Mối liên quan giữa đột biến gen ATP7B với Ceruloplasmin huyết thanh và đồng niệu 24 giờ ở bệnh nhân Wilson

38 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VỚI CERULOPLASMIN HUYẾT THANH VÀ ĐỒNG NIỆU 24 GIỜ Ở BỆNH NHÂN WILSON Đỗ Thanh Hương, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Văn Liệu, Trần Vân Khánh Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát hiện mối liên quan giữa đột biến gen ATP7B với ceruloplasmin huyết thanh và đồng niệu 24 giờ ở bệnh Wilson. Có 44 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bệnh Wilson theo tiêu chuẩn của Ferenci mang đột biến gen được lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen được sử dụng để xác định đột biến trên gen ATP7B. Nghiên cứu đã phát hiện được bệnh nhân Wilson mang nhiều hơn 2 alen đột biến và mang đột biến dạng vô nghĩa/ lệch khung trên gen ATP7B có nồng độ ceruloplasmin huyết thanh thấp và đồng niệu 24 giờ cao hơn nhóm mang 1 alen đột biến và nhóm mang dạng đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR. Từ khóa: Bệnh Wilson, gen ATP7B, đột biến gen, alen đột biến I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Wilson được biết đến là bệnh thoái hóa gan - nhân đậu, được tác giả Kinnear Wilson mô tả lần đầu tiên vào năm 1912 [1]. Cho đến nay, bệnh được phát hiện ở hầu hết các quốc gia và các chủng tộc trên thế giới với tỷ lệ mắc là 1/30.000 trẻ sinh ra. Đây là bệnh di truyền, đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường 13q14.3, mã hóa gen ATP7B gây thiếu hụt enzyme ATPase typ P (P-ATPase) [2]. Gen ATP7B gồm 21 exon chiều dài khoảng 80kb, mã hóa cho phân tử protein 1465 acid amin. Gen này có vai trò điều hòa quá trình hấp thu, phân bố và thải trừ đồng trong cơ thể. Khi đột biến gen xảy ra sẽ gây rối loạn quá trình chuyển hóa đồng, đặc biệt là giảm bài tiết đồng qua đường mật. Lượng đồng ứ lại trong cơ thể sẽ lắng đọng dần trong các tổ chức: gan, não (chủ yếu ở nhân xám trung ương), mắt, da, thận, xương... và gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng. Phân tích mối liên quan giữa kiểu gen ATP7B và sự biến đổi các chỉ số sinh học giúp bác sỹ lâm sàng tiên lượng, chẩn đoán và điều trị sớm các thể bệnh Wilson. Ở Việt Nam, lần đầu tiên có hai trường hợp bệnh nhân bị bệnh Wilson được phát hiện mang đột biến gen Arg778Leu vào năm 2010 [3]. Các nghiên cứu sau đó tiếp tục xác định đột biến ở một số vùng trọng điểm và hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen ATP7B [4; 5]. Như vậy, số lượng nghiên cứu đột biến gen ATP7B ở Việt Nam còn hạn chế và chưa có nghiên cứu đầy đủ về mối tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh. Do vậy, đề tài tiến hành nhằm tìm mối liên quan giữa đột biến gen ATP7B với nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và đồng niệu 24 giờ ở bệnh nhân Wilson. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Địa chỉ liên hệ: Đỗ Thanh Hương - Bộ môn Nhi - Trường Đại học Y Hà Nội Email: dothanhhuong@hmu.edu.vn Ngày nhận: 27/7/2018 Ngày được chấp thuận: 04/9/2018 TCNCYH 115 (6) - 2018 39 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 44 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bệnh Wilson theo thang điểm Ferenci đều có tổng số điểm WD ≥ 4, với biểu hiện tăng enzym gan (AST và ALT ≥ 60 UI/l), tăng lượng đồng trong nước tiểu 24 giờ (≥ 100µg/ngày), ceruloplasmin huyết thanh giảm (< 20mg/dl), có vòng Kayser-Fleischer và phân loại thể lâm sàng theo tiêu chuẩn của Hội Gan Mật quốc tế năm 2003 [6; 7]. Các bệnh nhân này được điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Nhi trung ương. 2. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9 năm 2012 đến tháng 9 năm 2015. 