Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn gen alpha globin gây bệnh alpha thalassemia

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  30 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA ĐỂ CHẨN ĐOÁN   ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN ALPHA GLOBIN   GÂY BỆNH ALPHA THALASSEMIA  Lê Trần Hoàng Phúc*, Đỗ Thị Thanh Thủy**, Hoàng Anh Vũ**, Nguyễn Thị Băng Sương**  TÓM TẮT  Mở đầu: Bệnh thiếu máu α thalassemia  là một căn bệnh thiếu máu tan máu do di truyền khá phổ biến.  Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen α globin, đột biến gen gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin.  Việc phát hiện sớm đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa rất lớn đối với điều trị cũng như giúp chẩn đoán trước sinh  và tư vấn di truyền.   Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật Multiplex Ligation‐dependent Probe Amplification (MLPA) chẩn đoán đột  biến mất đoạn gen alpha globin.   Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 36 bệnh nhân được chẩn đoán alpha thalassemia dựa vào triệu  chứng lâm sàng và cận lâm sàng, 30 người bình thường được dùng để chuẩn kỹ thuật và làm mẫu đối chứng.  DNA của tất cả các mẫu được phân tích bằng kỹ thuật MLPA và điện di mao quản trên máy Berman Coulter.   Kết quả: Trong số 36 mẫu bệnh nhân tham gia nghiên cứu có 24 mẫu bị đột biến mất đoạn (chiếm tỷ lệ  66,67%) và 12 mẫu không mang gen đột biến (chiếm 33,33%).   Kết luận: Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen alpha globin  gây bệnh alpha thalassemia, giúp ích cho việc chẩn đoán bệnh, phát hiện các đột biến trên vùng  gen α globin, là  cơ sở vững chắc cho chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia.  Từ khóa: bệnh alpha thalassemia, MLPA, đột biến mất đoạn, gen α globin.  ABSTRACT  APPLICATION OF MLPA (Multiplex Ligation‐dependent Probe Amplification) IN DIAGNOSTIC ALPHA‐ GLOBIN GENES DELETION MUTATION CAUSING ALPHA THALASSEMIA  Le Tran Hoang Phuc, Do Thi Thanh Thuy, Hoang Anh Vu, Nguyen Thi Bang Suong   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 29 ‐ 35  Introduction: Alpha  thalassemia  is  a  blood  disorder  that  reduces  the  production  of  hemoglobin. Alpha  thalassemia  typically  results  from  deletions  involving  the α  globulin  genes  and  decreased  alpha‐globin  production.   Objectives: Multiplex ligation‐dependent probe amplification (MLPA) has been used to detect deletions and  mutations of the α‐globin gene for diagnosis of α‐thalassemia  Patients and Methods: Blood samples were collected from 36 thalassemia A patients. 30 samples of people  without thalassemia were used as control the experiments. MLPA assay were performed using SALSA MLPA  P140 HBA probe mix (MRC ‐ Holland) Kit.   Results: We report 24 (66.67%) deletion mutants and 12 (33.33%) cases without deletions on α‐globin  gene.   Conclusion: MLPA were applied successfully in identification of deletion mutants on α‐globin genes and in  * Khoa sinh‐ Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh  ** Trung tâm Y sinh học Phân tử‐ Đại học Y Dược TP.HCM  Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0914007038, Email: suongnguyenmd@gmail.com.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 31 diagnostic α thalassemia.   