm Acetate ở pH 5. Tuy nhiên, hai mũi Phenol và p-Nitrophenol bị chập với nhau (Hình 2.3). Do đó, khả năng rửa giải của dung môi pha động cần được giảm lại bằng cách thay một phần Acetonitril bằng Methanol. Bảng 2.2 cho thấy thành phần pha động gồm hỗn hợp dung môi Acetonitril, Methanol và đệm Acetate pH 5 cho kết quả thu được tối ưu. Thời gian lưu của các hợp chất Clorophenol không quá dài, độ nhạy của các mũi vẫn đảm bảo và hai mũi Phenol và p-Nitrophenol tách được với nhau (Hình 2.4). Sau đó, thành phần pha động gồm đệm Acetate pH 5 / Acetonitril / Methanol tiếp tục được tối ưu hoá bằng cách thay đổi tỷ lệ trong hỗn hợp pha động đồng thời tăng số lượng các hợp chất Phenol để đảm bảo dung môi pha động tách tốt các mũi với nhau. Dung dịch nghiên cứu gồm Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, p-Nitrophenol, o-Nitrophenol, 2,4,6-Triclorophenol, 7: 2,3,5,6-Tetraclorophenol với pha động gồm Acetonitril, Methanol và Đệm Acetat pH 5 được khảo sát ở nhiều tỉ lệ khác nhau với độ phân cực tăng dần. Kết quả khảo sát được biểu diễn ở Bảng 2.3 và các Hình 2.5, 2.6, 2.7. 34 35 Bảng 2.3: Tỉ lệ các pha động khảo sát Thành phần pha động (v/v/v) STT Đệm pH 5 ACN MeOH Pha động 1 55 40 5 Pha động 2 55 35 10 Pha động 3 65 25 10 Pha động 4 70 25 5 Với dung môi pha động gồm đệm pH5:ACN:MeOH (55:40:5, v/v/v), các mũi Phenol ra nhanh nhưng hai hợp chất Resorcinol và Pyrocatechol bị chập với nhau, do đó độ phân cực của dung môi pha động cần được tăng lên bằng cách thay một phần Acetonitril bằng Methanol. Khi đó pha động gồm đệm pH5:ACN:MeOH (55:35:10,v/v/v) được khảo sát. Tuy nhiên vẫn không tách được hoàn toàn hai mũi Resorcinol và Pyrocatechol. Kết quả được biễu diễn trên Hình 2.5 Hình 2.5: Sắc ký đồ của hợp chất Phenol 1mg/l. Mũi1: Resorcinol, 2: Pyrocatechol , 3: Phenol, 4: p-Nitrophenol, 5 : o-Nitrophenol, 6: 2,4,6- Triclorophenol, 7: 2,3,5,6-Tetraclorophenol. Pha động (A): đệm pH5:ACN:MeOH (55:40:5, v/v/v), pha động (B): đệm pH5:ACN:MeOH (55:35:10,v/v/v) .Tốc độ dòng: 0.2ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V. 36 Do vậy, độ phân cực của dung môi pha động được tăng lên bằng cách thay thế một phần dung môi Acetonitril bằng đệm Acetate pH 5. Hỗn hợp đệm pH5:ACN:MeOH (65:25:10,v/v/v) được khảo sát. Tuy nhiên hai mũi Resorcinol và Pyrocatechol vẫn chưa tách được với nhau. Tiếp tục thay một phần dung môi Methanol bằng đệm Acetate pH 5, với pha động gồm đệm pH5:ACN:MeOH (70:25:5,v/v/v) các hợp chất Phenol được tách tốt với nhau. Kết quả được biễu diễn trên Hình 2.6 Hình 2.6 : Sắc ký đồ của hợp chất phenol 1mg/l. Mũi1: Resorcinol, 2: Pyrocatechol , 3: Phenol, 4: p-Nitrophenol, 5 : o-Nitrophenol, 6: 2,4,6- Triclorophenol, 7: 2,3,5,6-Tetraclorophenol. Pha động (A): đệm pH5:ACN:MeOH (65:25:10, v/v/v), pha động (B): đệm pH5:ACN:MeOH (70:25:5,v/v/v) .Tốc độ dòng: 0.2ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1,1V. Bảng 2.4 cho thấy hỗn hợp dung môi pha động gồm đệm Acetate pH5:ACN:MeOH ( 70:25:5,v/v/v ) có độ phân giải của các hợp chất Phenol là tốt nhất, các mũi đều tách tốt với nhau ( hai mũi tách tốt khi có độ phân giải lớn hơn 1.2 ). 