Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm của dịch chiếtcỏ ngũ sắc (Ageratumconyzoides) và đại bi (Blumea balsamifera) trên mô hình viêm mũi xoang thực nghiệm

106 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG VIÊM CỦA DỊCH CHIẾTCỎ NGŨ SẮC (AGERATUMCONYZOIDES) VÀ ĐẠI BI (BLUMEA BALSAMIFERA)TRÊN MÔ HÌNH VIÊM MŨI XOANG THỰC NGHIỆM Nguyễn Thái Linh∗, Nguyễn Phương Dung** TÓM TẮT Tình hình và mục ñích nghiên cứu: Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm của dịch chiết Ngũ sắc và Đại bi trên chuột nhắt trắng. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm bệnh - chứng, lựa chọn ngẫu nhiên, thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Y Học Cổ Truyền, Đại học Y Dược Tp. HCM từ tháng 03/2008 – 09/2009. Đối tượng nghiên cứu: 150 chuột chủng Mus musculus var. albino, trọng lượng từ 16-22g mua ở Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. Phương tiện ñánh giá: Mức ñộ mọc của vi khuẩn, mô học, kích thước u hạt. Sử dụng phép kiểm t – Student ñể thống kê số liệu thực nghiêm. Kết quả: Dịch chiết Etanol Cỏ Ngũ sắc và Đại bi làm giảm mức ñộ nhiễm khuẩn, tình trạng viêm trên mô học và với liều 40g/kg có tác dụng làm giảm u hạt. LD50 ñường uống của dịch chiết Ethanol là 1,056mg/kg thể trọng. Khi sử dụng liên tục trong 60 ngày (uống liều 40g/kg và 80g/kg) không làm thay ñổi một số chỉ số sinh hóa, huyết học, cấu trúc vi thể gan thận cuả chuột nhắt dùng trong thử nghiệm. Kết luận: Cỏ Ngũ sắc và Đại bi có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm trên mô hình viêm mũi xoang chuột gây bởi Streptococcus pneumoniae và mô hình gây u hạt thực nghiệm. Từ khóa: Cỏ ngũ sắc, Đại bi, viêm mũi xoang. ABSTRACST ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND ANTI-INFLAMMATORY EFFECTs OF (Ageratum conyzoides ) AND(Blumea balsamifera) ON RHINOSINUSITIS IN A MURINE MODEL Nguyen Thai Linh, Nguyen Phuong Dung Background and Aims:Based on the Vietnamese popular experience as well as the researchs of Ageratum conyzoides and Blumea balsamifera on the experimental antibacterial and anti-inflamatory effects, respectively . The present study was designed to evaluate the antibacterial and anti-inflamatory effects of the combination of these medicinal herbsin a Murine model. Materials and method: An experimental study was carried out on swiss albino mice were given Blumea balsamifera extract (2:1)/ethanol 90% và ethanol 70%. The percentage of granuloma inhibition, infection levels of S. pneumoniae, the level of inflammatory sinus nasal mucosa of mice caused by S. pneumonia are outcome measurements Result: The ethanolic extracts of Ageratum conyzoides and Blumea balsamifera leaves reduced in bacterial growth was similar to the controls, reduced histopathology score and the results showed that the group of rats treaded with extracts of A and B leaves(40g/kg) had a 21.04% (p< 0.05) reduction cotton-pellet granuloma.The extracts did not change hematological, biochemical index, microstructure of livers and kidneys of rats using daily oral doses of (40g/kg or 80g/kg body wt) during 60 days. Conclusion:The extracts of Ageratum conyzoides and Blumea balsamifera (40g/kg) have antibacterial and anti-inflammatory effects on experimental models. Key words: Ageratum conyzoide, Blumea balsamifera, rhinosinusitis. ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, ñã có công trình nghiên cứu ñã chứng minh hiệu quả của chế phẩm chiết xuất từ cỏ Ngũ sắc trên bệnh lý viêm mũi xoang mạn, viêm mũi xoang dị ứng 6, 7, 9. Một số nghiên cứu cũng cho thấy Đại bi có tác dụng kháng khuẩn, hoạt chất chống viêm 1, 8. Hầu hết những nghiên cứu trên ñều thực hiện trên một dược liệu. Trong khi ñó, nhân dân miền Đông Nam bộ như Bình Dương, Đồng Nai, các quận ngọai thành như Hóc Môn, Thủ Đức, Củ Chi lại có kinh nghiệm sử dụng kết hợp 2 dược liệu nói trên trong ñiều trị viêm mũi xoang. ∗ ,** Khoa Y hoïc Coå truyeàn- Ñaïi hoïc Y Döôïc Tp. HCM. Ñòa chæ lieân heä: BS. Nguyeãn Thaùi Linh ÑT: 0909979717 Email: bsthailinh@gmail.com 107 Để có cơ sở khoa học chứng minh hiệu quả của một phương pháp ñiều trị viêm mũi xoang từ kinh nghiệm dân gian, chúng tôi thực hiện ñề tài nhằm nghiên cứu chế phẩm từ cỏ Ngũ sắc và Đại bi ñể ứng dụng ñiều trị bệnh viêm mũi xoang. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Lá cỏ Ngũ sắc, lá Đại bi ñược thu hái ở Quận Thủ Đức, sấy ở nhiệt ñộ 45 – 500C ñến khô. Mỗi dược liệu ñược chiết xuất riêng bằng phương pháp ngấm kiệt với ethanol 96% và 70% (tỷ lệ 15:1, dung môi:dược liệu). Lấy dịch chiết cồn và bốc hơi cồn ở nhiệt ñộ 50oC, thu ñược dịch chiết cô ở 50oC có ñược dịch chiết 2:1 (2 g dược liệu: 1 ml dịch chiết), phối hợp lại. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng ñực, Mus musculus var. albino, trọng lượng từ 16 – 22g mua ở Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, ñược nuôi trong ñiều kiện ổn ñịnh, mỗi chuột uống 0,2ml/10g thể trọng. Độc tính cấp 4 Trước khi tiến hành thí nghiệm 14 giờ, không cho chuột ăn, chỉ uống cho uống nước tự do. Chia ngẫu nhiên chuột nhắt làm 5 lô, mỗi lô 5 – 10 chuột. Dùng kim ñầu tù ñể cho chuột uống các liều thuốc thử nghiệm khác nhau: -Lô 1: mỗi chuột uống 500 g dược liệu tươi /kg thể trọng -Lô 2: mỗi chuột uống 700 g dược liệu tươi /kg thể trọng -Lô 3: mỗi chuột uống 1,000 g dược liệu tươi/kg thể trọng -Lô 4: mỗi chuột uống 1,100 g dược liệu tươi/kg thể trọng -Lô 5: mỗi chuột uống 1,500 g dược liệu tươi/kg thể trọng Theo dõi tỷ lệ chuột chết trong 48 giờ sau khi uống thuốc Tính LD50 theo công thức Behrens- Karber Độc tính bán trường diễn 1 Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng thành 3 lô, mỗi lô 10 con: -Lô bình thường (BT): uống nước cất, thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng -Lô nghiên cứu 1 (NC1): uống thuốc nghiên cứu 80g dược liệu tươi/kg thể trọng -Lô nghiên cứu 2 (NC2): uống thuốc nghiên cứu 40g dược liệu tươi/kg thể trọng Thời gian dùng thuốc liên tục 60 ngày Các chỉ tiêu theo dõi: -Thể trọng (g) - Huyết học: số lượng hồng cầu (triệu/mm3), số lượng bạch cầu (ngàn/mm3), hemoglobin (g/L), hematocrit (%) - Sinh hóa máu: SGOT (U/L), SGPT (U/L), ure (mg/dL), creatinin (mg/dL), glucose (mg/dL) - Vi thể: gan, thận Tác dụng kháng viêm mũi xoang (theo Kelly Bomer) 3, 10 Gây viêm mũi xoang trên chuột nhắt trắng bởi S. pneumoniae theo mô hình của