Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 24 ‐  CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 25 ‐  2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, số 268 Lý Thường Kiệt, Quận 10, Tp.HCM. - Phòng thí nghiệm vi sinh, Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ Tp.HCM, số 547/M8 Thành Thái, P14, Quận 10, Tp.HCM. 2.1.2. Nguyên liệu - Sữa gầy. - Lactose. - Whey powder. - Giống vi khuẩn lactic: Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm ANTIBIO. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị - Dụng cụ: 9 Ống nghiệm, giá đỡ ống nghiệm. 9 Eppendorf. 9 Que cấy vòng, que cấy trải, que cấy thẳng. 9 Đĩa petri. 9 Buret. 9 Pipet. 9 Micropipet, đầu type. 9 Đũa thuỷ tinh. 9 Erlen. 9 Becher. - Thiết bị: 9 Tủ ấm. 9 Tủ sấy. 9 Nồi hấp autoclave. 9 Tủ lạnh. 9 Tủ cấy. 9 Máy đo pH. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 26 ‐  9 Máy đồng hoá cơ. 9 Máy khuấy từ. 9 Thiết bị sấy phun. 9 Máy đo độ hấp thu. 9 Kính hiển vi. 9 Cân điện tử 2 số lẻ, cân phân tích 4 số lẻ. 9 Bếp điện. 2.1.4. Môi trường và hoá chất - Môi trường MRS broth. - Môi trường MRS – agar. - Môi trường huyết thanh sữa. - Môi trường carbonate – agar . - Môi trường thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrate. - Thuốc thử Uphenmen. 2.1.5. Phương pháp xử lý số liệu - Phần mềm Excel. - Phần mềm R. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 27 ‐  2.2. Phương pháp nghiên cứu Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 28 ‐  2.2.1. Phương pháp phân lập và chọn giống vi khuẩn L.acidophilus [4, 8] - Nguyên tắc: dựa trên sự pha loãng và kết hợp với nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho vi sinh vật cần phân lập để tạo ra chủng thuần. - Cách tiến hành: 10-1 10-2 1 gram mẫu Môi trường MRS agar Môi trường MRS agar Cấy giữ giống 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hình 2.2: Quy trình phân lập và chọn giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus thuần chủng Bước 1: Phân lập 9 Pha loãng mẫu trong dung dịch nước muối sinh lý 0,85% ở các nồng độ pha loãng: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. 9 Lấy 300μl giống cấy trải trên môi trường MRS – agar. 9 Nuôi ủ trong tủ ấm ở 37oC, 24h. Bước 2: Chọn lọc giống lần 1 9 Quan sát mẫu đã phân lập. 9 Chọn khuẩn lạc mọc rời riêng rẽ. 9 Cấy ria khuẩn lạc đó trên môi trường MRS – agar. 9 Nuôi ủ trong tủ ấm 37oC, 24h. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 29 ‐  Bước 3: Chọn lọc giống lần 2 9 Quan sát và chọn khuẩn lạc mọc rời riêng rẽ. 9 Cấy ria trên môi trường MRS – agar. 9 Cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng để tiến hành giữ giống. 9 Nuôi ủ trong tủ ấm ở 37oC, 24h. 2.2.2. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của chủng L.acidophilus 2.2.2.1. Phương pháp xác định hình thái bằng cách nhuộm gram [4] - Nguyên tắc: dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chết và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod. Vi khuẩn gram dương có khả năng giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iod khi xử lý bằng cồn. Vi khuẩn gram âm không có khả năng giữ được phức chất này khi xử lý bằng cồn. - Cách tiến hành: 9 Lấy một giọt huyền phù tế bào bôi lên lam kính. 9 Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. 9 Nhuộm với tím kết tinh trong một phút. 9 Rửa lại vết bôi bằng nước cất. 9 Nhuộm với Lugol trong một phút. 9 Rửa vết bôi bằng nước cất. 9 Tẩy bằng cồn cho đến khi hết màu. 9 Rửa lại bằng nước. 9 Để khô tự nhiên và xem tiêu bản ở độ phóng đại X100. 