Những kiểu hình dấu ấn miễn dịch tế bào bất thường dùng đánh giá tồn lưu ác tính trong các bệnh bạch cầu cấp

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Nội Khoa 308 NHỮNG KIỂU HÌNH DẤU ẤN MIỄN DỊCH TẾ BÀO BẤT THƯỜNG DÙNG ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU ÁC TÍNH TRONG CÁC BỆNH BẠCH CẦU CẤP Nguyễn Phương Liên*, Nguyễn Tấn Bỉnh** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy để xác định những kiểu hình DAMD bất thường thích hợp cho việc đánh giá tế bào tồn lưu ác tính ở các bệnh nhân mắc các bệnh bạch cầu cấp. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả thực nghiệm lâm sàng tiến cứu. Sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang và phân tích bằng hệ thống máy FACS Canto II trên phần mềm Diva. Tiến hành nghiên cứu trên những bệnh nhân được chẩn đoán bạch cầu cấp tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học từ tháng 4/2010 đến tháng 10/2010. Kết quả: trên 80% các trường hợp bạch cầu cấp có từ 1-5 kiểu hình DAMD bất thường. Tùy vào từng nhóm bệnh BCC mà có những chiến lược chọn lựa khác nhau. Các chiến lược khả thi nhất bao gồm: sự hiện diện của các kháng nguyên khác dòng, sự xuất hiện không đồng bộ của các kháng nguyên trong cùng một dòng. Kết luận: Kỹ thuật tế bào dòng chảy có thể xác định được nhiều kiểu hình DAMD bất thường trên cùng một quần thể tế bào bạch cầu non ác tính, giúp theo dõi tồn lưu ác tính sau điều trị đạt độ chính xác cao, giảm thiểu tình trạng âm tính giả. Từ khoá: kỹ thuật tế bào dòng chảy, kiểu hình DAMD bất thường, tế bào tồn lưu ác tính, bệnh BCC, kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang, tế bào bạch cầu non. Viết tắt: DAMD: dấu ấn miễn dịch, BCC: bạch cầu cấp. ABSTRACT ABBERANT IMMUNOPHENOTYPES FOR OBSERVING MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN ACUTE LEUKEMIAS Nguyen Phuong Lien, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 308 - 313 Objective: The flow cytometric detection of minimal residual disease (MRD) in acute leukemias mainly relies on the immunophenotypic aberrancies observed or leukemia-associated phenotypes (LAP) at diagnosis. Method: Cohort - descriptive research. From April to Octorber 2010, we used many fluorescence monoclonal antibodies and analysed 191 patients on FACS Canto II with Diva software at Blood Transfusion and Hematology Hospital. Results: Over 80% cases have from 1-5 aberrant immunophentypes on the same leukemic population. Each kind of acute leukemias (B-ALL, AML), it is correspondent to some certainly choosing strategies. There are 3 most feasible strategies that are co-expression, asynchronous. Conclusion: Flow cytometry can determine the aberrant immunophenotypes for observing MRD easely and precisely on acute leukemias. Keywords: flow cytometry, immunophenotypic aberrancies, leukemia-associated phenotypes, minimal * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học, TP.HCM Tác giả liên lạc: ThS.BS. Nguyễn Phương Liên, ĐT: 0903.333.994, Email: Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 309 residual disease, acute leukemia, fluorescence monoclonal antibodies, leukemic population. ABR: MRD: minimal residual disease, ALL: acute lymphononic leukemia, AML: acute myeloid leukemia, LAP: leukemia-associated phenotypes ĐẶT VẤN ĐỀ Giới hạn thấp nhất để phát hiện tế bào tồn lưu ác tính (TBTLAT) trong bệnh bạch cầu cấp (bệnh BCC) dựa vào hình thái học là khi tế bào non <5% tế bào tủy xương. Tuy nhiên, người ta phát hiện ra rằng bệnh nhân bệnh BCC có khoảng 1012 tế bào ác tính lúc chẩn đoán, thì vào giai đoạn lui bệnh theo tiêu chuẩn hình thái vẫn có hơn 1010 tế bào ác tính không phát hiện được. Do đó ngày nay để đánh giá chính xác số lượng TBTLAT đòi hỏi những kỹ thuật có độ nhạy cao hơn như các xét nghiệm sinh học phân tử (FISH, PCR); hoặc dấu ấn miễn dịch (DAMD) được thực hiện bằng hệ thống tế bào dòng chảy. DAMD phát hiện TBTLAT trong bệnh BCC nhờ vào việc xác định những kiểu hình DAMD bất thường, chỉ hiện diện trên tế bào bạch cầu non ác tính mà không hiện diện hoặc rất hiếm gặp trên tế bào tạo máu bình thường trong tủy xương. Kỹ thuật cho phép phát hiện một tế bào non ác tính/10.000 tế bào tuỷ xương bình thường. Hiện tại, có thể ứng dụng kỹ thuật này cho khoảng 75% bệnh nhân bệnh BCC.(1) Để tiến tới thực hiện khảo sát TBTLAT bằng DAMD một cách thường qui trong quá trình điều trị các bệnh BCC, chúng tôi tiến hành đánh giá những kiểu hình DAMD có thể phát hiện được bằng bộ những kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang đang được sử dụng tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học, thành phố Hồ Chí Minh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả thực nghiệm lâm sàng tiến cứu. Dân số nghiên cứu Những bệnh nhân mắc bệnh BCC tại bệnh viện TMHH, TP. HCM. Tiêu chuẩn chọn bệnh Là bệnh nhân mới được chẩn đoán lần đầu, chưa trải qua điều trị nào, có kết quả tủy đồ và DAMD kết luận mắc một trong hai nhóm bệnh BCC (BCC dòng lymphô B hoặc BCC dòng tủy). Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu mạn dòng lymphô hoặc dòng tủy, các bệnh tăng sinh dòng lymphô hoặc lymphoma, các bệnh tăng sinh tủy hoặc loạn sinh tủy. Kỹ thuật Những mẫu tủy hút (giữ chống đông bằng ACD, Heparin hoặc EDTA) đem nhuộm với các kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang và loại bỏ hồng cầu bằng dung dịch amonium chloride. Trong một số trường hợp cần thiết, mẫu tủy được làm tăng tính thấm bề mặt để nhuộm với các kháng thể đơn dòng trong nhân hoặc trong tế bào chất (như TdT, cyCD79a, MPO, cyCD3). Cuối cùng thu thập mẫu đã xử lý bằng hệ thống máy FACS CantoII và phân tích trên phần mềm FACSDiva verson 2.1 của hãng Becton Dickinson (Mỹ). Các mẫu tủy đều được nhuộm với cùng một bộ thuốc thử (gồm 20 CD): Bảng 1: Dàn kháng thể đơn dòng tại BV. TMHH Màu huỳnh quang STT ống FITC PE Per CP APC 1 CD19 CD22 CD45 CD34 2 CD20 CD10 CD45 CD34 3 CD3 CD19 CD45 CD56 4 CD5 CD4 CD45 CD8 5 CD7 CD33 CD45 CD34 6 HLA.DR CD13 CD45 CD15 7 CD14 CD2 CD45 CD36 Định nghĩa một số thuật ngữ - Tỉ lệ tế bào dương tính: là mật độ tế bào dương tính với một kháng nguyên (KN) tính trên quần thể tế bào non. - Nồng độ KN: thường được mô tả định tính thông qua 4 mức độ: âm tính Æ yếu Æ trung Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Nội Khoa 310 bình Æ mạnh, dùng để đánh giá mật độ huỳnh quang, gián tiếp phản ánh số lượng KN trên