Nghiên cứu thiết lập quy trình xác định các Amino acid trong một số loại mẫu thực phẩm và sinh học dựa trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

32 Chương 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Với mục tiêu sử dụng sắc ký pha đảo để phân tách các amino acid, chúng tôi chọn phương pháp dansyl hóa trước cột vì các ưu điểm của phương pháp tạo dẫn xuất này (xem mục 1.3). Do đó, phần thực nghiệm gồm có ba mục tiêu: I. Nghiên cứu kiểm soát phản ứng dansyl hóa amino acid II. Nghiên cứu phân tách các dẫn xuất dansyl amino acid III. Xây dựng quy trình xác định các amino acid cơ bản 3.1. NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT DANSYL AMINO ACID 3.1.1. ĐIỀU KIỆN THÔNG DỤNG CHO PHẢN ỨNG DANSYL HÓA AMINO ACID [11], [14] Theo tài liệu tham khảo [11], phản ứng dansyl hóa amino acid thường tiến hành trong môi trường đệm pH ≈ 9 (ít quan tâm đến bản chất của hệ đệm); thuốc thử dansyl chloride được pha trong dung môi phân cực phi proton như acetonitrile, acetone; nhiệt độ phản ứng khoảng 60 oC. Các thông số này được tổng kết từ những năm 1990, nhưng vẫn được áp dụng cho tới hiện nay [10]. Một quy trình tiêu biểu như sau [14]: lấy 0.5 mL dung dịch 0.1 M NaHCO3 5 mM EDTA (pH 9) có chứa các amino acid (chuNn hoặc mẫu) vào ống nghiệm, tiếp tục thêm 0.5 mL dung dịch thuốc thử 0.25 % (w/v) Dns-Cl (trong acetonitrile). Sau khi lắc đều, và vặn kín nắp, ngâm ống nghiệm này vào bể nước 60 oC trong 30 phút. Sau thời gian đó, thêm 0.5 mL dung dịch 0.4 M NaOH vào ống nghiệm để dừng phản ứng trước khi tiêm vào cột sắc ký. N S H3C H3C O O Cl N H C R COO- H H pH 9 + N S H3C H3C O O N H C R COO- H HCl+ Hình 3.1: Sơ đồ phản ứng dansyl hóa amino acid 33 Độ nhạy của quy trình này có thể xuống đến picomole amino acid. Tuy vậy, khi phân tích các cơ cấu điện tử của thuốc thử dansyl chloride (xem hình 3.2), chúng tôi nhận thấy có thể tác động lên tốc độ và độ chuyển hóa của phản ứng này thông qua việc tăng tính rút điện tử của nhóm sulfone (trên nhóm sulfonyl), và giảm thiểu sự bất định xứ của đôi điện tử tự do trên nhóm 5-dimethylamino. 3.1.2. KHẢO SÁT TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG DANSYL HÓA AMINO ACID Với mục tiêu dịch chuyển cân bằng theo chiều tạo ra dạng hoạt tính mạnh (dạng cộng hưởng thứ II trên hình 3.2), chúng tôi đặc biệt quan tâm đến các yếu tố an định điện tích dương trên tâm thân điện tử của nhóm sulfonyl như: giá trị pH của môi trường phản ứng (vì ion H+ có thể tác kích lên các tâm giàu điện tử N hay O); độ phân cực của môi trường phản ứng giúp solvate hóa các tâm mang điện; và bản chất của hệ đệm vì chúng quyết định lực ion và đôi khi còn cho các tương tác đặc biệt như ghép cặp ion, liên kết hydrogen. Tuy nhiên, giả thiết này cần khảo sát kỹ lưỡng vì khi đặt các điều kiện để tác kích vào các tâm giàu điện tử của thuốc thử, thì nhóm amino trên amino acid cũng bị tác kích, làm giảm tính thân hạch của các amino acid. Kết quả khảo sát cho thấy bản chất của hệ đệm có ảnh hưởng đến phản ứng dansyl hóa, đây là điểm mới so với các khảo sát trước. Hình 3.2: Cơ cấu điện tử trên ba dạng cộng hưởng của dansyl chloride 34 Trong các thí nghiệm khảo sát này, dung dịch chuNn chứa 11 amino acid gồm Arg, Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Aba, Ala, Met, Val và Leu (đây là các amino acid