2.2.2.2. Thử nghiệm khả năng sinh acid trên môi trường CaCO3 – agar [8] - Nguyên tắc: trong môi trường acid, CaCO3 sẽ chuyển từ dạng trắng đục sang trong. Do vậy khi tế bào vi khuẩn sinh acid và thải vào môi trường, acid sẽ tạo vòng tan xung quanh khuẩn lạc. Đường kính vòng tan càng lớn chứng tỏ khả năng sinh acid càng nhiều. - Cách tiến hành: 9 Cấy điểm giống vi khuẩn và môi trường CaCO3. 9 Nuôi ủ ở 37oC trong 24h. 9 Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện vòng tan. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 30 ‐  2.2.2.3. Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic [4] - Nguyên tắc: thuốc thử Uphemen khi tác dụng với acid lactic sẽ đổi màu từ tím sang vàng rơm. Sự đổi màu càng mạnh thì lượng acid sinh ra càng nhiều. - Cách tiến hành: 9 Nuôi ủ chủng Lactobacillus acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa ở 37oC trong 24h. Đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu lấy dịch trong và tiến hành bố trí thí nghiệm như sau: ƒ Ống nghiệm 1: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml nước cất. ƒ Ống nghiệm 2: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml môi trường không nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. ƒ Ống nghiệm 3: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml acid lactic 2%. ƒ Ống nghiệm 4: 5ml thuốc thử Uphemen + 0,7ml dịch trong môi trường nuôi vi khuẩn. 9 Quan sát và ghi nhận sự đổi màu của các ống nghiệm. ƒ (+): nếu thuốc thử chuyển sang màu vàng rơm. ƒ (–): nếu thuốc thử vẫn giữ màu xanh tím. 2.2.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbonhydrate [8] - Nguyên tắc: các vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate khác nhau để sinh trưởng. Khi vi sinh vật sử dụng nguồn carbohydrate để lên men sẽ làm giảm pH của môi trường. Do đó khả năng lên men được đánh giá bằng sự làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị pH trong môi trường. Chất chỉ thị pH sử dụng là Phenol Red có pH 7,4. chỉ thị pH của môi trường là màu đỏ sẽ chuyển sang màu vàng khi pH môi trường giảm xuống dưới 6,8. - Cách tiến hành: 9 Cấy 1ml dịch giống Lactobacillus acidophilus vào 10ml môi trường thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrate chứa trong ống nghiệm như: saccharose, maltose, dextrose, lactose, sorbitol, maltose, mannose, sorbitol, glycerol. Hàm lượng các nguồn carbonhydrate bổ sung vào môi trường là 20g/l. 9 Nuôi ủ ở 37oC trong 24h. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 31 ‐  9 Quan sát và ghi nhận sự đổi màu môi trường. Nếu môi trường chuyển sang màu vàng thì vi sinh vật sử dụng được nguồn carbonhydrate tương ứng. Nếu môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ của Phenol Red thì vi sinh vật không có khả năng sử dụng được nguồn carbonhydrate tương ứng. 2.2.2.5. Quan hệ với oxy [9] - Nguyên tắc: nguyên tố oxy có mặt trong hầu hết các thành phần quan trọng của tế bào như protein, carbonhydrate, lipid. Sự có mặt của oxy rất quan trọng đối với sự tăng trưởng của vi sinh vật. Vi sinh vật hiếu khí cần oxy cho sự tăng trưởng, ngược lại vi sinh vật kỵ khí không có khả năng sử dụng oxy do thiếu enzyme actalase làm tích tụ H2O2 làm chết tế bào. Nhiều vi sinh vật có khả năng phát triển trong điều kiện có hoặc không có oxy gọi là kỵ khí tùy tiện. - Cách tiến hành: 9 Sử dụng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus vào môi trường MRS agar chứa trong ống nghiệm (khoảng ½ ống nghiệm). 