Keywords: alpha thalassemia, MLPA, deletion, α‐globin genes.   ĐẶT VẤN ĐỀ  Bệnh  thiếu máu  alpha  thalassemia  là một  căn bệnh  thiếu máu  tan máu do di  truyền khá  phổ  biến,  đây  là  rối  loạn  di  truyền  đơn  gen  thường gặp nhất, bệnh di  truyền  theo quy  luật  alen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Thalassemia  được phát hiện  ở 60 nước,  tỷ  lệ mắc bệnh  cao  nhất  ở vùng  Địa Trung Hải,  vùng Bắc  và Tây  Phi, Trung Đông, Nam Á và Đông Nam Á. Mỗi  năm, trên thế giới có khoảng 100.000 em bé sinh  ra  mắc  bệnh.  Các  nhà  khoa  học  tiên  đoán  thalassemia sẽ trở thành bệnh lý toàn cầu(18).  Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen α  globin,  đột  biến  gen  gây  giảm  hoặc mất  tổng  hợp chuỗi α globin, trong khi đó quá trình tổng  hợp chuỗi beta globin vẫn diễn ra bình thường.  Ở người bình  thường  2  loại  chuỗi  α globin và  beta globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, như  vậy bệnh nhân alpha  thalassemia  sẽ có  sự mất  cân bằng giữa các chuỗi globin. Loại chuỗi beta  globin trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ  tích  tụ  trong  tế bào hồng  cầu và gây phá hủy  hồng  cầu(17).  Bệnh  nhân  cần  phải  được  truyền  máu thường xuyên, có thể gây ra các biến chứng  khác  như:  lá  lách  to,  sỏi  mật,  tăng  nguy  cơ  nhiễm  trùng, vàng da, Đặc biệt  thai nhi mắc  Hemoglobin Bart  (alpha  thalassemia  thể  nặng)  thì  phù  nhau  thai,  gan  lách  to,  thai  chết  lưu  trong  tử  cung hoặc  chết  sớm  sau  sinh. Vì vậy,  việc phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa  rất lớn đối với điều trị cũng như giúp chẩn đoán  trước sinh và tư vấn di truyền.  Gen  α globin nằm  trên  cánh ngắn NST 16,  mỗi nhiễm  sắc  thể mang  2 gen  α globin. Như  vậy chuỗi α globin được tổng hợp từ 4 gen trên  nhiễm  sắc  thể  16.  Đột  biến  gây  bệnh  α  thalassemia  chủ yếu  là  đột biến mất  đoạn,  đột  biến có thể ảnh hưởng đến 1, 2, 3 hoặc cả 4 gen α  globin  và  gây  nên  kiểu  hình  nặng  dần  tương  ứng với số gen α globin bị đột biến(15). Nếu đột  biến gây mất một phần hoặc toàn bộ một gen α  thì sẽ gây dạng α+ thalassemia. Nếu đột biến mất  cả  2  gen  trên  cùng  allele  thì  sẽ  gây  dạng  α0  thalassemia(3).  Ở Việt Nam  đột  biến mất  đoạn  gây bệnh alpha thalassemia thường gặp là dạng  ‐‐SEA  (Đông Nam Á), dạng  ‐α4.2  và dạng  ‐α3.7.  Phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa rất  lớn  đối với  điều  trị  cũng như  giúp  chẩn  đoán  trước sinh và tư vấn di truyền. Các kỹ thuật sinh  học phân tử thường được sử dụng để xác định  đột  biến  ở  bệnh  nhân  thalassemia  là  kỹ  thuật  PCR đơn mồi, PCR đa mồi, Gần đây, kỹ thuật  MLPA  (Multiplex  Ligation‐dependent  Probe  Amplification) ra đời và được áp dụng rộng rãi  trong chẩn đoán mất đoạn và lặp đoạn gen nói  chung hay bệnh alpha thalassemia nói riêng. Kỹ  thuật MLPA có ưu điểm là dễ thực hiện, cho kết  quả nhanh và  có  độ  chính  xác  cao(1). Kỹ  thuật  này còn giúp chẩn đoán được kiểu gen dị hợp  tử. Vì vậy mà chúng tôi thực hiện đề tài này với  mục  tiêu:  Ứng  dụng  kỹ  thuật MLPA  giúp  chẩn  đoán  đột  biến mất  đoạn  gen  alpha  globin  gây  bệnh  alpha thalassemia.  