có mạch nhánh từ rất phân cực như Arg hay Asp đến rất kém phân cực như Leu hay Val); và mỗi amino acid có nồng độ xác định, được pha trong hệ đệm thích hợp dùng để khảo sát điều kiện tối ưu cho phản ứng dansyl hóa. Sau đó, các dẫn xuất dansyl-amino acid được xác định bằng phương pháp HPLC tại bước sóng λ= 250 nm, nhiệt độ cột phân tích 50 oC và rửa giải theo chương trình G1 (xem bảng 3.1) với tốc độ dòng 1.0 mL/phút, pha động A1 là dung dịch 10 mM TFA + 9.5 mM TEA, pH 3.45; pha động B1 là ACN-IPA (87.5:12.5, v/v), để tiến hành khảo sát. Bảng 3.1 Chương trình rửa giải G1 T (phút) % A % B 0.00 95.0 5.0 50.00 70.0 30.0 60.00 45.0 55.0 80.00 0.0 100.0 3.1.2.1. Môi trường đệm Theo tài liệu tham khảo [11], dansyl chloride là thuốc thử đặc trưng cho các amino acid trong khoảng pH xấp xỉ 9. Do đó, nhiều công trình nghiên cứu trước đây thường chọn các hệ đệm, có đệm năng lớn trong vùng pH này như hệ đệm bicarbonate pH 9 [9], [10], [14], và hệ đệm tris (hydroxymethyl) aminomethane acetic pH 8.5 [7]. Trong môi trường các đệm này, dansyl chloride ít bị thủy giải nên cần phân hủy thuốc thử dư với NaOH [14] hay với borate [7]. Để dịch cân bằng theo thướng tạo thành dạng II, chúng tôi chọn khảo sát hệ đệm borate pH 9 vì hệ đệm này có khả năng cho liên kết hydrogen với điện tử tự do của tâm nitrogen và oxygen trên phân tử thuốc thử dansyl chloride, và so sánh với hệ đệm truyền thống bicarbonate pH 9. Khi này thuốc thử pha trong acetone với nồng độ 0.5 % (w/v) vì borate rất ít tan trong ACN [5]; còn các thông số khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng được giữ nguyên theo mục 3.1.1. Kết quả cho thấy việc sử dụng hệ đệm borate làm tăng một cách đáng kể chiều cao các mũi, với hiệu suất chuyển hóa tăng gấp 4 lần (xem hình 3.3). Hơn nữa, đệm 35 Hình 3.3a: Sắc ký đồ của 11 dẫn xuất được tạo thành trong hệ đệm 0.1 M NaHCO3, pH 9 Hình 3.3b: Sắc ký đồ của 11 dẫn xuất được tạo thành trong hệ đệm 0.2 M Na2B4O7, pH 9 borate có khả năng tự dừng phản ứng, do dansyl chloride còn lại có thể phản ứng thủy phân hoàn toàn với nước trong vòng 30 phút. Điều này thể hiện sự tăng tính thân điện tử của thuốc thử dansyl chloride. Vì thế không cần dùng thêm chất dừng phản ứng như với đệm bicarbonate. Vậy, hệ đệm borate được chọn cho các thí nghiệm sau. 3.1.2.2. Nồng độ đệm borate Nếu hệ đệm có khả năng liên kết hydrogen như giả thiết ở phần trên, thì tốc độ và độ chuyển hóa của phản ứng dansyl hóa amino acid sẽ đi qua cực đại, và phản ứng thủy giải thuốc thử sẽ tăng theo nồng độ đệm. Giá trị 0.2 M dùng trong khảo sát ở mục 3.1.2.1 là nồng độ bão hòa của borate trong nước, thường được dùng trong phản ứng dansyl hóa các amine [5]. Do đó, trong phần khảo sát này, ta tiến hành giảm dần nồng độ borate từ 0.2 M xuống 0.05 M, không giảm hơn 0.05 M vì phải bảo đảm đệm năng của môi trường phản ứng; còn các thông số khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ thuốc thử giống với mục 3.1.1. Kết quả cho thấy độ chuyển hóa của các amino acid gần như không đổi trong khoảng nồng độ khảo sát; mặc dù tốc độ thủy phân của thuốc thử có giảm ở nồng độ đệm thấp (trên 30 phút với nồng độ 0.05 M). Kết quả này có thể là do độ tan của borate vào hệ dung môi acetone-nước (1:1, v/v) chỉ khoảng 0.05 M; hoặc có thể do borate có liên kết hydrogen với nhóm amino trên amino