Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng protein, phổ điện di protein của dòng callus mía (saccharum officinarum l.) chịu hạn

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 29, 2005 NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HÀM LƯỢNG PROTEIN, PHỔ ĐIỆN DI PROTEIN CỦA DÒNG CALLUS MÍA (SACCHARUM OFFICINARUM L.) CHỊU HẠN Ngô Thị Minh Thu, Hoàng Văn Hạnh, Trương Thị Bích Phượng Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế I. ĐẶT VẤN ĐỀ Mía là một loại cây công nghiệp ngắn ngày, có vị trí kinh tế ngày càng quan trọng ở nước ta. Ở một số vùng của Việt Nam, cây mía đã trở thành một trong những nguồn thu nhập chủ yếu của người dân. Miền Trung Việt Nam là một vùng nông nghiệp đa dạng, có tiềm năng lớn trong sản xuất nông nghiệp, nhưng sản lượng lương thực thực phẩm ở vùng này chưa cao do điều kiện khí hậu khắc nghiệt, hạn hán kéo dài vào mùa khô. Đặc biệt đối với mía, điều kiện khô hạn, thiếu nước, đất xấu... làm mía sinh trưởng chậm, thân mía nhỏ, lóng ngắn, năng suất rất thấp. Vì vậy việc chọn tạo các giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, cho năng suất cao, phẩm chất tốt là việc vô cùng quan trọng, cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Trong phạm vi bài báo này chúng tôi chỉ xin được trình bày những kết quả nghiên cứu thu được về sự biến đổi hàm lượng protein, phổ điện di protein và bước đầu tìm hiểu bản chất của việc xuất hiện băng protein mới ở callus mía xử lý stress hạn. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là hai mía giống ROC 10 và ROC 16 của cây mía đường (Saccharum officinarum L.) [2]. - Giống mía ROC 10 có nguồn gốc từ Đài Loan. Giống này có khả năng thâm canh cao, có tính thích ứng rộng, khả năng nảy mầm và tái sinh khỏe, có năng suất bình quân đạt 70 tấn/ha và hàm lượng đường cao (13-15%). Nếu được thâm canh tốt có thể đạt năng suất 120-125 tấn/ha. Giống mía này đã được công nhận là giống quốc gia và hiện tại đây là giống mía có diện tích lớn nhất trong vùng mía nguyên liệu của tất cả nhà máy đường công nghiệp ở nước ta hiện nay [1]. - Giống mía ROC 16 có nguồn gốc từ Đài Loan. Đặc điểm của giống này là nảy mầm và đẻ nhánh mạnh, tập trung, tốc độ vươn lóng cao, độ đồng đều khá, không trổ cờ, chịu úng tốt, có năng suất trung bình cao (60 tấn/ha) và hàm lượng đường cao. Giống mía này đã được công nhận là giống quốc gia và áp dụng phổ biến ở nhiều địa phương trên cả nước [2]. 2. Phương pháp nghiên cứu: 2.1. Xử lý stress nước cho callus Nuôi cấy các mô lá non của mía trên môi trường tạo callus gồm có môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung saccharose 30 g/l, 2,4-D 3,0 mg/l, kinetin 0,1 mg/l, agar 8 g/l và pH 5,8. Các callus chọn lọc được trên môi trường xử lý 3, 6% mannitol được tiếp tục xử lý mannitol ở các nồng độ 9, 12 và 15% mannitol ở các khoảng thời gian 7, 14, 21 và 28 ngày xử lý. Các callus sống sót sẽ được phân tích các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh chứng tỏ cho khả năng chịu hạn của callus. 2.2. Xác định hàm lượng protein và phổ điện di protein 2.2.1. Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng cách đo độ hấp thụ trên máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm (mẫu trắng là đệm PBS pH 7,4). Nồng độ protein hòa tan tổng số tính theo công thức [5]: PC (mg/ml) = 1,5 x A280 - 0,75 x A260 Trong đó PC : nồng độ protein; A280: độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm; A260: độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm. 2.2.2. Điện di protein Protein sau khi xác định hàm lượng sẽ được điện di SDS trên gel polyacrylamide 12%. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Hàm lượng protein tổng số của callus mía xử lý stress hạn: Phản ứng thông thường của thực vật khi chịu tác động bất lợi của ngoại cảnh là biến đổi hàm lượng và thành phần của protein. Hàm lượng protein và thành phần chất lượng của chúng đã ảnh hưởng mạnh mẽ lên tính chịu hạn của cây, lượng acid nucleic cao, đặc biệt là RNA tạo khả năng tổng hợp protein và điều đó làm tăng tính chống chịu của cây đối với hạn. Purin và primidin ở hàm lượng cao cũng có tác dụng kích thích sự tổng hợp acid nucleic ở trong cây chịu hạn, chúng ức chế hoạt tính của enzyme RNase để tăng quá trình tổng hợp protein [4]. Ở các dòng mía xử lý stress hạn, hàm lượng protein thay đổi khác nhau và không theo quy luật. Điều này liên quan đến tính đa dạng và không định hướng của các biến dị di truyền xuất hiện trong qúa trình nuôi cấy mô. Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy callus giống ROC 10 xử lý stress hạn hàm lượng protein tổng số tăng dần khi tăng nồng độ mannitol từ 9 đến 12% và hàm lượng protein giảm khi xử lý callus trên môi trường bổ sung 15% mannitol trong khoảng thời gian xử lý 7-28 ngày. Hàm lượng protein đạt giá trị cao nhất là 48,33 mg/g TLT ở môi trường bổ sung 12% mannitol sau 7 ngày xử lý và giá trị thấp nhất là 19,51 mg/g TLT trên môi trường bổ sung 15% mannitol sau 14 ngày xử lý. Biểu đồ 1: Sự thay đổi hàm lượng protein hòa tan của callus mía giống ROC 10 trên môi trường xử lý stress hạn Đối với giống ROC 16, hàm lượng protein tăng so với đối chứng khi callus được xử lý stress trên môi trường bổ sung từ 9-15% mannitol trong 7-28 ngày xử lý. Hàm lượng protein đạt giá trị cao nhất là 39,11 mg/g TLT ở môi trường bổ sung 12% mannitol sau 21 ngày xử lý và giá trị thấp nhất là 12,71 mg/g TLT trên môi trường bổ sung 9% mannitol sau 7 ngày xử lí. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Lộc (1992), ở những dòng thuốc lá chọn lọc chịu muối và mất nước, hàm lượng các protein tan trong muối đã tăng lên từ 1,41-1,52 lần theo trọng lượng khô, ngược lại hàm lượng các protein thuộc nhóm albumin lại giảm từ 0,81-0,96 lần so với đối chứng [4]. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nhân (2003) cho thấy, hàm lượng protein tổng số biến động rất lớn trong callus mía bị xử lý mannitol. Biểu đồ 2: Sự thay đổi hàm lượng protein hòa tan của callus mía giống ROC 16 trên môi trường xử lý stress hạn Callus xử lý 9% mannitol, hàm lượng protein tổng số thấp hơn đối chứng sau tuần xử lý đầu tiên và cao hơn trong các khoảng thời gian xử lý tiếp theo và đạt giá trị cực đại 42,953 mg/g TLT [6]. Như vậy, callus khi chuyển lên môi trường có nồng độ mannitol cao, thế năng nước đã chênh lệch một cách đột ngột, thay đổi đó đã ảnh hưởng sâu sắc đến trạng thái và độ hoạt động các hệ enzyme trong tế bào [8]. 2. Điện di protein: Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá gián tiếp dò tìm bộ gen thông qua kĩ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzyme và protein. Dấu phân tử phát hiện bằng kỹ thuật điện di là độc lập với hình thái và sinh lý của giống nên nó có nhiều tiện lợi hơn các phương pháp xác định bằng hình thái của giống và loài [9]. Protein thường được nghiên cứu để đánh giá chất lượng cây trồng như gạo, đậu, bắp,... Ngoài ra thông qua phân tích protein còn có thể đánh giá tính chịu stress môi trường (Fan Shuguo, 1999) [3]. Đối với giống ROC 10 xử lý stress hạn ở khoảng nồng độ 12-15% mannitol, phổ điện di của mẫu xử lý stress hạn và đối chứng không có sự khác biệt nhiều. Trong khoảng 30-45 kDa, ở callus được xử lý 12-15% mannitol có sự xuất hiện của một băng protein mới. Ngoài ra, ở callus xử lý stress hạn có xuất hiện một băng protein có trọng lượng phân tử khoảng 66-97 kDa và hai băng protein có trọng lượng phân tử khoảng 20,1-30 kDa bắt màu đậm hơn so với đối chứng. Qua hình 2 chúng tôi nhận thấy, có sự khác biệt rất rõ giữa phổ điện di của callus mía giống ROC 16 xử lý stress hạn ở nồng độ 12-15% mannitol với callus đối chứng. Đánh giá phổ điện di của giống ROC 16 xử lý stress hạn cho thấy xuất hiện 4 băng protein mới và có sự thay đổi về hàm lượng protein thể hiện ở mức độ đậm nhạt của cả 4 băng. Trên tất cả các mẫu xử lý stress hạn đều thấy xuất hiện 3 băng protein mới có trọng lượng phân tử khoảng 97 kDa, 45-66 kDa, 30-45 kDa, trong đó băng protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 30-45 kDa xuất hiện đậm hơn ở callus xử lý 15% mannitol. Bên cạnh đó, ở callus bị xử lý 15% mannitol có sự xuất hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 30-45 kDa. Các callus bị xử lý 12% và 15% mannitol có xuất hiện 3 băng có trọng lượng phân tử khoảng 66-97 kDa, 45-66 kDa, 45 kDa bắt màu đậm hơn so với đối chứng. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây. Chua và cs. (1998) đã phát hiện 4 protein mới được tổng hợp trong mô callus lúa và 7 protein có hàm lượng tăng lên 5-10 lần dưới tác dụng của stress nước [4]. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nhân (2003) cho thấy, khi xử lý stress hạn callus mía ở nồng độ 6% và 9% mannitol không thấy xuất hiện các protein mới, tuy nhiên có sự khác nhau về hàm lượng protein của các dòng xử lý hạn so với đối chứng, thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng trên gel [6]. Hình 1: Phổ điện di của callus mía giống ROC10 xử lý stress hạn Hình 2: Phổ điện di của callus mía giống ROC16 xử lý stress hạn Chú thích: A1, A2: callus mía xử lý trên môi trường mannitol 12%; B1, B2, B3: callus mía xử lý trên môi trường mannitol 15%; M: protein maker, DC: đối chứng : vị trí xuất hiện các protein mới : vị trí hàm lượng protein thay đổi so với đối chứng Theo Trương Thị Bích Phượng (2004) ngoài sự khác nhau về thành phần protein còn có sự khác nhau về hàm lượng protein của các dòng chịu hạn so với giống gốc, thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng trên gel. Như vậy có thể cho rằng các gene liên quan đến tính chống chịu tồn tại trong các dòng lúa chọn lọc in vitro và đã hoạt hóa khi gặp điều kiện bất lợi của môi trường, thể hiện thành protein mới [7]. 4. KẾT LUẬN 1. Hàm lượng protein của callus giống ROC 10 và ROC 16 có sự thay đổi khi được xử lý bằng mannitol nồng độ 9-15% thời gian 7-28 ngày nuôi cấy. Nhìn chung callus mía bị xử lý stress hạn có hàm lượng protein cao hơn so với đối chứng. Kết quả phân tích phổ điện di protein: - Đối với callus giống ROC 10 xử lý stress hạn thấy xuất hiện 1 băng protein mới và 3 băng protein bắt màu đậm hơn so với đối chứng. - Đối với callus giống ROC 16 thấy xuất hiện 4 băng protein mới và 3 băng có sự thay đổi về hàm lượng protein thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng. TÀI LIỆU THAM KHẢO: Cục khuyến nông và khuyến lâm Giới thiệu giống mía năng suất chất lượng cao. Nhà xuất bản Nông nghiệp (1998). Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam. Quyển 3, Tập 2. Mekong Printing Company, USA. Nguyễn Thị Lang. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. NXB Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh (2002). Nguyễn Hoàng Lộc. Chọn dòng chịu muối và chịu mất nước ở thuốc lá bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào. Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Viện sinh vật học, Hà Nội (1992). Nguyễn Văn Mùi. Thực hành Hóa sinh học. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội (2001). Nguyễn Hữu Nhân. Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh hóa liên quan đến khả năng chống chịu stress nước ở callus mía (Saccharum officinarum L.). Luận văn tốt nghiệp, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế (2003). Trương Thị Bích Phượng. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy in vitro và chiếu xạ tia gamma đến sự biến đổi sinh lý, hóa sinh, tế bào và hình thái của cây lúa (Oryza sativa L.). Luận án tiến sĩ, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế (2004). Võ Châu Tuấn. Nghiên cứu khả năng chống chịu stress nước ở mô callus lúa (Oryza sativa L.). Luận văn thạc sĩ khoa học, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Huế (2000). Dương Hoa Xô. Ứng dụng kĩ thuật điện di protein SDS-Page trong công tác chọn tạo giống lúa chất lượng cao. Trang web Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Tp Hồ Chí Minh (www.mard.gov.vn) (2004) TÓM TẮT Các callus giống ROC 10 và ROC 16 được xử lý mannitol ở các nồng độ 9, 12 và 15% ở các khoảng thời gian 7, 14, 21 và 28 ngày xử lý. Hàm lượng protein của callus giống ROC 10 và ROC 16 có sự thay đổi khi được xử lý bằng mannitol nồng độ 9-15% thời gian 7-28 ngày nuôi cấy, nhìn chung callus mía bị xử lý stress hạn có hàm lượng protein cao hơn so với đối chứng. Kết quả phân tích phổ điện di protein: - Đối với callus giống ROC 10 xử lý stress hạn thấy xuất hiện 1 băng protein mới và 3 băng protein bắt màu đậm hơn so với đối chứng. - Đối với callus giống ROC 16 thấy xuất hiện 4 băng protein mới và 3 băng có sự thay đổi về hàm lượng protein thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng. SOME CHANGES OF PROTEIN CONTENTS AND PROTEIN COMPOSITION OF THE DROUGHT TOLERANT SUGAR CANE (SACCHARUM OFFICINARUM L.) CALLUS Ngo Thi Minh Thu, Hoang Van Hanh, Truong Thi Bich Phuong College of Sciences, Hue University SUMMARY Sugar-cane callus of cultivar ROC 10 and ROC 16 were exposed to the aseptic nutritional medium containing different concentrations of mannitol of 9 to15% after 7, 14, 21 and 28 days. Our result showed that the protein contents of callus of cultivar ROC 10 and ROC 16 increased during the treatment period in the text. We found that there were changes in its protein composition:In cultivar ROC 10 calli, there were a new protein band and 3 different protein bands.