Kelly Bomer. Chuột nhắt trắng ñực, trọng lượng từ 16 – 18 g, chia làm 4 nhóm, rữa mũi bằng NaCl 0,9% trải dịch rữa mũi trên môi trường thạch máu. Ủ 370C trong 48 giờ và quan sát hệ vi khuẩn mọc ñược. Một ngày sau, nhỏ mũi chuột với 10µl dịch vi khuẩn S. pneumoniae. Sau ñó, hàng ngày chuột nhóm 1 ñược cho uống nước cất, chuột nhóm 2 cho uống Ampicillin phối hợp với prednisone, chuột nhóm 3 uống thuốc nghiên cứu (40g/kg), chuột nhóm 4 ñược nhỏ mũi (1,177mg/kg), dùng liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8 chuột ñược gây mê bằng thiopental với liều truỵ hô hấp ( 120mg/kg), sau ñó sát trùng phần ngoài khoang miệng và ñầu, rữa mũi bằng NaCl 0,9%. Dịch rửa mũi ñược nhỏ giọt trực tiếp trên ñĩa thạch BA chứa gentamycin, cấy vạch 3 chiều và ủ ở 370 C trong 24 giờ. Lượng S.pneumoniae ñược ñánh giá bằng 4 cấp ñộ: cấp ñộ 0 = không mọc; cấp ñộ 1 = chỉ mọc ở 1 chiều (khóm ít); cấp ñộ 2 = mọc ở chiều 1 và 2 (khóm vừa); cấp ñộ 3 = mọc trên cả 3 chiều (khóm nhiều). Nhanh chóng cắt lấy phần ñầu chuột khi tim còn ñập và ngâm trong dung dịch cố ñịnh mẫu formol 10% trong 1 ngày. Lọc bỏ da cơ, mắt, hàm dưới và lưỡi, phần còn lại cho vào HNO3 5%, ngâm qua ñêm. Dùng dao lam cắt phần trước mũi và não thành 3 phần sao cho phần xoang mũi từ trước tới sau dài khoảng 8mm, mẫu ñược gửi khoa Giải phẫu bệnh –ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh. 108 Tác dụng ức chế tạo u hạt thực nghiệm bằng amian (theo Ducrot, Julou – 1963) [1] Cắt amian thành từng ñoạn ngắn, trọng lượng 20 ± 1 mg, vê tròn, sấy khô. Cạo sạch lông vùng lưng chuột, dùng ñầu kéo bấm 1 lỗ nhỏ trên ñể tách da lưng ra khỏi lớp cơ, cấy amian. Khâu bằng chỉ ñể nối liền vết mổ. Chia ngẫu nhiên chuột thành 3 lô, mỗi lô 10 chuột: - Lô chứng (C): mỗi chuột uống nước cất 0,2 ml/10 g thể trọng - Lô ñối chứng (As): mỗi chuột uống aspirin liều 240 mg/kg thể trọng. - Lô nghiên cứu (NC): mỗi chuột uống dịch chiết 40g dược liệu tươi/kg thể trọng. Cho chuột dùng thuốc liên tiếp 5 ngày. Chiều ngày thứ 5, bóc tách u hạt và cân tươi từng u hạt. Sau ñó, sấy khô các u hạt ở 1600C ñến trọng lượng không ñổi. Cân từng u hạt ñã sấy khô. Trọng lượng thực sự của u hạt (tươi, khô) bằng cách trừ ñi trọng lượng viên amian (20 mg). Tác dụng ức chế u hạt ñược biểu thị bằng tỷ lệ % giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô dùng thuốc so với lô chứng. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độc tính cấp Tính theo công thức Behrens – Karber, có ñược liều gây chết 50% súc vật thử nghiệm là: LD50 = 1,056 g dược liệu tươi /kg. Chúng tôi tham khảo ñược một số tài liệu về LD50 của cỏ Ngũ sắc như sau: cao chiết nước có LD50 = 82 g/kg 7; cao chiết cồn 96% có LD50 = 10,1 g/kg 5. Đối chiếu với LD50 theo các công bố trước ñây, chúng tôi thấy sự phối hợp làm gia tăng liều gây chết 50% súc vật thử nghiệm khoảng 52 lần của dịch chiết cồn 96%. Như vậy, phối hợp 2 dược liệu cỏ Ngũ sắc và Đại bi có khả năng làm giảm ñộc tính cấp so với khi chỉ dùng ñộc vị cỏ Ngũ sắc. Đây là một trong các cơ sở góp phần chứng tỏ hiệu quả an toàn khi phối hợp nhiều vị thuốc của y học cổ truyền. Độc tính bán trường diễn Sau 2 tháng uống liều 80 và 40 g dược liệu