9 Nuôi ủ ở 37oC trong 24h. 9 Quan sát sự sinh trưởng và mức độ phát triển của vi khuẩn dọc theo que cấy. 2.2.2.6. Ảnh hưởng của pH [22] - Nguyên tắc: Lactobacillus acidophilus có thể sống được ở khoảng pH rất rộng, chúng có thể sống được ở pH kiềm và pH acid. Chính đặc điểm này là một trong những yếu tố giúp cho Lactobacillus acidophilus có thể sống và hoạt động tốt trong đường ruột nên thường được sử dụng để sản xuất probiotic. - Cách tiến hành: 9 Cấy 1ml dịch giống Lactobacillus acidophilus vào 10ml môi trường MRS broth chứa trong ống nghiệm ở các pH lần lượt như sau: 3,5; 4; 5; 6; 7; 8. 9 Nuôi ủ ở 37oC trong 24h. 9 Tiến hành đo OD570nm và ghi nhận kết quả. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 32 ‐  2.2.2.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ [22] - Nguyên tắc: vi sinh vật là loài rất nhạy cảm với nhiệt độ, khả năng thích nghi và phát triển của mỗi loài là khác nhau. Lactobacillus acidophilus có thể sống ở khoảng nhiệt độ 20 – 50oC. - Cách tiến hành: 9 Cấy 1ml dịch giống Lactobacillus acidophilus vào 10ml môi trường MRS broth. 9 Nuôi ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 37oC, 40oC, 50oC trong 24h. 9 Tiến hành đo OD570nm và ghi nhận kết quả. 2.2.3. Phương pháp đếm khuẩn lạc [8] - Nguyên tắc: phương pháp này cho phép xác định số tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu do các tế bào còn sống có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. - Cách tiến hành: 9 Mẫu được pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau. 9 Chọn 2 hoặc 3 nồng độ pha loãng liên tiếp mà dự kiến chứa số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc trên mỗi đĩa. Mỗi bậc pha loãng hút ra một thể tích khoảng 0,1ml đem trải đĩa. 9 Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ sau đó đem đếm số khuẩn lạc. 9 Mật độ tế bào được tính theo công thức sau: Trong đó: C (cfu/ml): số tế bào vi khuẩn trong 1 ml mẫu. N (cfu): tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa. ni: số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ i. Vi (ml): thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa. fi: độ pha loãng thứ i. Trong đó: N (cfu/ml): mật độ tế bào tại thời gian khảo sát. No (cfu/ml): mật độ tế bào ban đầu. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 33 ‐  2.2.4. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng [1] - Nguyên tắc: mật độ tế bào có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua độ đục. Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trường lỏng cản trở ánh sáng. Tế bào vi sinh vật khi hiện diện trong môi trường lỏng sẽ làm môi trường trở nên đục. Độ đục tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu. - Cách tiến hành: 9 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus trong môi trường huyết thanh sữa ƒ Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được nuôi trong môi trường huết thanh sữa với tỷ lệ giống là 10%, ở 37oC. ƒ Khoảng 2 giờ lấy ra cấy trang trên môi trường MRS agar. ƒ Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào (Cfu/ml) trong trong mẫu giống ban đầu. ƒ Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log(cfu/ml) – trục tung và thời gian – trục hoành. 