từng tế bào. - Gọi là đồng biểu hiện KN khi có ≥ 5% tế bào trong quần thể tế bào non có biểu hiện 2 KN đang quan tâm. Những chiến lược xác định các kiểu hình DAMD bất thường: (1,3,8) - Sự biểu hiện các KN khác dòng - Sự biểu hiện KN không đồng bộ - Sự hiện diện quá mức của một KN. - Sự vắng mặt một KN đặc hiệu của dòng. KẾT QUẢ Đặc điểm chung của quần thể nghiên cứu Bảng 2: Tần suất các nhóm bệnh BCC theo tuổi và giới tính: Tuổi trung bình: 27,41± 22,21 (từ 0 đến 81 tuổi) Các nhóm bệnh BCC Đặc điểm B-ALL (n=78) AML (n=94) Tổng Cộng Tỉ lệ % Tuổi ≤15 48 20 68 39,53 >15 30 74 104 60,47 Giới tính Nam 42 46 88 51,16 Nữ 36 48 84 48,84 Tỉ lệ nam/nữ 1,05 Ghi chú: B-ALL: BCC dòng lymphô B, AML; BCC dòng tủy. Bảng 3: Tần suất xuất hiện nhiều kiểu hình DAMD bất thường trên cùng một quần thể tế bào non: Số kiểu LAP /1 quần thể tế bào non Nhóm bệnh 0 1 2 3 4 5 B-ALL 8 20 28 18 4 0 AML 11 23 32 18 9 2 Tổng số 19 43 59 36 13 2 Tỉ lệ% 11,05 25,00 34,30 20,93 7,56 1,16 Ghi chú: LAP: kiểu hình DAMD bất thường, B-ALL: BCC dòng lymphô B, AML; BCC dòng tủy. BCC dòng lymphô B Bảng 4: Chiến lược sự hiện diện của kháng nguyên khác dòng trên BCC dòng lymphô B: Dòng Dấu ấn Mật độ tế bào dương tính (tỉ lệ % /quần thể tế bào non) Tần suất Tỉ lệ% (tính trên n=78) Tế bào NK CD56 5 – 47,2% 29 37,18 CD13 5 – 88,3% 29 37,18 CD33 5 – 97,6% 29 37,18 CD15 5 - 34% 10 12,82 CD36 5 – 47,2% 15 19,23 Dòng tủy CD14 5% 1 1,28 CD2 5 - 91% 6 7,69 CD3 5 – 28,8% 10 12,82 CD4 5 - 43% 17 21,79 CD7 5 – 92,7% 4 5,13 Dòng lymphô T CD8 5% 1 1,28 Ghi chú: NK: tế bào giết tự nhiên. Bảng 5: Các kiểu hình DAMD bất thường khác có thể nhận biết trên tế bào BCC dòng lymphô B: Kiểu hình Tần suất Tỉ lệ % Chiến lược sự xuất hiện kháng nguyên không đồng bộ: CD34+CD20+ (1) 8 10,3 TdT+CD20+ (2) 4 5,1 (1) và (2) 16 20,5 Tổng cộng 28 35,9 Chiến lược sự mất đi một kháng nguyên đặc hiệu của dòng (CD19, CD22) CD19¯* 6 7,7 CD22¯* 0 0 Sự tăng cao bất thường của một kháng nguyên (CD10 hoặc CD34): CD34 mạnh ** 7 8,97 CD10 mạnh ** 17 21,79 Chiến lược CD45− Æ yếu Pro B-ALL 4 5,13 Common B-ALL 30 38,46 Pre B-ALL 5 6,41 Mautre B-ALL 0 0,00 Tổng cộng 39/78 50,00 Ghi chú: * CD19−: CD19 âm tính, CD22−: CD22 âm tính. **CD34 mạnh: CD34 có nồng độ dương tính mạnh trên bề mặt tế bào và có tỉ lệ tế bào dương tính cao với CD34; tương tự với CD10 mạnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 311 BCC dòng tủy Bảng 6: Chiến lược sự hiện diện của kháng nguyên khác dòng trên BCC dòng tủy: Dòng Dấu ấn Mật độ tế bào dương tính (tỉ lệ % /quần thể tế bào non) Tần suất Tỉ lệ% (tính trên n=94) Tế bào NK CD56 5 – 95,3% 37 39,36 CD22 5 – 39,6% 15 15,96 CD19 5 - 78% 10 10,64 CD20 5% 1 1,06 Dòng lymphô B TdT 5-29,8% 5/14 35,71 CD2 5 - 88,8% 17 18,09 CD3 5 - 10% 3 3,19 CD5 5 - 52% 2 2,13 CD7 5 – 88,3% 27 28,72 Dòng lymphô T CD8 8% 1 1,06 Ghi chú: CD4 và CD10 không phải là KN khác dòng đối với dòng tủy. Bảng 7: Những kiểu hình DAMD bất thường khác trên tế bào BCC dòng tủy: (tế bào có kiểu hình CD13+/CD117+/CD34± hoặc CD33+ CD117+/CD34±) Kiểu hình Tần suất Tỉ lệ % Sự hiện diện không đồng bộ CD34+/CD15+ 65 69.15 HLA.DR+/CD15+ 77 81.91 CD117+/CD15+ 77 81.91 CD117+/CD14+ 35 37.23 CD34+/CD14+ 31 