Nghiên cứu thành phần gen h5 của virus cúm a/h5n1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên Huế

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 46, 2008 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN GEN H5 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TỪ VỊT TẠI THỪA THIÊN - HUẾ Trần Quang Vui Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Lê Thanh Hoà Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT Phân đoạn gen HA(H5) của một chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế (ký hiệu A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã được thu nhận bằng phương pháp RT-PCR, dòng hoá, giải trình trình tự, so sánh thành phần gen và phân tích quan hệ phả hệ. Gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 (Thừa Thiên-Huế) có tỷ lệ tương đồng cao so với các chủng từ các vùng miền khác của Việt Nam (Hậu Giang, Tiền Giang và Cà Mau) và có thể cùng nguồn gốc dòng Quảng Đông với các chủng cúm A/H5N1 này. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của mọi loài chim, kể cả gia cầm và thủy cầm, do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. H5N1 là một phân týp có độc lực cao, xuất hiện gần đây tại các nước châu Á, châu Âu, châu Phi và được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gia cầm những năm 1996-2008. Ở Việt Nam, những vụ dịch cúm gia cầm do H5N1 đã xảy ra trên toàn bộ đất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và bị tiêu huỷ, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế quốc dân. Virus cúm A chứa hệ gen ARN một sợi âm bao gồm 8 phân đoạn (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MA, NS), trong đó phân đoạn 4 mã hoá cho protein hemagglutinin (HA) là một protein thụ thể có vai trò bám dính vào tế bào chủ và là kháng nguyên bề mặt chịu trách nhiệm độc lực trong cơ chế gây bệnh của virus. Virus cúm gia cầm có khả năng tái tổ hợp biến chủng để thích nghi và rất dễ thay đổi cấu trúc kháng nguyên (Lê Thanh Hòa và cs, 2004). Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng để thu nhận một phần hoặc toàn bộ gen H5N1, xác định đặc tính sinh học phân tử, định loại subtype, giải trình trình tự, so sánh phân tích số liệu và xem xét di truyền quần thể, tiến hóa nguồn gốc của các biến chủng H5N1 (Wan và cs, 2005; Lê Thanh Hòa, 2006). Trong bài báo này chúng tôi so sánh thành phần gen H5 của một chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế và phân tích quan hệ phả hệ với các chủng khác của Việt Nam. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Bệnh phẩm là dịch khí quản-phế quản chứa virus cường độc cúm A/H5N1 thu thập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế năm 2004 (A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã được vô hoạt bằng nhiệt độ, bảo quản ở -20oC. Các loại sinh phẩm đã được sử dụng trong nghiên cứu: i) Bộ kit QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc.) tách chiết ARN hệ gen của virus; ii) Bộ kit One-step RT-PCR của hãng Invitrogen thực hiện phản ứng RT-PCR; iii) Bộ kit QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.); iv) Bộ kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) dùng dòng hóa sản phẩm; v) Chủng vi khuẩn E. coli DHα-T1; vi) Bộ kit QIApreps Spin Miniprep (QIAGEN Inc.) sử dụng tách ADN của các plasmid tái tổ hợp; vii) Bộ kit DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN Inc.) dùng tinh sạch phản ứng giải trình tự. Tách ARN hệ gen của virus ARN hệ gen của virus được tách chiết bằng bộ kit QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng RT-PCR Cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR thu nhận toàn bộ gen H5: Mồi xuôi H5BAMF: 5'CGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTT3', tương ứng vị trí 19-34 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt của enzyme giới hạn BamHI (gạch bên dưới). Mồi ngược H5NOTR: 5'ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGA3', tương ứng vị trí 1708-1735 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt của enzyme giới hạn NotI (gạch bên dưới). Toàn bộ phân đoạn HA của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 có độ dài khoảng 1700 bp được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR một bước với cặp mồi H5BAMF - H5NOTR, theo chu trình nhiệt như sau: 50oC/60 phút, 95oC/15 phút, 35 chu kỳ [94oC/1 phút, 55oC/30 giây, 72oC/2 phút], 72oC/10 phút, sau chu kỳ cuối cùng bảo quản sản phẩm ở 4oC cho đến khi kiểm tra và tinh sạch sản phẩm. Kiểm tra sản phẩm RT-PCR, tinh sạch và dòng hóa sản phẩm vào vector tách dòng Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra trên agarose 1%, được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn. Gen HA trong sản phẩm sau khi tinh sạch được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Các phản ứng nối ghép gen, chuyển nạp plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp tạo sốc nhiệt được tiến hành theo đúng quy