ĐỐI TƯỢNG ‐PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  ‐  Nhóm  nghiên  cứu:  36  bệnh  nhân  được  chẩn  đoán  alpha  thalassemia  dựa  vào  triệu  chứng lâm sàng và cận lâm sàng.  ‐  Nhóm  chứng:  30  người  bình  thường.  Được dùng để chuẩn kỹ thuật và làm mẫu đối  chứng để  tiến hành kỹ  thuật MLPA cùng với  mẫu bệnh nhân.  Phương pháp nghiên cứu  Kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu máu ngoại vi   Máu  tươi  được  chống  đông  bằng  EDTA,  được  tách  trong  vòng  24  giờ.  Quy  trình  tách  chiết  DNA  từ  200μl  máu  ngoại  vi  được  tiến  hành  theo QiAgen Kit. Đo nồng  độ và  độ  tinh  sạch của ADN, những mẫu có giá trị tỷ lệ về mật  độ quang đo ở bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 mới  được sử dụng để tiến hành phản ứng MLPA.   Phản ứng MLPA  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  32 Sử  dụng  Kit  SALSA  MLPA  P140  HBA  probemix  (MRC  ‐ Holland)  chứa  các  probe  lai  đặc  hiệu  với  các  vùng  trên  gen  alpha  globin,  ngoài  ra  còn  có  9  đoạn  nội  chuẩn  giúp  kiểm  chuẩn  phản  ứng  PCR.  Quy  trình  phản  ứng  MLPA  như  sau:  Phản  ứng  lai:  40  ng  genomic  ADN (hòa trong 2,5 μl) được biến tính và lai với  1,5  μl  hỗn  hợp  probe  cùng  với  1,5  μl  buffer  MLPA. Sau đó lai ở 60°C trong vòng 16 giờ (qua  đêm). Phản ứng nối: Cho enzym ligase vào và ủ  ở 54°C trong 15 phút. Sau đó  tăng nhiệt độ  lên  98°C  trong 5 phút để phá hủy enzym  ligase và  tiến  hành  thực  hiện  quy  trình  nhiệt  của  phản  ứng  PCR  để  khuếch  đại  các  probe.  Phản  ứng  PCR: Tăng  nhiệt  độ  lên  60oC  trước  khi  đi  vào  chu trình nhiệt. Thành phần phản ứng PCR gồm  primer, polymerase, buffer, dNTP, nước. Chu kỳ  nhiệt:  90°C  trong  20  giây,  65°C  trong  30  giây,  72°C trong 60 giây, lặp lại 35 chu kỳ. Sau đó kéo  dài  kết  thúc  ở  72oC  trong  20 phút. Cuối  cùng,  nhiệt  độ được hạ xuống  còn 4oC. Điện di mao  quản  và  phân  tích  kết  quả: Tiến  hành  điện di  mao quản trên máy Beckman Coulter. Sử dụng  phần  mềm  GeneMarker  v1.92  (Softgenetics,  State College, PA)  để phân  tích kết quả và xác  định đột biến mất đoạn gen alpha globin. Chiều  cao đỉnh các probe phản ánh nồng độ của chúng  (hay  nồng  độ  đoạn  gen  tương  ứng  gắn  với  probe)  trong  sản  phẩm  PCR.  Từ  đó  chiều  cao  probe của mẫu bệnh nhân được so sánh với mẫu  đối chứng (người bình thường) để phát hiện đột  biến mất đoạn gen α globin. Phân tích việc khảo  sát  các probe khuếch  đại gen  α globin:  trường  hợp bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn gen  α  globin  thì  tỷ  lệ  chiều  cao  đỉnh  probe  tương  ứng của bệnh nhân/mẫu đối chứng xấp xỉ bằng  1. Nếu chiều cao đỉnh probe của bệnh nhân/mẫu  đối chứng giảm còn khoảng 0,75 thì bệnh nhân  bị  đột  biến mất  1  gen  α  globin, nếu  giảm  còn  khoảng 0,5 thì bệnh nhân bị đột biến mất 2 gen  α globin, nếu giảm còn 0,25 thì bệnh nhân bị đột  biến mất 3 gen α globin.  KẾT QUẢ  Kết quả của bệnh nhân HBA10  Hình 1. Kết quả phân tích gen alpha thalassemia bệnh nhân HBA10. Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân HBA10.  Nhận xét: tỷ lệ chiều cao đỉnh probe của bệnh  nhân/mẫu đối chứng ở các probe có số thứ tự 20,  21 có giá  trị gần bằng 1. Trong khi đó  tỷ  lệ các  probe có số thứ tự 1, 2, 3, 5, 12, 14, 18, 24, 25 có  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 33 giá trị xấp xỉ 0,5. Các chỉ số này phù hợp với chỉ  số mong đợi về các dạng đột biến SALSA MLPA  promix P140‐B4 HBA  đưa  ra và chứng  tỏ mẫu  HBA10 có đột biến gây bệnh thalassemia dạng ‐‐  SEA/αα.  