acid. Do đó, cần khảo sát 36 thêm độ phân cực của môi trường phản ứng. Vậy, nồng độ đệm 0.2 M được chọn cho các thí nghiệm sau. 3.1.2.3. Tỷ lệ thể tích dung môi acetone và hệ đệm Do bị hạn chế về độ tan của borate nên muốn tăng nồng độ borate, ta phải tăng tỉ lệ nước trong môi trường phản ứng. Tuy nhiên, khi thay đổi tỉ lệ dung môi acetone và đệm Na2B4O7, ta làm thay đổi độ nhớt, hằng số điện môi, độ phân cực, khả năng hòa tan các amino acid và cả thuốc thử dẫn đến sự thay đổi cân bằng phản ứng. Ở đây, chúng tôi tiến hành khảo sát các tỷ lệ thể tích giữa acetone và đệm lần lượt là (3:1), (1:1) và (1:3), trong khi các thông số khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ thuốc thử giống với mục 3.1.1. Khảo sát cho thấy độ chuyển hóa của phản ứng dansyl hóa tăng theo nồng độ borate và độ phân cực của môi trường phản ứng (tăng tỉ lệ đệm), (xem hình 3.4). Điều này khẳng định thêm cho giả thiết về liên kết hydrogen giữa đệm và thuốc thử. Khi đi từ tỉ lệ thể tích (3:1) qua (1:1) và đến (1:3) của acetone-đệm, độ chuyển hóa của phản ứng dansyl hóa amino acid có khuynh hướng tăng chậm dần, điều này có thể do tính thân hạch của nhóm amino trên amino acid bị giảm thiểu. Mặt khác, hệ acetone-đệm (1:1, v/v) dễ hòa tan thuốc thử dansyl chloride hơn hệ acetone-đệm (1:3, v/v). Vì vây, hệ dung môi acetone-đệm borate (1:1, v/v) được chọn sử dụng cho các phần khảo sát tiếp theo. Hình 3.4: Độ chuyển hóa theo thành phần hệ dung môi của phản ứng 37 3.1.2.4. pH của phản ứng dansyl hóa Khi chúng ta dùng hệ đệm có khả năng ảnh hưởng đến tính thân điện tử của thuốc thử và tính thân hạch của amino acid, giá trị pH cần khảo sát lại. Bởi vì, đối với phản ứng dansyl hóa amino acid, giá trị pH là yếu tố quan trọng và cần giữ cố định trong suốt thời gian phản ứng. Khi pH quá thấp, nhóm amino trên amino acid bị proton hóa; còn khi pH quá cao ion OH- sẽ cạnh tranh phản ứng với dansyl chloride tạo thành Dns-OH. Để khảo sát pH, chúng tôi thực hiện phản ứng dansyl hóa trong môi trường đệm 0.2 M borate với các pH khác nhau. Các thông số khác như hệ đệm, tỉ lệ dung môi được cố định tại các điểm tối ưu vừa kết luận; còn các thông số khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ thuốc thử giống với mục 3.1.1. Kết quả khảo sát (xem hình 3.5) cho thấy với các amino acid có nhiều nhóm phân cực (như nhóm –COOH hoặc nhóm –OH) trên mạch nhánh, R (như Arg, Asp, Glu, Thr), diện tích mũi dansyl amino acid giảm mạnh khi tăng giá trị pH của môi trường phản ứng. Có thể lý giải hiện tượng này như sau: khi có các nhóm rút điện tử ở mạch nhánh, tính thân hạch của nhóm amino sẽ yếu đi, do đó chúng không thể cạnh tranh với ion OH- tại pH cao. Tuy nhiên, với các amino acid có phần kém phân cực lớn (không có các nhóm phân cực trên mạch nhánh như Leu, Val, Ala, Aba) diện tích mũi giảm mạnh khi giảm pH phản ứng. Điều này là do tính baz của nhóm amino trên các amino acid này khá mạnh nên bị proton hóa nhiều hơn khi pH giảm. Vì vậy, pH 9 phù hợp cho nhiều amino acid nhất (diện tích các mũi tương đối đồng đều) nên giá trị pH 9 được chọn cho các thí nghiệm sau. Hình 3.5: Độ chuyển hóa theo pH của hệ đệm dùng trong phản ứng 38 . 