9 Xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và độ đục ƒ Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được nuôi trong môi trường huyết thanh sữa với tỷ lệ giống là 10%, ở 37oC trong 15 giờ. ƒ Pha loãng dịch huyền phù chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có mật độ bất kỳ thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo OD570nm sao cho giá trị OD nằm trong trong khoảng 0,05 – 0,25. ƒ Vẽ đường tương quan tuyến tính giữa log (cfu/ml) – trục tung và OD570nm – trục hoành. Xác định khoảng tuyến tính giữa trục tung và trục hoành. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 34 ‐  2.2.5. Tối ưu hoá môi trường huyết thanh sữa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm [5] 2.2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố sinh trưởng đến sự phát triển của L.acidophilus - Yếu tố peptone: 9 Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của peptone đến sự phát triển của L.acidophilus STT Môi trường nuôi cấy Thể tích môi trường (ml) Thể tích giống cấy (ml): 10% 1 MTP1 50 5 2 MTP2 50 5 3 MTP3 50 5 4 MTP4 50 5 5 MTP5 50 5 6 MTP6 50 5 7 MTP7 50 5 Trong đó: MTP1: môi trường huyết thanh sữa (3g whey powder + 45ml nước cất). MTP2: môi trường huyết thanh sữa + 0,3g peptone. MTP3: môi trường huyết thanh sữa + 0,4g peptone. MTP4: môi trường huyết thanh sữa + 0,5g peptone. MTP5: môi trường huyết thanh sữa + 0,6g peptone. MTP6: môi trường huyết thanh sữa + 0,7g peptone. MTP7: môi trường huyết thanh sữa + 0,8g peptone. Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 35 ‐  9 Vẽ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng peptone đến sự phát triển của L.acidophilus. - Yếu tố yeast extract: 9 Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của yeast extract đến sự phát triển của L.acidophilus STT Môi trường nuôi cấy Thể tích môi trường (ml) Thể tích giống cấy (ml): 10% 1 MTY1 50 5 2 MTY2 50 5 3 MTY3 50 5 4 MTY4 50 5 5 MTY5 50 5 6 MTY6 50 5 7 MTY7 50 5 Trong đó: MTY1: môi trường huyết thanh sữa (3g whey powder + 45ml nước cất). MTY2: môi trường huyết thanh sữa + 0,05g yeast extract. MTY3: môi trường huyết thanh sữa + 0,15g yeast extract. MTY4: môi trường huyết thanh sữa + 0,25g yeast extract. MTY5: môi trường huyết thanh sữa + 0,35g yeast extract. MTY6: môi trường huyết thanh sữa + 0,45g yeast extract. MTY7: môi trường huyết thanh sữa + 0,55g yeast extract. 9 Vẽ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng yeast extract đến sự phát triển của L.acidophilus Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 36 ‐  - Yếu tố K2HPO4 9 Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của K2HPO4 đến sự phát triển của L.acidophilus STT Môi trường nuôi cấy Thể tích môi trường (ml) Thể tích giống cấy (ml): 10% 1 MTK1 50 5 2 MTK2 50 5 3 MTK3 50 5 4 MTK4 50 5 5 MTK5 50 5 6 MTK6 50 5 7 MTK7 50 5 Trong đó: MTK1: môi trường huyết thanh sữa (3g whey powder + 45ml nước cât. MTK2: môi trường huyết thanh sữa + 0,05g K2HPO4. MTK3: môi trường huyết thanh sữa + 0,075g K2HPO4. MTK4: môi trường huyết thanh sữa + 0,1g K2HPO4. MTK5: môi trường huyết thanh sữa + 0,125g K2HPO4. MTK6: môi trường huyết thanh sữa + 0,15g K2HPO4. MTK7: môi trường huyết thanh sữa + 0,175g K2HPO4. 