37 Bảng 2.4: Độ phân giải Rs với các pha động khác nhau RS Chất xác định Pha động 1 Pha động 2 Pha động 3 Pha động 4 Pyrocatechol 0.503 0.516 0.338 1.200 Phenol 1.419 1.487 1.638 2.527 p-nitrophenol 0.749 1.189 1.575 2.164 o-nitrophenol 1.990 3.170 3.191 3.782 2,4,6-triclorophenol 4.139 8.858 11.03 13.34 2,3,5,6-tetraclorophenol 4.016 3.102 3.332 4.461 Hình 2.7: Sắc ký đồ của dung dịch 11 chất phenol nồng độ 0.1 mg/l: Mũi 1: Phenol, 2: 4-Nitrophenol, 3: 2-Nitrophenol, 4: 2-Clorophenol, 5: 2,4-Dinitrophenol, 6: 2,4 Dimetylphenol, 7: 2,4-Diclorophenol, 8: 4-Cloro-3metylphenol, 9: 2,4- Dinitro-3-metylphenol, 10: 2,4,6-Triclorophenol, 11: Pentaclorophenol. Pha động: đệm pH5:ACN:MeOH (70:25:5,v/v/v). Tốc độ dòng: 0.2 ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế +1.1 V. Kết quả thực nghiệm cho thấy thành phần pha động gồm đệm pH5:ACN:MeOH theo tỉ lệ 70:25:5 (v/v/v) là phù hợp nhất. Kết luận trên này được minh chứng bằng sắc ký đồ Hình 2.7 biểu diễn khả năng tách của 11 hợp chất Phenol. Do đó, pha động gồm đệm Acetate pH5:ACN:MeOH theo tỉ lệ 70:25:5 (v/v/v) được chọn làm pha động tối ưu cho tất cả các khảo sát tiếp theo 2.2.1.2- Khảo sát các thông số vận hành máy Theo tài liệu [31,34 ], khi chạy chương trình Gradient dòng, độ ồn của đường nền cao, độ nhạy của các mũi bị giảm dần trong quá trình phân tích và mất nhiều thời gian cho lần chạy tiếp theo. Điều này do một số nguyên nhân sau: Do tốc độ dòng của dung môi pha động nhỏ nên bất kì sự thay đổi nào trong thành phần pha động, dù nhỏ, cũng làm ảnh hưởng đến phản ứng trên bề mặt của điện cực chỉ thị. Khi đó sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định, độ ồn của đường nền và độ nhạy của điện cực chỉ thị. Khi chạy chương trình Gradient dòng với thành phần pha động luôn thay đổi sẽ làm tăng độ ồn, làm giảm độ ổn định của đường nền và độ nhạy của điện cực chỉ thị. Điều này làm ảnh hưởng đến tuổi thọ của đầu dò Điện hoá trong quá trình sử dụng. Để phản ứng trên bề mặt điện cực chỉ thị ổn định sau khi áp thế phải mất từ 90 đến 120 phút trong điều kiện thành phần pha động không đổi hoặc thay đổi rất ít. Trong chương trình Gradient dòng, sau mỗi lần phân tích, thành phần pha động được trả về tỷ lệ ban đầu, khi đó sẽ mất nhiều thời gian cho lần phân tích tiếp theo. Do vậy chúng tôi không áp dụng chế độ Gradient dòng trong các quá trình khảo sát tiếp theo mà chỉ thực hiện với chế độ đẳng dòng. „- Khảo sát tốc độ dòng Sự thay đổi của tốc độ dòng ảnh hưởng đến áp suất áp vào cột, thời gian lưu và bề rộng đáy của mũi sắc kí. Tốc độ dòng nhỏ làm tăng thời gian lưu và bề rộng đáy của mũi sắc kí. Tốc độ dòng lớn làm tăng áp suất trên cột và do đó làm giảm tuổi thọ của cột phân tích. Việc chọn tốc độ dòng thích hợp sẽ giúp tách tốt các chất phân tích trong thời gian tối ưu và tăng tuổi thọ của cột. Kết quả khảo sát tốc độ 38 39 dòng trên Resorcinol nồng độ 1 mg/l được biểu diễn trên Bảng 2.5, Hình 2.8 và Hình 2.9. Bảng 2.5: Kết quả khảo sát tốc độ dòng trên Resorcinol nồng độ 1 mg/l Tốc độ dòng ( ml/phút) Thời gian lưu ( giây ) Bề rộng đáy ( giây ) Chiều cao mũi (Vôn ) Diện