3.1.2.5. Nồng độ thuốc thử dansyl chloride Sau khi đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến cơ chế phản ứng, chúng tôi tiếp tục khảo sát lại các yếu tố khác của phản ứng dansyl hóa amino acid như nồng độ thuốc thử, nhiệt độ, và thời gian phản ứng. Thực hiện phản ứng dansyl hóa 11 amino acid trong hệ dung môi acetone-đệm 0.2 M borate pH 9 (1:1, v/v) với nồng độ thuốc thử thay đổi từ 0.25 % đến 1.0 % (w/v) pha trong acetone; còn các thông số khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng giống với mục 3.1.1. Kết quả khảo sát (xem hình 3.6) nồng độ 0.5 % (w/v) là thích hợp nhất vì diện tích các mũi dẫn xuất khá đồng đều và đường nền ít mũi tạp. Tại nồng độ 0.25 % (w/v), có tình trạng thiếu thuốc thử, dẫn đến độ nhạy của các mũi khác nhau. Tuy nhiên, tại nồng độ 1.0 % (w/v), có dấu hiệu dư thuốc thử vì đường nền có nhiều mũi tạp. Hình 3.6: Độ chuyển hóa theo nồng độ thuốc thử của phản ứng 3.1.2.6. Nhiệt độ tiến hành phản ứng dansyl hóa Khi tăng nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng giảm, nhưng có thể bị cạnh tranh bởi các phản ứng khác. Trong nhiều tài liệu như [11], [14], thường chọn nhiệt độ tối ưu cho phản ứng dansyl hóa các amino acid là 60 oC với thời gian phản ứng khoảng 30 phút. Tuy nhiên, hiện nay có nhiều công bố thực hiện phản ứng dansyl hóa trên các hệ thống online với thời gian tối ưu chỉ vài phút [5]. Vì vậy, khi áp dụng hệ đệm borate (hệ đệm có khả năng thủy giải thuốc thử) vào phản ứng dansyl hóa các amino acid, yếu tố nhiệt độ cần được khảo sát để tìm hiểu khả năng của hệ đệm này 39 có thể thực hiện trên các hệ thống online với thời gian vài phút hay không. Ở thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng ở hai điều kiện nhiệt độ: một là 60 oC với thời gian dừng phản ứng là 30 phút; và hai là 100 oC với thời gian dừng phản ứng là 2 phút. Các thông số khác như hệ đệm, pH, tỉ lệ dung môi, nồng độ thuốc thử được cố định tại các điểm tối ưu vừa kết luận. Kết quả cho thấy tại nhiệt độ 60 oC các mũi dẫn xuất thu được có độ nhạy tương đối đều nhau, và các mũi tạp ít xuất hiện. Ở 100 oC, độ nhạy các mũi dẫn xuất giảm, đặc biệt là Dns-Leu (xem hình 3.7). Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở nhiệt độ cao có sự cạnh tranh mạnh giữa ion OH- của môi trường đệm borate và nhóm amino của amino acid, làm cho phản ứng dansyl hóa bị dừng lại sớm. Qua đó, chúng tôi đi đến kết luận nhiệt độ phản ứng tối ưu vẫn nằm trong khoảng 60 oC, và nhiệt độ này được chọn cho các thí nghiệm phía sau. Tuy nhiên, phản ứng dansyl hóa có thể thực hiện online tại nhiệt độ cao, nhưng cần nghiên cứu thêm ví dụ như giảm nồng độ đệm hay tăng nồng độ thuốc thử dansyl chloride. Hình 3.7: Sắc ký đồ của 11 dẫn xuất được tạo thành tại 100 oC trong hệ đệm 0.2 M Na2B4O7, pH 9 3.1.2.7. Thời gian tiến hành phản ứng Theo các tài liệu tham khảo [9], [11], [14] , thời gian tối ưu cho phản ứng dansyl hóa các amino acid khoảng 30 phút. Vì vậy, trong phần này, chúng tôi thử tiến hành khảo sát các thời gian dài hơn 30 phút, nhằm khẳng định giả thiết tự dừng phản ứng, như đã nêu trên (xem mục 3.1.2.1). Các thông số khác như hệ dung môi (thành phần 40 đệm), pH, nồng độ thuốc thử, nhiệt độ được cố định tại các điểm tối ưu vừa kết luận. Kết quả thực nghiệm (xem hình 3.8) cho thấy khi tăng thời gian phản ứng, độ chuyển hóa không tăng nhiều. Điều này là do thuốc thử đã bị thủy phân gần như hoàn toàn trong vòng 30 phút; nên không cần tác nhân dừng phản ứng. Hình 