trình. Vi khuẩn tái tổ hợp được chọn lọc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 16-20 giờ. Tế bào được thu lại bằng ly tâm và tách chiết ADN plasmid bằng bộ kit QIApreps Spin Mini kit của hãng QIAGEN. Giải trình trình tự và phân tích số liệu Trình tự nucleotide ADN của plasmid được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) có tại Viện Công nghệ Sinh học. Chuỗi nucleotide được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03, sau đó sử dụng chương trình AssemLIGN 1.9 và hệ chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu các chuỗi bằng chương trình GENEDOC 2.5. Chọn chuỗi so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide Chuỗi nucleotide gen H5 của chủng virus cúm A/H5N1 từ vịt Thừa Thiên Huế sẽ được đối chiếu, so sánh với các chủng của Việt Nam đã công bố, được thu thập từ Ngân hàng gen (GenBank). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tách ARN tổng số, thu nhận và tách dòng gen H5 ARN tổng số tách chiết bằng bộ kit của hãng QIAGEN cho hàm lượng ARN cao có thể sử dụng làm khuôn để thu nhận các phân đoạn gen của virus. ARN tổng số điện di trên thạch agarose 1% được trình bày ở Hình 1-A. Toàn bộ gen H5 của virus cúm A chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu trình nhiệt đã được mô tả. Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1% (Hình 1-B), đó là một băng ADN đặc hiệu, có độ dài khoảng 1,7 kb như dự tính. Sản phẩm này được sử dụng cho thí nghiệm tách dòng tiếp theo. Sản phẩm RT-PCR của gen H5 toàn phần được gắn vào vector tách dòng pCR2.1TOPO để tạo plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp này được chuyển nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH-5αT1. Chọn các khuẩn lạc màu trắng có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng để thu nhận ADN plasmid. Sau khi tách chiết, các ADN plasmid được cắt bằng enzym giới hạn EcoRI để kiểm tra sự có mặt đoạn chèn của gen H5. Theo tính toán, nếu vector pCR2.1TOPO tái tổ hợp mang gen H5 thì khi cắt bằng EcoRI sẽ cho 1 đoạn ADN có kích thước khoảng 3,9 kb của vector và một đoạn ADN khoảng 1,7 kb của gen H5 (Hình 1-C). Hình 1: A- ARN tổng số của virus cúm A/H5N1 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004, B- Sản phẩm phân đoạn gen H5, C- Kết quả kiểm tra tách dòng cắt bằng EcoRI. Kết quả ở Hình 1-C cho thấy cả 2 khuẩn lạc được chọn lọc đều chứa vi khuẩn tái tổ hợp mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước khoảng 1,7 kb. Sau khi giải trình trình tự và phân tích chuỗi gen, chúng tôi thu nhận được gen có độ dài 1707 nucleotide. Chuỗi này được truy cập Ngân hàng gen bằng chương trình BLAST, kết quả truy cập được trình bày ở Hình 2. Chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 có mức độ tương đồng cao với các chủng A/H5N1 đã công bố trong Ngân hàng gen. Chứng tỏ gen HA thu nhận được đúng là gen H5 (virus cúm A phân týp H5N1). Như vậy có thể khẳng định kết quả của quá trình tách dòng đã lưu giữ được gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004. Số đăng ký trong ngân hàng gen Tên loại virus có kết quả tương đồng DQ099758.1 Influenza A virus (A/chicken/Viet Nam/TG-023/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds DQ099759.1 Influenza A virus (A/chicken/Viet Nam/DT-171/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds AY651340.1 Influenza A virus (A/Ck/Viet Nam/37/2004(H5N1)) hemagglutinin (HA) gene, partial cds CY028700.1 Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/10/2004(H5N1)) segment 4, complete sequence DQ099756.1 Influenza A virus (A/duck/Viet Nam/TG-007A/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds CY029937.1 Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/15/2004(H5N1)) segment 4, complete sequence CY028716.1 Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/24/2004(H5N1)) segment 4, complete sequence DQ099760.1 Influenza A virus (A/chicken/Viet Nam/LD-080/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds DQ099757.1 Influenza A virus (A/quail/Viet Nam/TG-007B/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds DQ099755.1 Influenza A virus (A/chicken/Viet Nam/TN-025/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds AY818137.1 Influenza A virus (A/quail/Vietnam/36/04(H5N1)) hemagglutinin HA gene, complete cds DQ320937.1 Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/DT171/2004(H5N1)) hemagglutinin (HA) gene, partial cds CY028708.1 Influenza A virus (A/chicken/Vietnam/23/2004(H5N1)) segment 4, complete sequence DQ083551.1 Influenza A virus (A/chicken/Bangkok/Thailand/CU-3/04(H5N1)) hemagglutinin gene, complete cds DQ497724.1 Influenza A virus (A/Vietnam/CL36/2004(H5N1)) hemagglutinin (HA) gene, partial cds DQ497719.1 Influenza A virus (A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)) hemagglutinin (HA) gene, partial cds AY651342.1 Influenza A virus (A/Ck/Viet Nam/39/2004(H5N1)) hemagglutinin (HA) gene, partial