tích mũi ( ĐVDT ) Ap suất cột ( Psi ) 0.05 843 306 2.29 105.30 400 0.1 425 152 2.26 57.55 647 0.15 278 124 2.14 39.97 882 0.2 199 85 2.06 30.06 1118 Hình 2.8 0 200 400 600 800 1000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 tốc độ dòng (ml/phút) th ời g ia n lư u (g iâ y) : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ dòng lên thời gian lưu của mũi Resorcinol nồng độ 1 mg/l. Pha động: đệm Acetate pH 5 / ACN / MeOH ( 70/25/5, v/v/v ). Điện cực Glassy carbon tại thế + 1.1 ( V ). 0100 200 300 400 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 tốc độ dòng (ml/phút) bề rộ ng đá y (g iâ y) 40 Hình 2.9: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ dòng lên bề rộng đáy của mũi Resorcinol nồng độ 1 mg/l. Pha động: đệm Acetate pH 5 / ACN / MeOH ( 70/25/5, v/v/v ). Điện cực Glassy carbon tại thế + 1.1 ( V ). Kết luận: Tăng tốc độ dòng làm giảm thời gian lưu và độ bành rộng của peak đồng thời làm tăng áp suất trên cột. Chọn tốc độ dòng tối ưu ở 0.2 ml/phút. Đây cũng là tốc độ dòng tối đa của nhà sản xuất cho phép khi sử dụng cột. „- Khảo sát thế điện cực Glassy carbon Giá trị của thế cao nhất cho phép sử dụng trên điện cực Glassy carbon là 1.3V. Bên cạnh đó, giá trị thế sử dụng có ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy của phép xác định. Giá trị thế thấp sẽ làm giảm độ nhạy do cường độ tín hiệu đo giảm nhưng nếu thế sử dụng quá cao sẽ làm tăng tín hiệu nền và dẫn tới tỉ lệ S/N giảm. Kết quả khoảng thế điện cực khảo sát từ 0.9V đến 1.1V cho các hợp chất Phenol nồng độ 1mg/l được biểu diễn ở Bảng 2.6, Hình 2.10. 41 Bảng 2.6: Kết quả khảo sát khoảng thế áp đến diện tích của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1 mg/l. Tên chất 0.9 V 1.0 V 1.05 V 1.1 V Resorcinol 33.16 50.39 61.28 70.00 Pyrocatechol 52.21 55.12 55.35 55.12 Phenol 41.59 65.64 77.68 83.25 P-Nitrophenol 1.84 26.44 39.81 42.70 O-Nitrophenol 6.23 34.25 46.16 51.54 Hình 2.10 0 20 40 60 80 100 0.5 0.7 0.9 1.1 thế áp (V) di ện tí ch p ea k (1) Resorcinol (2) Pyrocatechol (3) Phenol (4) p-Nitrophenol (5) o-Nitrophenol : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thế áp đến diện tích mũi của các hợp chất Phenol ở nồng độ 1 mg/l. Pha động: đệm Acetate pH 5 / ACN / MeOH ( 70/25/5, v/v/v ). Tốc độ dòng 0.2 ml/phút. Kết luận: Từ kết quả thu được, ta thấy các hợp chất Phenol có diện tích mũi cao nhất ở thế áp +1.1V. Do đó +1.1V được chọn làm thế áp tối ưu cho các khảo sát tiếp theo. 42 2.2.1.3- Định danh các hợp chất dẫn xuất họ Phenol trên sắc kí đồ Các hợp chất dẫn xuất họ Phenol được khảo sát gồm: Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, Paranitrophenol, 2-Clorophenol, Ortonitrophenol. Các hợp chất Phenol này được tiêm từng chất riêng biệt ở nồng độ 0.1 µg/ml để xác định vị trí và thời gian lưu trên sắc kí đồ. Quá trình được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày trên Hình 2.11 và Bảng 2.7. Hình 2.11: Sắc kí đồ của hỗn hợp gồm 6 hợp chất Phenol và dẫn xuất ở nồng độ 0.1 µg/ml. Mũi 1: Resorcinol, 2: Pyrocatechol, 3: Phenol, 4: Paranitrophenol, 5: 2-Clorophenol, 6: Ortonitrophenol. Thành phần pha động