3.8: Độ chuyển hóa theo thời gian tạo dẫn xuất  Kết luận điều kiện tối ưu cho phản ứng dansyl hóa amino acid với hệ đệm borate: • Nồng độ đệm borate: 0.2 M • pH hệ đệm: 9.0 • Nồng độ thuốc thử: 0.5 % (w/v) • Hệ dung môi: acetone-dung dịch 0.2 M borate (1:1, v/v) • Nhiệt độ phản ứng: 60 oC • Thời gian phản ứng: 30 phút • Nguyên nhân chính dẫn đến sự tăng đột biến về độ chuyển hóa của phản ứng dansyl hóa amino acid trong hệ đệm borate, có thể được quy cho khả năng tạo liên kết hydrogen của borate lên nhóm sulfonyl mạnh hơn lên các tâm nitrogen của amino acid. N S+ H3C H3C O- O Cl H O B O O O H H H H O B O O O H H H 41 3.2. NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH CÁC DẪN XUẤT DANSYL AMINO ACID TRÊN CỘT PHA ĐẢO Kỹ thuật triệt ion (hay điều chỉnh mức độ ion hóa) đã được vận dụng để phân tách vài chục amino acid từ những năm 1990. Nhưng, một số vấn đề vẫn tồn tại cho đến ngày nay như thời gian lưu của Asp và Glu còn quá thấp, các cặp Thr và Gly, Arg và Ala,… không phân tách hoàn toàn (xem hình 1.6, trang 23) [11]. Mặt khác, cho đến bây giờ, kỹ thuật ghép cặp ion (hay trao đổi ion động học) vẫn chưa đủ khả năng để phân tách đồng thời trên 20 amino acid. Đây là vấn đề làm cho các nhà sản xuất cột sắc ký hướng đến các cột đa cơ chế (vừa pha đảo, vừa trao đổi ion) để hỗ trợ cho kỹ thuật triệt ion trong phân tách các amino acid. Tuy nhiên, theo lý thuyết (xem mục 1.4), hai kỹ thuật triệt ion và ghép cặp ion có thể chuyển đổi qua lại tùy theo pH và hàm lượng dung môi hữu cơ của pha động. Năm 2008, Tomasz Baczek đã báo cáo các lợi thế của chế độ rửa giải theo chương trình biến đổi pH pha động trong phân tách các peptide nhỏ [2]. Vì vậy, chúng tôi định hướng kết hợp hai kỹ thuật ghép cặp ion và triệt ion thông qua một chương trình rửa giải có sự biến đổi pH pha động trên cột pha đảo (C18). Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất dansyl hóa cho các amino acid chuNn tại các điều kiện tối ưu như đã chọn ở mục 3.1. Do phải phân tách trên 20 amino acid có tính chất biến đổi rất phức tạp, nên chúng tôi chia làm hai phần để khảo sát. i. Khảo sát sơ bộ để tìm ra các thông số ảnh hưởng đến khả năng phân tách các amino acid (nghĩa là tìm ra mô hình kết hợp hai kỹ thuật triệt ion và ghép cặp ion) và các khoảng tối ưu cho các thông số đó. ii. Khảo sát để tìm ra điều kiện tốt ưu cho việc phân tách trên 20 amino acid. 3.2.1. KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HỆ DUNG MÔI RỬA GIẢI Do tính chất của các amino acid biến đổi quá phức tạp, nên chúng tôi phải dùng điều kiện rửa giải theo chương trình G1 (xem bảng 3.1, trang 34), với tốc độ dòng 1 mL/phút, nhiệt độ cột phân tích 50 oC, tại bước sóng 250 nm, để tiến hành khảo sát. 42 3.2.1.1. Giá trị pH của pha động A Phần này được chia làm hai hướng một theo kỹ thuật triệt ion dùng TFA làm chất định pH; hai theo kỹ thuật ghép cặp ion dùng hệ đệm TFA/TEA làm chất định pH cho pha động A. • Thay đổi pH của pha A theo TFA Để phân tách nhiều chất cùng một lúc, ta phải khảo sát theo chiến thuật lần lượt phân tách các mũi có hệ số lưu từ thấp đến cao. Từ tài liệu tham khảo và quá trình khảo sát thực nghiệm, nhận thấy cặp dẫn xuất của Glu và Asp có hệ số lưu và hệ số tách rất kém. Nguyên nhân có thể là do giá trị pH của pha động chưa đủ thấp để ngăn chăn sự anion hóa của