Kết quả của bệnh nhân HBA30  Hình 2. Kết quả phân tích gen alpha thalassemia bệnh nhân HBA30. Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân HBA30.  Nhận  xét:  Tỷ  lệ  chiều  cao  đỉnh  probe  của  bệnh nhân/mẫu đối chứng ở các probe có số thứ  tự 11, 17, 18, 20, 21 có giá trị gần bằng 1. Trong  khi đó  tỷ  lệ probe có số  thứ  tự 12, 14 có giá  trị  xấp xỉ 0,5 và tỷ lệ probe có số thứ tự 24 có giá trị  xấp xỉ 0,75 Các  chỉ  số này phù hợp với  chỉ  số  mong  đợi về  các dạng  đột biến SALSA MLPA  promix P140‐B4 HBA  đưa  ra và chứng  tỏ mẫu  HBA30 có đột biến gây bệnh  thalassemia dạng  dị hợp ‐α4.2/αα  Kết quả của bệnh nhân HBA34  Hình 3. Kết quả phân tích gen alpha thalassemia bệnh nhân HBA34. Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân HBA34.  Nhận  xét:  Tỷ  lệ  chiều  cao  đỉnh  probe  của  bệnh nhân/mẫu đối chứng ở các probe có số thứ  tự 20, 21 có giá trị gần bằng 1. Trong khi đó tỷ lệ  các probe có số thứ tự 1, 2, 3, 5, 12, 14, 18, 24, 25  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  34 có giá trị xấp xỉ 0,5. Các chỉ số này phù hợp với  chỉ  số mong  đợi  về  các dạng  đột  biến  SALSA  MLPA promix P140‐B4 HBA đưa ra và chứng tỏ  mẫu HBA10  có  đột biến gây bệnh  thalassemia  dạng ‐‐ SEA/αα.  Tỷ lệ đột biến mất đoạn ở bệnh nhân alpha  thalassemia  Bảng 1: Tỷ lệ đột biến mất đoạn ở bệnh nhân alpha  thalassemia  Bệnh nhân Số mẫu (n) Tỷ lệ (%) Không đột biến mất đoạn 12 33.33 Bị đột biến mất đoạn 24 66.67 Tổng số 36 100 Bảng 2: Sự phân bố vị trí bị mất đoạn của gen alpha  thalassemia  Đột biến Số lượng bệnh nhân Tỷ lệ % Mất đoạn SEA 13 54.17 Mất đoạn – α3.7 8 33.33 Mất đoạn –α4.2 3 12.50 Tổng số 24 100 Nhận xét: Trong số 36 mẫu bệnh nhân tham  gia nghiên cứu có 24 mẫu bị đột biến mất đoạn  (chiếm tỷ lệ 66,67%) và 12 mẫu không mang gen  đột biến (chiếm 33,33%).  Trong số 24 mẫu bị đột biến mất đoạn có 13  mẫu mất đoạn SEA (chiếm 54,17%), 8 mẫu mất  đoạn – α3.7 (chiếm 33,33%) và 3 mẫu mất đoạn – α4.2 (chiếm 12,50%).  BÀN LUẬN  Phát hiện sớm bệnh thalassemia có thể giúp  điều trị sớm, tránh các biến chứng của bệnh và  nguy  cơ  tử  vong.  Đột  biến  gây  bệnh  alpha  thalassemia  thường  gặp  là  đột  biến mất  đoạn  gen alpha globin nên các kĩ thuật sinh học phân  tử thường được sử dụng để xác định đột biến ở  bệnh  nhân  thalassemia  là  multiplex  PCR,  HPLC(2,9). Gần đây, kỹ thuật MLPA ra đời và  được  áp  dụng  rộng  rãi  trong  chẩn  đoán mất  đoạn gen gây bệnh alpha thalassemia với nhiều  ưu điểm  là dễ thực hiện, cho kết quả nhanh và  có độ chính xác cao(1).  Trong kết quả của kỹ thuật MLPA, mỗi một  đỉnh tín hiệu (peak) thể hiện sản phẩm của một  probe  (khi một probe nào đó bắt cặp được với  trình  tự DNA  đích, nối  lại  được  thì mới  được  khuếch  đại và xuất hiện  tín hiệu)(16). Chiều  cao  của mỗi peak cho thấy sự liên quan với số lượng  bản  sao  (copy)  của  trình  tự DNA  bổ  sung  với  probe(12). Nếu bệnh nhân bị đột biến mất đoạn cả  4 gen α globin thì không có hiện tượng lai probe,  không  tạo  thành đoạn dò hoàn chỉnh và probe  đó sẽ không được khuếch đại, do đó khi điện di  mao  quản  sẽ  không  thấy  xuất  hiện  đỉnh  của  probe. Tuy  nhiên,  đột  biến  này  thường  không  gặp trong thực tế vì thai chết lưu trong tử cung.  