chạy đẳng dòng ACN/MeOH/Đệm Acetate pH 5 ( 25/5/70, v/v/v ). Tốc độ dòng 0.2 ml/phút. Điện cực Glassy carbon tại thế 1.1 (V). Lượng mẫu tiêm 20 µl. Bảng 2.7: Vị trí và thời gian lưu của các hợp chất Phenol trên sắc kí đồ Thứ tự mũi trên sắc kí đồ Tên chất Thời gian lưu ( phút ) 1 Resorcinol 3.81 ± 0.17 2 Pyrocatechol 4.49 ± 0.11 3 Phenol 7.42 ± 0.19 4 p-Nitrophenol 11.32 ± 0.22 5 2-Clorophenol 15.41 ± 0.18 6 o-Nitrophenol 16.87 ± 0.20 2.2.1.4- Khảo sát độ lặp lại của kết quả phân tích Trong sắc kí lỏng, vòng Loop tiêm mẫu được thiết kế đặc biệt, cho phép thể tích mẫu trong mỗi lần tiêm có độ lặp lại cao, do đó không cần dùng chất nội chuẩn trong quá trình dựng đường chuẩn cũng như quá trình khảo sát xác định các chất. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ lặp lại của kết quả phân tích như quy trình chuẩn bị mẫu, tốc độ dòng của dung môi pha động, cột, đầu dò …. Do vậy, độ lặp lại của kết quả phân tích cần được khảo sát để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.. Cách thực hiện độ lặp lại của kết quả phân tích như sau: ba hỗn hợp các hợp chất Phenol gồm 6 chất: Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, Paranitrophenol, 2- Clorophenol, Ortonitrophenol ở nồng độ 0.1 µg/ml và 0.5 µg/ml được tiêm vào cột với lượng mẫu tiêm là 20 µl. Kết quả được trình bày trên Bảng 2.8. Bảng 2.8: Độ lặp lại kết quả phân tích ở nồng độ là 0.1 µg/ml và 0.5 µg/ml. Diện tích mũi (Nồng độ 0.1 µg/ml) Tên chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Diện tích mũi trung bình Độ lệch ( % ) Resorcinol 1141154 1118025 1110119 1123099 1.43 Pyrocatechol 1867027 1833210 1819154 1839717 1.33 Phenol 2010999 2032905 1991007 2011637 1.04 p-Nitrophenol 2001219 2031180 1981250 2004549 1.25 2-Clorophenol 2330167 2380154 2390124 2366815 1.36 o-Nitrophenol 2316815 2356722 2286800 2320112 1.51 43 Kết quả được trình bày trên Bảng 2.8 cho thấy độ lặp lại của kết quả phân tích tốt với độ lệch nhỏ hơn 10 % . 2.2.1.5- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn „- Đường chuẩn Đường chuẩn được xây dựng cho hỗn hợp các hợp chất Phenol gồm 6 chất: Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, Paranitrophenol, 2-Clorophenol, Ortonitrophenol. Đường chuẩn được chuẩn bị ở nồng độ từ 0.001 µg/ml đến 5 µg/ml. Số liệu về nồng độ và diện tích được trình bày trên Bảng 2.9. Ơ nồng độ nhỏ nhất là 0.001 µg/ml không xuất hiện mũi của các hợp chất Phenol. Bảng 2. Diện tích mũi ( Nồng độ 0.5 µg/ml ) Tên chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Diện tích mũi trung bình Độ lệch ( % ) Resorcinol 9156617 8936025 9251253 9114631 1.77 Pyrocatechol 10366546 10093657 10623156 10361119 2.56 Phenol 9394568 9021356 9456321 9290748 2.53 p-Nitrophenol 10584688 10123654 9985362 10231235 3.06 2-Clorophenol 10436816 10063595 9962459 10154295 2.46 o-Nitrophenol 10366844 9932652 9732659 10010718 3.24 9: Số liệu diện tích và nồng độ quá trình dựng đường chuẩn của hỗn hợp gồm 6 hợp chất Phenol và dẫn xuất: Resorcinol, Pyrocatechol, Phenol, Paranitrophenol, 2-Clorophenol, Ortonitrophenol. Nồng độ (µg/ml) 0.005 0.01 0.05 0.1 0.3 Resorcinol 106