cds EF568922.2 Influenza A virus (A/chicken/Suphanburi/137/2005(H5N1)) hemagglutinin (HA) gene, complete cds EF541415.1 Influenza A virus (A/chicken/Laos/44/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds EF541413.1 Influenza A virus (A/chicken/Laos/7191/2004(H5N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds Hình 2: Kết quả truy cập ngân hàng gen của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 với các chủng thế giới Phân tích biến đổi thành phần gen H5 của virus chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 và so sánh với các chủng khác của Việt Nam Kết quả so sánh đối chiếu thành phần nucleotide của toàn bộ gen H5 (1707 bp) chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 với các chủng A/H5N1 khác phân lập từ vịt của Việt Nam, bao gồm: A/Dk/Vietnam/CaMau498/2006(H5N1) (số đăng ký: ISDN230177), A/Dk/Vietnam/TienGiang409/2006 (H5N1) (ISDN230178),A/Dk/Vietnam/HauGiang680F/2005 (H5N1) (ISDN230184), A/Dk/Vietnam/11/2004(H5N1) (AY651344), A/Dk/Vietnam/NCVD01/2005(H5N1) (EF566203), A/Dk/Vietnam/12/2005(H5N1) (CY016883) được trình bày ở Hình 3. Có 3 vị trí mà ở đó thành phần nucleotide của gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 có sai khác hoàn toàn so với tất cả 6 chủng so sánh và 1 vị trí sai khác với 5 chủng. Kết quả phân tích chuỗi gen cho thấy chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 có mức độ tương đồng cao so với các chủng so sánh (96 – 98%). Qua truy cập Ngân hàng gen và phân tích mối tương đồng, như vậy chủng này thuộc phân týp H5N1, và được xác định là: A/Dk/Vietnam/Hue/2004(H5N1). Phân tích mối quan hệ phả hệ của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004(H5N1) Quan hệ phả hệ của chủng cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên-Huế được phân tích so sánh với các chủng khác của Việt Nam, kết quả trình bày ở Hình 4. Các chủng A/Dk/Vietnam/HauGiang680F/2005(H5N1), A/Dk/Vietnam/CaMau498/2006(H5N1) và chủng A/Dk/Vietnam/TienGiang409/2006(H5N1), tập hợp trong cùng một nhóm với chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004(H5N1) đang nghiên cứu phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế. Điều này cho phép nhận xét, có thể các chủng cúm A/H5N1 từ vịt Thừa Thiên - Huế, Hậu Giang, Tiền Giang và Cà Mau có cùng nguồn gốc. Đây là các chủng cúm A/H5N1 thuộc dòng Quảng Đông. Hình 3: So sánh thành phần nucleotide của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004(H5N1) với các chủng A/H5N1 phân lập từ vịt của Việt Nam. Ghi chú: Phần đóng khung biểu thị sai khác của chủng A/Dk/Vietnam/2004(H5N1) với các chủng khác. A/Duck/Vietnam/TienGiang/2006(H5N1) (ISDN230178) A/Duck/Vietnam/CaMau498/2006(H5N1) (ISDN230177) A/Duck/Vietnam/HauGiang/2005(H5N1) (ISDN230184) A/Dk/Vietnam/Hue/2004 (H5N1) A/Dk/Vietnam/11/2004(H5N1) (AY651344) A/Duck/Vietnam/NCVD01/2005(H5N1) (EF566203) A/duck/Vietnam/12/2005(H5N1) (CY016883) 0.005 Hình 4: Phân tích phả hệ của các chủng cúm A/H5N1 phân lập từ vịt của Việt Nam IV. KẾT LUẬN 1. Toàn bộ chuỗi gen HA của chủng cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên-Huế có độ dài 1707 bp đã được giải trình trình tự, chính xác là gen H5 của virus cúm A/H5N1. 2. Chuỗi gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004(H5N1) có 3 vị trí sai khác hoàn toàn so với 6 chủng phân lập từ vịt của các vùng miền khác của Việt Nam. 3. Các chủng cúm A/H5N1 từ vịt Thừa Thiên-Huế, Hậu Giang, Tiền Giang và Cà Mau có cùng nguồn gốc thuộc dòng Quảng Đông. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thanh Hoà, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình. Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người. Tạp chí Công nghệ Sinh học. Vol. 2(1), (2004) 1 – 18. Lê Thanh Hoà. Y – Sinh học phân tử (Quyển 1). Nhà xuất bản Y học. Hà Nội 2006. Wan XF, Ren T, Luo KJ, Liao M, Zhang GH, Chen JD, Cao WS, Li Y, Jin NY, Xu D, Xin CA. Genetic characterization of H5N1 avian influenza viruses isolated in southern China during the 2003-04 avian influenza outbreaks. Arch Virol. 150(6), (2005) 1257 – 66. THE ANALYSIS OF H5 NUCLEOTIDE SEQUENCE OF AVIAN INFLUENZA VIRUS A/H5N1 ISOLATED FROM DUCK THUA THIEN-HUE, VIETNAM Tran Quang Vui College of Agriculture and Forestry, Hue University Le Thanh Hoa Institute of Biotechnology, Vietnamese Academy of Science and Technology SUMMARY The entire HA (H5) segment of an avian influenza strain isolated from a duck in Thua Thien-Hue province (designated as A/Dk/Vietnam/Hue/2004) was obtained by RT-PCR, completely sequenced and analyzed for genetic variation and phylogenetic relationship. The nucleotide sequence of this strain (Thua Thien-Hue province) has a high identity compared with that of A/H5N1 strains having previously isolated from different geographical regions of Vietnam (ie. Hau Giang, Tien Giang and Ca Mau provinces) and likely, has also originated from the Guangdong sublineage as these strains.