Nếu  tỷ  lệ  chiều  cao  của  probe  mẫu  bệnh  nhân/mẫu  chứng  xấp  xỉ  là  0,75‐0,80  thì  bệnh  nhân mang đột biến mất đoạn tại probe đó ở 1  trong 4 gen α globin, nếu tỷ lệ này xấp xỉ bằng  0,35‐0,5 chứng  tỏ bệnh nhân mất đoạn 2 gen α  globin và mếu  tỷ  lệ  là 0,25 nghĩa  là bệnh nhân  mất đoạn 3 trong 4 gen α globin.   Trong kết quả MLPA của bệnh nhân HBA30  thể hiện trong hình 2, tỉ lệ probe số 24 có giá trị  gần bằng 0.75 mà không phải là 0.5. Lý giải điều  này,  theo  kit  SALSA  MLPA  promix  P140‐B4  HBA mà MRC‐Holland hướng dẫn thì probe số  24  dò  tìm  trình  tự  exon  3  ở  cả  2  gen HBA1,  HBA2 nên tỉ lệ điển hình cho đột biến mất đoạn  ‐α4.2/αα, ‐α3.7/αα là 0,75  Dựa vào bảng các dạng  đột biến mất  đoạn  gen HBA thường gặp và tỉ lệ chiều cao đỉnh của  các  probe  mà  SALSA  MLPA  promix  P140‐B4  HBA  (MRC‐Holland)  đưa  ra, kết hợp với hình  ảnh chiều cao các đỉnh (trong hình 1, 2, 3: màu  nhạt ‐bên trái là mẫu đối chứng; màu đậm ‐bên  phải là mẫu bệnh nhân), cũng như số liệu về tỉ lệ  chiều  cao  các  đỉnh  trong  hình  ảnh MLPA  của  mỗi mẫu nghiên cứu, cho thấy việc xác định kết  quả dạng  đột biến  alpha  thalassemia mà bệnh  nhân  mắc  phải  hoàn  toàn  phù  hợp  với  triệu  chứng  lâm  sàng  và  cận  lâm  sàng mà  họ  biểu  hiện. Qua kết quả  thu  được  từ 36 mẫu nghiên  cứu, chúng tôi thấy rằng đột biến mất đoạn gen  alpha  globin  gây  bệnh  alpha  thalassemia  khá  phổ  biến  ở  Việt  Nam  với  các  dạng  đột  biến  thường gặp là dạng ‐‐SEA (Đông Nam Á), dạng  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 35 –  α3.7  và dạng  –α4.2. Trong  đó,  đột  biến  có  tần  suất  cao  nhất  la  đột  biến  –SEA  chiếm  54,17%;  tiếp theo là đột biến dạng – α3.7chiếm 33,33% và  cuối cùng là đột biến dạng –α4.2chiếm 12,5%.  Lý Thị Thanh Hà (2010) đã nghiên cứu ứng  dụng kỹ  thuật Multilex PCR và C‐ARMS PCR  trong  chẩn  đoán  trước và  sau  sinh bệnh alpha  thalassemia  tại  Bệnh  Viện  Nhi  Trung  Ương.  Trong kết quả nghiên cứu này có 58.8% đột biến  dạng  –SEA(11).  Theo  Lin M  (2013)  thì  ở  vùng  Meizhou  miền  Nam  Trung  Quốc  (7),  đột  biến  dạng  ‐‐SEA  là khoảng 46.45%, mất đoạn – α3.7  là 7%, mất  đoạn  –α4.2  là  5%. Tác giả Liu SC(8)  (2011)  nghiên  cứu  về  các  bệnh  liên  quan  đến  Hemoglobin  tại  Đài  Loan,  ông  cho  rằng  dạng  đột  biến  thường  gặp  nhất  của  bệnh  alpha  thalassemia  là  đột  biến  dạng  SEA  (Southeast  Asian) với  tần số 87,79%, đột biến dạng – α3.7  chiếm 4,85%, đột biến dạng – α4.2 chiếm 1,41%.  Một nghiên cứu khác của tác giả Wu JY(20) (2004)  thì ở miền Nam Trung Quốc tần số đột biến gen  alpha globin như sau: dạng ‐‐SEA chiếm 68,9%,  – α3.7 chiếm 10,3%, đột biến dạng – α4.2 chiếm  5,52%. Theo Hung CC(4) (2007) thì ở Đông Nam  Á tỉ lệ đột biến dạng SEA chiếm tỉ lệ 45%, dạng –  α3.7  chiếm  35%,  đột  biến  dạng  –  α4.2  chiếm  20%. Cùng với nhiều nghiên cứu khác như của  Pan HF  (2007), Xiong F  (2010)(14, 21)  thì dạng đột  biến phổ biến nhất ở Đông Nam Á là –SEA theo  sau là đột biến dạng – α3.7 và –α4.2, các kết quả  của chúng tôi tương tự như nghiên cứu của các  tác  giả  khác  về  sự  phổ  biến  của  các dạng  đột  biến thường gặp của alpha thalassemia.   