tươi/kg cho thấy dịch chiết phối hợp cỏ Ngũ sắc và Đại bi không làm thay ñổi số lượng hồng cầu, bạch cầu, Hb, Hct, SGPT, SGOT, ure, creatinin, glucose huyết và cấu trúc vi thể gan, thận so với lô bình thường. Riêng lô chuột uống liều 80g/kg, trọng lượng chuột giảm 32,47% (P<0,01). Bảng 1. Các trị số huyết học của chuột nhắt sau 2 tháng dùng thuốc nghiên cứu Lô nghiên cứu Trị số huyết học Lô BT NC 1 (80 g/kg) NC 2 (40 g/kg) Hồng cầu (triệu/mm3) Bạch cầu (ngàn/mm3) Hemoglobin (g/dL) Hematocrit (%) 8,15 + 0,36 6,46 + 0,63 42,2 + 1,32 14,1 + 0,80 8,31 + 0,66 6,44 + 0,71 42,94 + 1,12 14,7 + 0,91 8,2 + 0,24 6,57 + 0,6 42,6 + 1,62 14,3 + 0,73 Bảng 2. Các trị số sinh hóa của chuột nhắt sau 2 tháng dùng thuốc nghiên cứu Lô nghiên cứu Trị số sinh hóa Lô BT NC 1 (80 g/kg) NC 2 (40 g/kg) SGPT (U/L) SGOT (U/L) Ure (mg/dL) Creatinin (mg/dL) Glucose (mg/dL) 49,9 + 8,06 43,6 + 4,48 20,48 + 3,12 0,97 + 0,19 108,20 ± 10,96 50,63 + 3,85 44,7 + 5,25 23,76 + 5,84 1,21 + 0,29 100,8 + 7,92 48,54 + 3,25 45,63 + 3,11 20,13 + 2,91 1,12 + 0,25 102,5 + 12,31 Tác dụng kháng S. pneumoniae của dịch chiết cỏ Ngũ sắc, Đại bi khi sử dụng ñường uống Bảng 3.Mức ñộ nhiễm S. pneumoniae trong mũi chuột sau 8 ngày uống dịch chiết cỏ Ngũ sắc, Đại bi Mức ñộ nhiễm S. pneumoniae / chuột Lô Cấp ñộ 0 Cấp ñộ 1 Cấp ñộ 2 Cấp ñộ 3 Tổng số chuột Nước cất 0 (0%) 3 (30%) 3 (30%) 4 (40%) 10 Amp + Pred 7 (70%) 3 (30%) 0 (0%) 0 (0%) 10 NC 1 40 g/kg 6 (60%) 2 (20%) 2 (20%) 0 (0%) 10 10/10 chuột lô chứng (chỉ uống nước cất) ñều nhiễm S. pneumoniae ở các cấp ñộ 1, 2 và 3, chứng tỏ xoang mũi của chuột nhắt là một môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn này. Chỉ có 3/10 chuột ñiều trị bằng (amp + pred) nhiễm vi khuẩn S. pneumoniae cấp ñộ 1, không có chuột nào nhiễm vi khuẩn ở mức ñộ nặng 109 hơn. Với chuột uống bằng hỗn hợp cỏ Ngũ sắc và Đại bi, có 2/5 mẫu mô bình thường, 2/5 mẫu mô viêm nhẹ, 1/5 mẫu mô ở ở mức ñộ viêm vừa. Mặc dù tỷ lệ chuột còn nhiễm S. pneumoniae cao hơn lô ñối chứng (amp + pred), nhưng ñã thể hiện hiệu quả kháng khuẩn rõ rệt trên chuột nhắt nghiên cứu. Đối với lô nhỏ mũi mặc dù với liều dùng rất nhỏ so với lô uống nhưng vẫn ñạt ñược hiệu lực kháng khuẩn tương ñương (Bảng 3). Về mức ñộ mô viêm, nhóm chuột uống, hiện tượng viêm cũng giảm rõ: 2/5 mô bình thường, 2/5 mô viêm nhẹ, 1/5 mô viêm vừa, không có mô viêm nặng. Kết quả khảo sát trên mô niêm mạc xoang mũi của chuột thí nghiệm cho thấy hiện tượng viêm giảm rõ (Bảng 4). Bảng 4. Mức ñộ viêm niêm mạc xoang mũi của chuột nhắt sau 8 ngày dùng thuốc nghiên cứu L ô Mức ñộ viêm niêm mạc xoang mũi chuột nhắt nhiễm S. pneumoniae (%) Không viêm Viêm nhẹ Viêm vừa Viêm nặng Nước cất 0 0 3 3 Amp+pred 2 1 0 0 NC 1 (U) 40g/kg 2 2 1 0 Bảng 5. So sánh hiệu lực kháng khuẩn của 2 ñường ñưa thuốc trên chuột nhiễm S. pneumoniae Đường dùng Mức ñộ nhiễm S. pneumoniae/chuột Tổng số Cấp ñộ 0 Cấp ñộ 1 Cấp ñộ 2 Cấp ñộ 3 Uống (40g/kg) 6 (60%) 2 (20%) 2 (20%) 0 (0%) 10 Nhỏ mũi (10µL) 6 (60%) 1 (10%) 3 (30%) 0 (0%) 10 Tác dụng kháng viêm trên chuột gây u hạt thực nghiệm Với lô uống aspirin (240 mg/kg), kết quả cho thấy tỷ lệ ức chế u hạt tươi là 17,52% (P<0,05), tỷ lệ ức chế u hạt khô là 