chúng. Do đó, độ phân giải của cặp amino acid này được chọn làm cơ sở để khảo sát khả năng phân tách theo pH của pha A. Tuy nhiên, khi pH xuống thấp sẽ dẫn đến sự đồng rửa giải của các amino acid có cùng số carbon trên mạch nhánh, ví dụ như Met và Val cùng có bốn carbon Khảo sát được thực hiện như sau: dansyl hóa Glu, Asp, Met và Val. Pha động A có thành phần TFA thay đổi như bảng 3.2, và pha động B là ACN-IPA (80:20, v/v). Kết quả cho thấy cặp Asp và Glu chỉ tách tốt và cách xa mũi thuốc thử dư ở pH < 2 (xem hình 3.9a). Điều này là do chúng có hai nhóm carboxyl trên phân tử nên cần pH thấp để triệt anion. Tuy nhiên, cặp Met và Val chỉ tách tốt khi pH > 2 (xem hình 3.9b). Kết quả này có thể giải thích như sau, vì pKaval > pKaMet >2 (xem bảng 1.1, trang 15), nên khi pH > 2 phần trăm phân ly của Met cao hơn Val, nên Met được rửa giải ra trước Val; ngược lại khi pH < 2, chúng bị triệt anion hoàn toàn nên bị đồng rửa giải vì cùng số carbon. Vậy cơ chế kiểm soát sự ion hóa bằng acid trung bình theo một số tài liệu [11], [14] là không phù hợp để phân tách các amino acid một cách hoàn toàn. Bảng 3.2 Kết quả khảo sát pH pha động A theo TFA STN Pha động A Độ phân giải (RS) Glu và Asp Met và Val TN1 0.10 % TFA 1.20 0.23 TN2 0.05 % TFA 0.85 0.31 TN3 0.01 % TFA 0.53 2.10 43 Hình 3.9a: Sắc ký đồ phân tách 4 dansyl amino acid với pha A chứa 0.1 % (v/v) TFA Hình 3.9b: Sắc ký đồ phân tách 4 dansyl amino acid với pha A chứa 0.01 % (v/v) TFA • Thay đổi pH của pha động A theo hệ đệm TEA/TFA Đứng trước tình trạng trên, chúng tôi chuyển qua kỹ thuật ghép cặp ion với thuốc thử ghép cặp ion là một loại cation lưỡng cư (amphibian) để tương tác với các nhóm carboxyl của các dẫn xuất dansyl amino acid. Các cation lưỡng cư này có thể là muối ammonium bậc bốn hay amine bậc ba bị proton hóa. Mặt khác, các dẫn xuất dansyl amino acid có nhóm 5-dimethylamino là tâm baz, có thể tạo liên kết hydrogen với nhóm silanol trên pha tĩnh, gây ra những khó khăn cho quá trình phân tách các dẫn xuất này. Trong sắc ký pha đảo, để khắc phục khó khăn này, người ta thường thêm vào pha động các chất amine baz mạnh làm chất trợ tách. Trong nhiều trường hợp, hệ đệm của triethylamine (TEA) và acid acetic được chứng tỏ là thuận lợi hơn cả. Tuy nhiên, vì acid acetic có tính acid yếu hơn các dẫn xuất dansyl amino acid nên không thể điều chỉnh mức độ ion hóa của các dẫn xuất này. Vì vậy, chúng tôi chọn hệ đệm TFA/TEA vừa làm thuốc thử ghép cặp ion, vừa làm chất che tâm silanol của pha tĩnh và định pH. Để khảo sát khả năng phân tách của hệ đệm TFA/TEA, chúng tôi thực hiện phản ứng dansyl hóa 9 amino acid (Ser, Asp, Glu, Thr, Gly, Ala, Met, Val, Leu). Pha động B là ACN-IPA (80:20, v/v), pha động A thay đổi như bảng 3.3 44 Kết quả cho thấy khi sử dụng hệ đệm TFA/TEA, pH 3.45 (TN2), khả năng tách các amino acid tăng mạnh (xem hình 3.10). Điều này chứng tỏ TEA đã hỗ trợ tách các amino acid thông qua cơ chế trao đổi ion động học, do đó tăng cường sự phân tách giữa các dẫn xuất có giá trị pKa khác nhau. Tuy nhiên, cặp Dns-Thr và Dns- Gly vẫn bị đồng rửa giải. Điều này là do thành phần IPA trong pha B còn chưa hợp lý. Bảng 3.3 Kết quả khảo sát pH pha A theo hệ đệm TFA/TEA STN Thành phần pha A Khả năng tách TN1 10 mM TFA + 9.0 mM TEA (pH 3.27) Các cặp dẫn xuất Dns-Asp/Dns-OH & Dns-Thr/Dns-Gly b