Qua các số  liệu đó, chúng tôi thấy rằng đột  biến dạng  ‐‐SEA  chiếm  tỉ  lệ  rất  cao  ở khu vực  Đông Nam Á, tiếp theo là dạng – α3.7. Điều này  hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của  chúng  tôi. Sự khác biệt về  tần số  của các dạng  đột biến này trong các nghiên cứu có thể là mặc  dù alpha  thalassemia có mặt  trên  toàn  thế giới,  nhưng sự phân bố rất khác nhau giữa các quần  thể người, giữa các dân tộc khác nhau, do sự đa  dạng di truyền giữa các cá nhân, tần số đột biến  có thể thay đổi từ sự gia tăng các cuộc hôn nhân  giữa nước này với nước khác  (như giữa người  Đài  Loan  và  những  người  nhập  cư  gốc  Đông  Nam Á), sự khác nhau trong quá trình thu thập  mẫu nghiên cứu (với nghiên cứu này, chúng tôi  đã thu mẫu từ những bệnh nhân đến khám  tại  bệnh viện dựa vào những triệu chứng lâm sàng,  cận lâm sàng và tiến hành kiểm tra), quan trọng  là tần số đột biến thay đổi tùy thuộc vào dân số,  thời gian nghiên cứu.  Trong số 36 mẫu bệnh nhân được chẩn đoán  mắc bệnh  α  thalassemia, bằng kỹ  thuật MLPA  chúng tôi phát hiện được 24 bệnh nhân cò mang  đột biến mất đoạn. 12 bệnh nhân còn lại không  phát hiện được đột biến mất đoạn, những bệnh  nhân này có thể mang đột biến điểm, và những  đột  biến  này  không  được  phát  hiện  bằng  phương  pháp  MLPA  mà  phải  sử  dụng  các  phương  pháp  như  giải  trình  tự  gen,  phương  pháp RFLP, STR  KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  đã  ứng  dụng  thành  công  kỹ  thuật MLPA  để  chẩn  đoán  đột  biến mất  đoạn  gen  alpha  globin  gây  bệnh  alpha  thalassemia.  Việc xác định các kiểu đột biến  gen alpha globin  thường gặp ở Việt Nam giúp cho chúng ta có cái  nhìn  bao  quát  về  tình  hình  bệnh  alpha  thalassemia tại nước ta, để có những dẫn chứng,  dữ  liệu cho các nghiên cứu  tiếp  theo cũng như  giúp  ích cho việc dự báo, chẩn đoán, phát hiện  sớm và điều trị được chính xác, hiệu quả hơn, là  cơ sở vững chắc cho chẩn đoán trước sinh bệnh  alpha Thalassemia.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Cao M, Liu  Z, Jia  X, Tang N, Cai  R, Wang  L, Chen  C, Xiao  B, Wang  J  and  Liu  J  (2011).“Detection  of  α‐globin  gene  deletions  using  denaturing  high‐performance  liquid  chromatography  and  multiplex  ligation‐dependent  probe  amplification”,  Journal  of  clinical  laboratory  analysis,  25(6),  pp. 426‐431.  2. Chong  SS,  Boehm  CD, Higgs  DR  and  Cutting  GR  (2000),  “Single‐tube multiplex  ‐ PCR  screen  for  common deletional  determinants of α –thalassemia”, Blood, 95, pp. 360 ‐ 362.  3. Elliott PV (2009), “Alpha thalassemia major ‐ new mutations,  intrauterine management, and outcomes”, Hematology, 35(1),  pp. 35 ‐ 41  4. Hung CC, Lee CN, Chen CP, Jong YJ et al. (2007), “Molecular  assay of alpha  (3.7) and alpha  (4.2) deletions  causing alpha  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học  36 thalassemia  by  denaturing  high‐performance  liquid  chromatography”, Clinical Biochemistry, 40 (11), pp. 817‐821   5. Hung CC, Su YN, Lin CY, Yang CC, Lee WT  et  al.  (2005),  “Denaturing HPLC  coupled with multiplex  PCR  for  rapid  detection of large deletions in Duchenne muscular dyst