9 Vẽ đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến sự phát triển của L.acidophilus Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 37 ‐  2.2.5.2. Tối ưu hoá môi trường huyết thanh sữa cho sự phát triển của vi khuẩn L.acidophilus bằng phương pháp quy hoạch tuyến tính - Nguyên tắc: Nhờ sự phân bố tối ưu của các điểm trong không gian yếu tố và sự biến đổi tuyến tính của các toạ độ nên khắc phục được khuyết điểm của các phương pháp phân tích hồi quy cổ điển. Sự lựa chọn phương án được quyết định bởi cách đặt bài toán nghiên cứu và những đặc điểm của đối tượng. Hoạch định thí nghiệm cho phép biến đổi đồng thời các yếu tố và thu được ước lượng định lượng các hiệu ứng cơ bản và hiệu ứng tương tác làm tăng đáng kể hiệu quả thực nghiệm. - Mục đích của phương pháo quy hoạch thực nghiệm: tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc lựa chọn thành phần tối ưu của hệ nhiều phần tử. - Cách tiến hành: 9 Xét k = 3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.acidophilus (hàm lượng peptone, hàm lượng yeast extract, hàm lượng K2HPO4). : hàm lượng peptone bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với môi trường). : hàm lượng yeast extract bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với môi trường). : hàm lượng K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết thanh sữa (% so với môi trường). 9 Ta tiến hành thí nghiệm ở n = 2 mức giá trị của các nhân tố. 9 Vậy số thí nghiệm cần thực hiện là: (thí nghiệm) 9 Hàm mục tiêu Y là sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (cfu/ml). Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 38 ‐  9 Bố trí thí nghiệm: Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm tối ưu hoá môi trường nuôi cấy L.acidophilus STT Z1 Z2 Z3 1 0,8 1,10 0,36 2 0,8 1,10 0,28 3 0,8 0,70 0,36 4 0,8 0,70 0,28 5 0,44 1,10 0,36 6 0,44 1,10 0,28 7 0,44 0,70 0,36 8 0,44 0,70 0,28 9 Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: - Phương pháp xử lý số liệu: 9 Tìm các hệ số của phương trình hồi quy theo công thức sau: 9 Thí nghiệm tại tâm phương án STT Yo Ytb (Yo – Ytb)2 Sth 1 2 3 Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 39 ‐  Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 40 ‐  Trong đó: 9 Kiểm định ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy: STT bj tj 0 1 2 3 Trong đó: Với: Tra bảng tp(f) với p = 0,05 ; f = N(k – 1) = 8(3 – 1) = 16. Sau đó so sánh với các giá trị tj. Các hệ số của phương trình hồi quy có nghĩa khi tj > tb(f). 9 Kiểm tra sự tương thích của phương trình so với thực tế: STT Y Y* (Y-Y*)2 F 1 2 3 4 Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp ‐ 41 ‐  5 6 7 8 Trong đó: Với : hệ số có nghĩa của phương trình hồi quy Tra bảng F1-p(f1,f2), sau đó so sánh với F. Nếu F < F1-p(f1,f2) thì phương trình hồi quy tương thích với thực tế. Trong đó: p là mức ý nghĩa; f1 = N – (N: số thí nghiệm; : số hệ số của phương trình hồi quy có nghĩa); f2 = số yếu tố – 1. 2.2.6. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp sấy phun [1, 13, 16] - Nguyên tắc: Sấy phun là phương pháp chuyển sản phẩm từ dạng lỏng thành dạng dạng bột. Vật liệu lỏng được bơm đến một bình phun và được phun với tốc độ cao vào trong buồng chân không. Nhiệt độ không khí xung quanh được lọc, làm nóng và được phân tán trong buồng chân không. Không khí nóng làm nước bay hơi và bột được tạo thành. Không khí bên trong buồng có thể đạt 200oC. - Cách tiến hành: 9 Chuẩn bị giống: vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được nuôi trong môi trường huyết thanh sữa sau 15 giờ. Đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu sinh khối. 9 Chuẩn bị dịch nhũ hóa: các chất nhũ hóa được bổ sung để bảo vệ vi sinh vật khỏi nhiệt độ cao của máy sấy phun cũng như thời gian, điều kiện bảo quản sau này. ƒ Mẫu 1: sữa gầy 15g/100ml nước cất + 2% lactose. ƒ Mẫu 2: sữa gầy 20g/100ml nước cất + 2% lactose. Chương 2: Nguyên liệu và phương pha