3. Phương pháp 3.1. Định lượng Cerulopasmin huyết thanh - Lấy huyết thanh chống đông bằng EDTA. - Sử dụng phương pháp miễn dịch đo độ đục trên máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800, tại Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương. 3.2. Định lượng đồng niệu 24 giờ - Lấy mẫu nước tiểu 24 giờ. - Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng là graphit (GF - AAS) trên máy tự động GFA - 7000A, tại khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi Trung ương. 3. 3. Quy trình phân tích gen ATP7B Thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần bằng phenol-chloroform-isopropanol (25: 24: 1). Kỹ thuật giải trình tự gen: Toàn bộ 21 exon của gen ATP7B được khuếch đại với các cặp mồi đặc hiệu [2]. Các sản phẩm PCR sẽ được tiến hành giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI. Các gen đột biến được so sánh trên ngân hàng gen: DNA (NG _ 008806) và mRNA (NM _ 000053.3). 4. Xử lý số liệu Tính chỉ số tương quan r bằng phương pháp Kendall, phân tích mối tương quan bằng test ANOVA (phần mềm SPSS 16.0). 4. Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ 1. Nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng niệu 24 giờ và số alen đột biến trên gen ATP7B Trong nghiên cứu này, 44 bệnh nhân Wilson mang đột biến, chia thành 4 nhóm: 5 bệnh nhân mang 1 alen đột biến; 25 bệnh nhân mang 2 alen đột biến; 7 bệnh nhân mang 3 alen đột biến và 7 bệnh nhân mang 4 alen đột biến. 1.1. Mối tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và số alen đột biến 40 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và số alen đột biến Kết quả về phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và số alen đột biến cho thấy, nhóm bệnh nhân mang 4 alen đột biến có nồng độ ceruloplasmin huyết thanh trung bình thấp nhất. 1.2. Mối tương quan giữa nồng độ đồng niệu 24 giờ và số alen đột biến Hình 2. Phân bố nồng độ đồng niệu 24 giờ và số alen đột biến Kết quả ở hình 2 cho thấy, nhóm bệnh nhân mang 4 alen đột biến có hàm lượng đồng trong nước tiểu cao nhất, nhóm mang 1 alen đột biến có hàm lượng đồng thấp nhất. 2. Nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến gen ATP7B Nhóm nghiên cứu gồm 44 bệnh nhân, chia thành 3 nhóm: nhóm 1 có 23 bệnh nhân không mang alen đột biến vô nghĩa/lệch khung (chỉ mang đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR), nhóm 2 có 10 bệnh nhân mang 1 alen đột biến vô nghĩa/lệch khung và nhóm 3 có 11 bệnh nhân mang 2 alen đột biến vô nghĩa/lệch khung. 1.2. Mối tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng đột biến TCNCYH 115 (6) - 2018 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 3. Phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng đột biến Nồng độ ceruloplasmin huyết thanh trung bình ở nhóm mang 2 alen đột biến vô nghĩa/ lệch khung thấp nhất, tiếp theo là nhóm mang 1 alen đột biến vô nghĩa/lệch khung và nhóm đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5' UTR. 2.2. Mối tương quan giữa đồng trong nước tiểu 24 giờ và dạng đột biến Hình 4. Phân bố đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến Kết quả về phân bố đồng niệu 24 giờ với các dạng đột biến gen cho thấy hàm lượng đồng trong nước tiểu 24 giờ ở nhóm mang alen đột biến dạng vô nghĩa/lệch khung cao hơn nhóm mang các alen đột biến khác. Hình ảnh minh họa bệnh nhân có đột biến mới thêm nucleotid: Người bình thường Bệnh nhân W37.00 Hình 5. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân mã W37.00 Kết quả ở hình 5 cho thấy, bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid T tại vị trí 2712-2713, đột biến này đã tạo nên mã kết thúc sớm ở vị trí acid amin số 905. IV. BÀN LUẬN Kết quả từ hình 1 cho thấy nồng độ ceruloplasmin huyết thanh trung bình khác nhau giữa các nhóm bệnh nhân: nhóm bệnh nhân mang 4 alen đột biến có nồng độ ceruloplasmin trung bình thấp nhất; nhóm mang 2 alen đột biến có nồng độ ceruloplasmin trung bình cao nhất. Nghĩa là nhóm bệnh nhân mang nhiều alen đột biến có nồng độ ceruloplasmin trong huyết thanh thấp hơn nhóm mang ít alen đột biến. Điều này phù hợp về đặc điểm sinh học phân tử: sự xuất hiện càng nhiều các biến dị/đột biến trên gen ATP7B thì cấu trúc và tính chất của protein 42 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC càng thay đổi, gây ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển đồng. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm bệnh nhân mang 4 alen đột biến với các nhóm bệnh nhân mang 1 alen, 2 alen và 3 alen đột biến (với p lần lượt là 0,002; 0,001 và 0,001). Tác giả Hyung - Doo Park (2010), nghiên cứu 71 bệnh nhân thấy rằng có mối tương quan nghịch có ý nghĩa thống kê giữa nồng độ ceruloplasmin và số alen đột biến [8]. Như vậy, bệnh nhân càng mang nhiều alen đột biến thì quá trình chuyển hóa đồng trong cơ thể càng giảm làm cho nồng độ ceruloplasmin huyết thanh càng giảm và lượng đồng tích lũy trong cơ thể càng tăng. Nồng độ đồng niệu trong nước tiểu 24 giờ trung bình tỷ lệ thuận với số alen đột biến: nhóm mang 1 alen đột biến có nồng độ đồng thấp nhất; nhóm mang 4 alen đột biến có nồng độ đồng cao nhất (hình 2). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm mang 1 alen đột biến và 3 alen đột biến (p = 0,035); nhóm mang 1 alen đột biến và 4 alen đột biến (p < 0,001); nhóm mang 2 alen đột biến và 4 alen đột biến (p = 0,001); nhóm mang 2 alen đột biến và nhóm mang 3 alen đột biến (p = 0,02) (hình 2). So sánh nồng độ đồng trong nước tiểu 24h của các bệnh nhân Wilson Hàn Quốc ở các nhóm mang các alen đột biến khác nhau cũng cho kết quả: bệnh nhân mang 2 alen đột biến có nồng độ đồng niệu cao nhất, sau đó là nhóm mang 1 alen đột biến và nhóm không mang alen đột biến [8]. Như vậy, bệnh nhân càng mang nhiều alen đột biến thì nồng độ đồng trong nước tiểu 24 giờ càng cao. Hình 3 cho thấy nhóm bệnh nhân mang đột biến vô nghĩa/lệch khung có nồng độ ceruloplasmin huyết thanh thấp hơn nhóm bệnh nhân mang các dạng đột biến khác và nhóm mang 2 alen đột biến vô nghĩa/lệch khung có nồng độ ceruloplasmin thấp hơn nhóm mang 1 alen đột biến vô nghĩa, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm. Nghiên cứu nhóm bệnh nhi bị bệnh Wilson ở Ý cho kết quả: nhóm bệnh nhân mang 2 alen đột biến vô nghĩa/lệch khung có nồng độ ceruloplasmin huyết thanh trung bình thấp hơn nhóm mang đột biến sai nghĩa [9]. Nghiên cứu khác của Gromadzka G. ở Ba Lan cũng thấy sự khác nhau giữa các dạng đột biến: nhóm bệnh nhân mang 2 alen đột biến dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã có nồng độ ceruloplasmin thấp hơn nhóm mang 1 alen đột biến dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã, nồng độ ceruloplasmin cao nhất ở nhóm mang alen đột biến sai nghĩa [10]. Điều này phù hợp về đặc điểm sinh học phân tử: đột biến vô nghĩa/ lệch khung trên gen ATP7B là đột biến nặng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức năng vận chuyển đồng. Nồng độ ceruloplasmin trong máu giảm làm tăng nồng độ đồng tự do trong huyết thanh và lắng đọng đồng tại các cơ quan đích gây nên các biểu hiện lâm sàng của bệnh Wilson. Khi so sánh tương quan nồng độ đồng niệu 24 giờ giữa các nhóm đột biến, chỉ có nhóm mang 2 alen đột biến dạng vô nghĩa/ lệch khung với nhóm mang đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR có ý nghĩa thống kê với p = 0,01 (hình 4). Tác giả Gromadzka G. nghiên cứu ở Ba Lan cũng thấy nồng đồng trong nước tiểu 24 giờ khác nhau giữa các dạng đột biến: nhóm bệnh nhân mang 2 alen đột biến dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã có nồng độ đồng cao hơn nhóm mang 1 alen đột biến dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã, nồng độ đồng thấp nhất ở nhóm mang alen đột biến sai nghĩa [10]. Như đã đề cập, bệnh do sự bất TCNCYH 115 (6) - 2018 43 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thường của enzyme typ P- ATPase. Đây là 1 protein vận chuyển đồng từ gan tới các cơ quan và đóng vai trò trong việc đào thải đồng ra khỏi cơ thể chủ yếu qua đường mật. Khi bệnh nhân mang đột biến vô nghĩa/lệch khung sẽ tạo mã kết thúc sớm làm protein bị cắt ngắn sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức năng chuyển hóa đồng. Lượng đồng không được chuyển hóa, không được đào thải ra ngoài qua đường mật sẽ ứ đọng ở gan, đồng tự do tăng lưu thông trong máu và tăng đào thải qua nước tiểu. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã phát hiện được bệnh nhân Wilson mang nhiều hơn 2 alen đột biến và đột biến dạng vô nghĩa/ lệch khung trên gen ATP7B có nồng độ ceruloplasmin huyết thanh thấp và đồng niệu 24 giờ cao hơn nhóm mang 1 alen đột biến và nhóm mang dạng đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR. Lời cảm ơn Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson” và sự giúp đỡ của các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Wilson SAK (1912), Progressive len- ticular degeneration: a familial nervous dis- ease associated with cirrhosis of the liver. Brain, 34, 295 – 507. 2. Bull PC, Thomas G R, Forbes J et al (1993). The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes disease gene. Nature Genet, 5, 327 - 337. 3. Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010). Đột biến gen R778L ở bệnh nhân Wil- son Việt Nam. Tạp chí Nhi khoa, 3, 231 - 235. 4. Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011). Xây dựng quy trình xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 74(3), 26 - 29. 5. Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Phương Mai và cộng sự (2013). Xác định đột biến gen ATP7B trên vùng hot-spots ở bệnh nhân Wilson. Tạp chí Y học Việt Nam, 407(2), 132 - 135. 6. Peter Ferenci (2006). Regional distribu- tion of mutations of the ATP7B gene in pa- tients with Wilson disease: impact on genetic testing. Hum Genet, 120, 151 – 159. 7. Ferenci P, Caca K, Loudianos G, Mieli -Vergani G, Tanner S, Sternlieb I et al (2003). Diagnosis and phenotypic classifica- tion of Wilson disease. Liver International, 23, 139 - 142. 8. Huyng-Doo Park, Huyn Kyung Park (2010). Association of ATP7B mutation detec- tion rate with biochemical characteristics in Korean patients with Wilson disease. Annals of clinical laboratory science, 40(1), 15 - 19. 9. Emanuele Nicastro (2009). Genotype- phenotype correlation in Italian children with Wilson's disease. Hepatology, 50, 555 - 561. 10. Gromadzka G, Schmidt HJ, Gens- chel J et al (2005). Frameshift and nonsense mutations in the gene for ATP7B are associa- ted with severe impairment of cooper metabo- lism and with an early clinical manifestation of Wilson's disease. Clinical Genetics, 68, 524 - 532. 44 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary GENOTYPE AND SERUM CERULOPLASMIN-URINARY COPPER 24-HOUR CORRELATION IN WILSON DISEASE PATIENTS The study was performed in order to identify the correlation between genotype and serum ceruloplasmin -urinary copper 24-hour in Vietnamese patients diagnosed with Wilson disease. Fourty four patients diagnosed with Wilson disease based on Ferenci’s criteria DNA were included in this study; samples from these patients were analyzed by direct sequencing to identify ATP7B mutation. The results: Patients with more than 2 mutant alleles have lower serum ceruloplasmin and higher urinary copper 24-hour concentration than patients with 1 mutant allele. Patients with 2 nonsense/frameshift mutant alleles have lower serum ceruloplasmin concentration than patients with 1 nonsense/frameshift mutant allele or missense/5'UTR regional mutant alleles. Patients with 2 nonsense/frameshift mutant alleles have higher urinary copper 24-hour concentra- tion than patients with 1 nonsense/frameshift mutant allele or missense/5'UTR regional mutant alleles. Keywords: Wilson disease, ATP7B gene, mutation, mutant allele