30,66% (P<0,05). Kết quả này chứng tỏ mô hình thực nghiệm kinh ñiển này khá ổn ñịnh và kết quả thực nghiệm của chúng tôi tương ñồng với những nghiên cứu trong và ngoài nước. Dịch chiết phối hợp cỏ Ngũ sắc và Đại bi (40 g/kg hỗn hợp, chứa 20 g cỏ Ngũ sắc /kg, uống 5 ngày) có tỷ lệ ức chế 21,04% u hạt tươi (P<0,05) và 43,26% u hạt khô (P<0,05). Khả năng ức chế u hạt tương ñương với thuốc ñối chiếu là aspirin (Bảng 6) Bảng 6. Trọng lượng u hạt tươi (mg) và u hạt khô (mg) sau gây mô hình viêm mạn 6 ngày Lô n Trọng lượng u hạt tươi (mg) Trọng lượng u hạt khô (mg) C 10 55,18 ± 7,94 9,92 ± 2,35 As (240 mg/kg) 10 45,51 ± 3,74 6,88 ± 2,31 NC (40 g/kg) 10 43,57 ± 4,83 5,63 ± 1,48 KẾT LUẬN 1. Liều gây chết 50% súc vật thử nghiệm khi sử dụng hỗn hợp dịch chiết cỏ Ngũ sắc và Đại bi trên chuột nhắt trắng là 1.056 g dược liệu tươi / kg thể trọng. Ở liều uống 40 g dược liệu tươi/kg thể trọng, dịch chiết hỗn hợp cỏ Ngũ sắc và Đại bi không làm thay ñổi tốc trọng lượng, số lượng hồng cầu, bạch cầu, Hb, Hct, SGPT, SGPT, ure, creatinin, glucose, hình ảnh vi thể gan, thận chuột nhắt so với lô bình thường. 2. Dịch chiết hỗn hợp cỏ Ngũ sắc và Đại bi (40 g dược liệu tươi/kg thể trọng, uống) có tác dụng kháng khuẩn, ñồng thời thể hiện khả năng ức chế viêm trên chuột nhắt trắng viêm mũi xoang gây bởi S. pneumoniae. 3. Khi sử dụng liều uống 40 g dược liệu tươi/kg thể trọng liên tục trong 5 ngày, dịch chiết hỗn hợp cỏ Ngũ sắc và Đại bi có tác dụng ức chế tạo u hạt trên chuột nhắt trắng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Barua, N. C., Sharma, R. P. (1992), "(2R,3R)-7,5'-dimethoxy-3,5,2'-trihydroxyflavanone from Blumea balsamifera". Phytochemistry, 31(), pp. 4040. 2. Bộ Y Tế. Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 142 – 143, tr. 355 – 368. 3. Bomer, K., Brichta, A., Baroody, F., Boonlayangoor, S., Li, X., Naclerio, R. M. (1998), "A mouse model of acute bacterial rhinosinusitis". Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 124(11), pp. 1227-1232. 4. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác ñịnh ñộc tính cấp của thuốc, Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, tr. 50 – 57. 5. Igboasoiyi, A. C., Eseyin, O. A., Ezenwa, N. K., Oladimeji, H. O. (2007), "Studies on the toxicity of Ageratum conyzoides". Journal of Pharmacology and Toxicology, 2(8), pp. 743 - 747. 110 6. Đoàn Thị Nhu, Quách Mai Loan, Lê Hà Lệ Xuân (1975). “Tác dụng dược lý cây cứt lợn”. Tập chí Dược Học số 4. 7. Đoàn Thị Nhu, Lê Hà Lệ Xuân (1975), “Góp phần nghiên cứu tác dụng dược lý của cây Cứt lợn”. Tạp chí Dược Học, số 5 8. Ragasa, C., Kristin, A. L., Rideou, J. A. (2005), "Antifungal metabolites from Blumea balsamifera". Natural Product Research, 19(3), 231 – 237. 9. Phạm Trương Thị Thọ, Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Văn Bàn (1975), “Góp phần nghiên cứu cây cứt lợn”. Tập San Dược Học, số 4. 10. Đỗ Thị Hồng Tươi, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết, Nguyễn Sào Trung, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa (2005), "Khả năng sử dụng Bacillus subtilis ñiều trị viêm mũi xoang trên mô hình chuột". Y Học TP. Hồ Chí Minh, Tập 9 (Số 4), tr. 215 – 218.