32.98 Sự mất đi một kháng nguyên đặc hiệu của dòng (CD13, CD33) CD13−* 3 3.19 CD33−* 1 1.06 Sự tăng cao bất thường của một kháng nguyên CD34 mạnh** 3 3.19 CD117 mạnh ** 3 3.19 Chiến lược CD45 -/yếu: CD45 -/yếu 0 0 CD45 yếu/trung bình/ mạnh 94 100 Ghi chú: * CD13−: CD13 âm tính, CD33−: CD33 âm tính. ** CD34 mạnh: CD34 có nồng độ dương tính mạnh trên bề mặt tế bào và có tỉ lệ tế bào dương tính cao với CD34; tương tự với CD117 mạnh Nhóm chứng 10 mẫu máu ngoại vi và 5 mẫu tủy của bệnh nhân xuất huyết giảm tiểu cầu mới chẩn đoán. Dùng để khẳng định các kiểu hình nêu trên không hiện diện hoặc hiện diện với tỉ lệ rất thấp (<0.01%) trên các quần thể tế bào trưởng thành ở máu ngoại vi cũng như các tế bào ở tủy xương bình thường. BÀN LUẬN Đối với bệnh BCC dòng lymphô B Chúng tôi sử dụng 2 kháng thể đặc trưng dòng lymphô B để xác định quần thể lymphô B là CD19, CD22. Tuy nhiên, cyCD79a đôi khi được sử dụng để xác định chắc chắn dòng B. Hơn phân nửa các trường hợp BCC dòng lymphô B có biểu hiện CD45–, phù hợp với nhận định của các trung tâm khác trên thế giới (5). Trên 50% bệnh nhân BBC dòng lymphô B có từ 1 đến 3 KN khác dòng hiện diện trên cùng một quần thể tế bào non. Các dấu ấn khác dòng thường xuất hiện trên tế bào non ác tính dòng lymphô B là CD56, CD13, CD33; ít gặp hơn là CD36, CD15, CD4, CD3, CD2, CD7(4) So với nghiên cứu của Campana va Coustant - Smith (1999)(3), tần suất xuất hiện của kiểu DAMD bất thường này cao hơn từ 10 – 20%. Sự xuất hiện các KN không đồng bộ thuộc dòng lymphô B được ghi nhận thông qua 2 kiểu hình CD34+/CD20+ và/hoặc TdT+/CD20+ chiếm tỉ lệ khoảng 36% bệnh nhân BCC dòng B. Hai kiểu hình này không phát hiện được trên mẫu máu ngoại vi và mẫu tủy bình thường, nên phù hợp để theo dõi TBTLAT(5,6,7). Đặc điểm của nhóm BCC dòng lymphô B trong nghiên cứu của chúng tôi là tỉ lệ tế bào dương tính với CD19+ thay đổi rất lớn (từ 0 Æ 100%) và luôn thấp hơn so với tế bào có CD22+. Trong đó, ghi nhận 6/78 trường hợp, chiếm khoảng 8% bệnh nhân BCC dòng lymphô B không có CD19 hoặc tỉ lệ tế bào mang CD19 <10% quần thể tế bào non. Không có trường hợp nào mất CD22, tuy nhiên 20% trường hợp ghi nhận tỉ lệ tế bào có CD22+ <50% quần thể tế bào non. Ngoài ra, đánh giá sự biểu hiện quá mức của một kháng nguyên, chúng tôi cũng ghi nhận có khoảng 20% bệnh nhân BCC dòng lymphô B hiện diện kiểu hình CD10mạnh và/hoặc CD34mạnh(4) Nếu kết hợp đặc tính này với đặc tính CD45trung bình hoặc CD45mạnh, chúng ta sẽ có thêm một kiểu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Nội Khoa 312 hình khả thi để đánh giá TLTBAT vì bình thường tế bào có CD10 hay CD34 thường nằm ở vị trí SCC thấp CD45yếu. (6) Hai chiến lược ít gặp là sự tăng quá mức của một KN (như CD34 hoặc CD10) hay sự mất đi của một KN đặc hiệu của dòng (như CD19 hoặc CD22) dễ dàng nhận ra vào lúc chẩn đoán, nhưng để đánh giá TLAT sau điều trị chúng ta cần bổ sung kiểu nhuộm 5 màu kết hợp với cyCD79a để tăng tính chính xác. Điều này sẽ gây tốn kém và mất thời gian phân tích. Tóm lại, có 3 chiến lược đánh giá kiểu hình DAMD bất thường trong bệnh BCC dòng lymphô B có tần suất xuất hiện cao và dễ áp dụng theo thứ tự từ trên xuống: - Sự xuất hiện KN khác dòng mà thường gặp là CD56, CD13, CD33 ghi nhận ở 50% trường hợp. - Quần thể tế bào non có đặc điểm CD45- Æ yếu xuất hiện > 50% trường hợp. - Sự xuất hiện các KN không đồng bộ (với 2 kiểu hình CD34+CD20+ và TdT+CD20+) cũng dễ dàng đánh giá ở 36% trường hợp. Đối với bệnh BCC dòng tủy Chúng tôi đưa vào sử dụng thường qui bộ kháng thể đơn dòng tương ứng với các KN đặc trưng cho dòng hạt và dòng mono (bao gồm CD13, CD33, CD15, CD14, CD36 và CD117). CD117 là một dấu ấn non đặc trưng dòng tủy, mà ngày nay được xem là trung thành hơn cả phức hợp CD13+CD33+ trong chẩn đoán tế bào ác non dòng tủy(6). Phân nhóm M2 chiếm đa số (47%) các trường hợp BCC dòng tủy, kế đến là M1 (20%), M4 (15%), M5 (8,5%) và M3 (8,5%). Chỉ ghi nhận được 1 trường hợp M0 và 1 trường hợp M6, không có trường hợp M7 nào. Điều này phù hợp với các thống kê trong và ngoài nước, cho thấy sự đa dạng, phức tạp trong kiểu hình miễn dịch của nhóm bệnh BCC dòng tủy(2). Đối với bệnh BCC dòng tủy, chiến lược sự xuất hiện của các KN khác dòng được phát hiện nhiều nhất(3). Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận những KN khác dòng thường gặp nhất là CD56 (37%), CD7 (27%), CD2 (17%), CD22 (15%) và CD19 (10%), phù hợp với kết quả nghiên cứu của Al-Mawali và cộng sự (2009)(1). Đa phần các kiểu hình này đều xuất hiện cùng với CD34+. Trong đó có 67/94 (71,28%) trường hợp biểu hiện từ 1 đến 5 KN khác dòng khác nhau. Trong sơ đồ phát triển bình thường của các tế bào dòng tủy, tế bào dòng tủy trưởng thành có CD15+ hoặc CD14+ không hiện diện các dấu ấn non như CD34+, CD117+ và HLA.DR+(6). Kết quả nghiên cứu ghi nhân được những kiểu hình liên quan đến chiến lược sự hiện diện các KN không đồng bộ có tần suất xuất hiện tương đối cao: CD34+CD15+ (69%), CD117+CD15+ (81%) và HLA.DR+CD15+ (81%); CD14+CD34+ (37%) và CD14+CD117+ (33%)(1,8) . Ngoài ra, đánh giá sự biểu hiện quá mức của một kháng nguyên(3), chúng tôi ghi nhận có khoảng 6% bệnh nhân BCC dòng tủy hiện diện kiểu hình CD117 mạnh và/hoặc CD34 mạnh. Không ghi nhận các dấu ấn khác (như CD13, CD33, CD15, CD14) có nồng độ mạnh trên quần thể tế bào non(9). Chúng tôi nhận thấy 3/94 trường hợp có CD13–, và 27% trường hợp có CD13+ <20% quần thể tế bào non. Ngoài ra, có 1 trường hợp CD33–. Điều này càng khẳng định vai trò của CD117 rất quan trọng trong việc giúp chẩn đoán dòng tủy, đặc biệt trong những trường hợp có tỉ lệ tế bào non dương tính với CD13 và/hoặc CD33 thấp(10). Tóm lại, đối với nhóm bệnh BCC dòng tủy, hai chiến lược đánh giá những kiểu hình DAMD bất thường khả thi nhất và có tần suất cao (> 70% các trường hợp) là: - Sự hiện diện của các kháng nguyên khác dòng. - Sự xuất hiện không đồng bộ giữa các KN trong cùng một dòng. KẾT LUẬN Với qui mô của một đơn vị nghiên cứu nhỏ, hiện tại chúng tôi chỉ sử dụng dàn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Nội Khoa 313 kháng thể đơn dòng vừa phải đủ để xác định đúng dòng tế bào và áp dụng trong việc tìm kiếm những kiểu hình DAMD bất thường làm nền tảng cho những đánh giá TLTBAT về sau. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy dàn kháng thể hiện có tại BV TMHH đủ để xác định những kiểu hình DAMD bất thường trong 88% các trường hợp BCC. Do > 60% các trường hợp có từ 2-5 kiểu hình DAMD bất thường hiện diện trên cùng một quần thể tế bào bạch cầu ác tính, chúng ta cần phải áp dụng nhiều chiến lược đánh giá cùng lúc, càng có nhiều kiểu hình bất thường được ghi nhận vào thời điểm mới chẩn đoán càng giúp kết quả phân tích TBTLAT về sau có giá trị cao, tránh đưa ra kết luận âm tính giả. Tuy nhiên, mỗi nhóm bệnh BCC chỉ phù hợp với một số chiến lược nhất định. Và để chọn được những kiểu DAMD bất thường có độ đặc hiệu cao, nhóm nghiên cứu đã thực hiện kiểm tra đối chứng trên mẫu máu và mẫu tủy bình thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Mawali A, Gillis D, Lewis I. (2009) The use of receiver operating characteristic analysis for detection of minimal residual disease using five-color multiparameter flow cytometry in acute myeloid leukemia identifies patients with high risk of relapse. Cytometry B Clin Cytom; 76 (2), pp.91- 101. 2. Basso G, Buldini B, De Zen L, Orfao A. (2001) New methodologic approaches for immunophenotyping acute leukemias. Haematologica; 86 (7), pp.675-692. 3. Campana D, Coustan-Smith E. (1999) Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytometry. Cytometry; 38 (4), pp.139-152. 4. Coustan-Smith E, Sancho J, Hancock ML, Boyett JM, Behm FG, Raimondi SC, Sandlund JT, Rivera GK, Rubnitz JE, Ribeiro RC, Pui CH, Campana D. (2000) Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood; 96 (8), pp.2691-2696. 5. Jeha S, Behm F, Pei D, Sandlund JT, Ribeiro RC, Razzouk BI, Rubnitz JE, Hijiya N, Howard SC, Cheng C, Pui CH. (2006) Prognostic significance of CD20 expression in childhood B- cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood; 108 (10), pp.3302-3304. 6. Lochem EV, Velden VVD, Wind H, Marvelde JT, Westerdaal N, Dongen JV. (2004) Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: Reference patterns for age-related changes and disease- induced shifts. Cytometry Part B: Clinical Cytometry; 60 (B), pp.1-13. 7. Lochem EV, Wiegers Y, Beemd Rvd, Hhlen K, Dongen JV, Hooijkaas H. (2000) Regeneration pattern of precursor-B-cells in bone marrow of acute lymphoblastic leukemia patients depends on the type of preceding chemotherapy. Leukemia; 14 (4), pp.688-695. 8. Reading CL, Estey EH, Huh YO, Claxton DF, Sanchez G, Terstappen LW, O'Brien MC, Baron S, Deisseroth AB. (1993) Expression of unusual immunophenotype combinations in acute myelogenous leukemia. Blood; 81 (11), pp.3083-3090. 9. San Miguel JF, Martinez A, Macedo A, Vidriales MB, Lopez- Berges C, Gonzalez M, Caballero D, Garcia-Marcos MA, Ramos F, Fernandez-Calvo J, Calmuntia MJ, Diaz-Mediavilla J, Orfao A. (1997) Immunophenotyping investigation of minimal residual disease is a useful approach for predicting relapse in acute myeloid leukemia patients. Blood; 90 (6), pp.2465-2470. 10. San Miguel JF, Vidriales MB, Lopez-Berges C, Diaz- Mediavilla J, Gutierrez N, Canizo C, Ramos F, Calmuntia MJ, Perez JJ, Gonzalez M, Orfao A. (2001) Early immunophenotypical evaluation of minimal residual disease in acute myeloid leukemia identifies different patient risk groups and may contribute to postinduction treatment stratification. Blood; 98 (6), pp.1746-1751.