Nuôi cấy tăng sinh tế bào TCD8 ở bệnh nhân ung thư phổi

8 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC NUÔI CẤY TĂNG SINH TẾ BÀO TCD8 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Vũ Văn Quý, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Quý Linh, Nguyễn Thanh Bình, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào lympho tự thân là một trong những liệu pháp điều trị kết hợp an toàn và khá hiệu quả cho nhiều loại ung thư hiện nay, trong đó có ung thư phổi. Mục đích của nghiên cứu là hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy và hoạt hóa tế bào TCD8 từ bệnh nhân ung thư phổi. 10 bệnh nhân ung thư phổi được lựa chọn vào nghiên cứu, mỗi bệnh nhân được thu thập 10 ml máu chống đông trong heparin, tiến hành tách chiết, nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá. Kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân tách được từ 10ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi trung bình là (5,13 ± 2,97) x 106 tế bào. Số lượng tế bào trung bình thu được sau nuôi cấy là (3,9 ± 1,45) x 109 tế bào, tỷ lệ sống trung bình đạt 90,37% ± 1,88%. Trong đó, tỷ lệ tế bào TCD4 chiếm 22,1% ± 9,59 %, TCD8 chiếm 66,11% ± 11,02%. Không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, mycoplasma và nội độc tố trong môi trường sau nuôi cấy. Từ khóa: Liệu pháp tế bào miễn dịch, tế bào TCD8, ung thư phổi Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, Trung tâm nghiên cứu Gen -Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 18/9/2018 Ngày được chấp thuận: 11/10/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất về tỷ lệ mắc là nguyên nhân tử vong hàng đầu do ung thư trên thế giới và ở Việt Nam [1]. Tuy đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị, song ung thư phổi vẫn là một trong những ung thư có tiên lượng xấu hiện nay với tỷ lệ sống thêm sau 5 năm của bệnh nhân ung thư phổi nói chung chỉ ở mức 18% [2]. Do đó, việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả mới là điều hết sức cần thiết. Trên thế giới hiện nay, liệu pháp sử dụng tế bào miễn dịch đã được phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư phổi với những kết quả ban đầu đầy hứa hẹn [3; 4]. Trong liệu pháp này, các tế bào miễn dịch được tách từ máu ngoại vi của người bệnh, nuôi cấy tăng sinh và hoạt hóa một hoặc nhiều loại tế bào trong môi trường đặc biệt rồi truyền trở lại các tế bào này vào cơ thể của chính bệnh nhân. Có nhiều dòng tế bào được phân tách và sử dụng trong liệu pháp này như tế bào lympho T hỗ trợ (TCD4) và tế bào lympho T gây độc (TCD8), tế bào tua (Dendritic cells- DC), tế bào diệt tự nhiên (Natural killer cells-NK) [5; 6]. Các tế bào TCD8 được cho là đóng vai trò trung tâm trong đáp ứng miễn dịch chống ung thư còn các tế bào TCD4 đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì chức năng của các tế bào T gây độc [7]. Các tế bào Lympho T có thể được nuôi cấy, hoạt hóa trong môi trường được bổ sung huyết thanh, các cytokine và một số yếu tố kích thích khác như kháng thể kháng CD3/ CD28 để tăng số lượng cũng như khả năng nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thư. Kể từ khi được công bố lần đầu tiên vào năm 1982 đến nay đã có nhiều quy trình nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho tách từ bệnh nhân ung thư phổi được xây dựng, các tác giả đã đi xa hơn và đánh giá hiệu quả điều trị của liệu pháp sử dụng tế bào lympho T thẩm quyền miễn dịch trên bệnh nhân. Nhiều thử nghiệm lâm sàng TCNCYH 115 (6) - 2018 9 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC sử dụng tế bào lympho kết hợp với hóa chất, xạ trị ở bệnh nhân ung thư phổi cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc kéo dài thời gian sống thêm của bệnh nhân đồng thời chất lượng cuộc sống của bệnh nhân được cải thiện rõ rệt [8 - 10]. Hiện tại, Việt Nam vẫn đang trong giai đoạn tiếp cận với liệu pháp tế bào miễn dịch trong điều trị ung thư và chưa có nhiều công trình nghiên cứu được công bố trong lĩnh vực này. Do đó, nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu áp dụng và hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tế bào TCD8 trên bệnh nhân ung thư phổi. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 10 bệnh nhân (6 nam, 4 nữ) ung thư phổi không tế bào nhỏ nguyên phát, giai đoạn III (5 bệnh nhân), IV (5 bệnh nhân) được lựa chọn vào nghiên cứu. Bệnh nhân ≥ 18 tuổi, toàn trạng ECOG ≤ 3. Các bệnh nhân có bệnh lý tự miễn, dùng thuốc ức chế miễn dịch, bệnh lý mãn tính kết hợp, bệnh lý ác tính dòng tế bào lympho T sẽ bị loại trừ khỏi nghiên cứu này. 2. Phương pháp 2.1. Phương pháp thu thập mẫu 10 ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi được lấy vào ống chống đông heparin, bảo quản ở nhiệt độ phòng và được xử lý trong vòng 6 giờ. 2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Kỹ thuật phân tách tế bào lympho từ máu ngoại vi: Các tế bào miễn dịch được tách bằng phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll [11]. Kỹ thuật nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho: Sau khi tách chiết, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% huyết thanh người có bổ sung thêm các cytokin IL-2 (nồng độ 10 U/L). Khi các tế bào ổn định, đạt mật độ nuôi cấy cần thiết (70 - 80%), sẽ được chuyển sang các điều kiện nuôi cấy hoạt hóa và biệt hóa có bổ sung kháng thể kháng CD3 và CD28. Tổng thời gian nuôi cấy và hoạt hóa tế bào lympho là 14 ngày. Kỹ thuật phân loại tế bào nuôi cấy bằng Flow-Cytometry Dựa trên sự biểu hiện của các marker đặc hiệu trên bề mặt tế bào tương ứng với mỗi giai đoạn hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế bào lympho. Các marker được sử dụng là: CD3, CD4, CD8, CD19, CD56. Các tế bào lympho được nhuộm với kháng thể kháng marker đặc hiệu tế bào cho từng giai đoạn hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế bào và được đếm trên máy đếm dòng chảy tế bào BD FACS Canto II. Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống sử dụng Trypan blue Tế bào sau khi tách chiết từ máu ngoại vi và sau nuôi cấy được nhuộm với Trypan blue để đếm số lượng và xác định tỷ lệ tế bào sống, chết. Phương pháp đánh giá khả năng nhiễm vi sinh vật và vi nấm - Kiểm tra vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn Thioglycollate medium (BD Bioscience, USA). - Kiểm tra độc tố Endotoxin trong môi trường nuôi cấy bằng bộ KIT E-TOXATE. - Kiểm tra mycoplasma trong môi trường nuôi cấy bằng bộ KIT Mycosensor. 10 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 3. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu này thuộc đề tài cấp Bộ “Tiếp nhận và nghiên cứu phát triển công nghệ nền tế bào miễn dịch trong điều trị ung thư từ Nhật Bản về Việt Nam” đã được đồng ý thông qua giai đoạn thử nghiệm trên người tình nguyện khoẻ mạnh và bệnh nhân ung thư bởi Hội đồng đạo đức của Trường Đại học Y Hà Nội (số 128/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 20/9/2017). III. KẾT QUẢ 1. Số lượng tế bào bạch cầu thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi Bảng 1. Đặc điểm tế bào thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư phổi trung bình là (5,13 ± 2,97) x 106. Trong đó, tế bào lympho T chiếm đa số với tỷ lệ 62,54 ± 12,27 %. Tỷ lệ tế bào sống đạt 97,18 ± 1,38 %. 2. Số lượng tế bào bạch cầu thu được sau nuôi cấy tế bào tách tách từ máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi. Số lượng tế bào trung bình thu được sau nuôi cấy là (3,9 ± 1,45) x 109, tỷ lệ sống đạt 90,3 ± 1,88 %. So sánh với trước khi nuôi cấy, tế bào nhân lên từ 396 đến 2000 lần, trung bình là 1175,3 lần (bảng 2). Mẫu Số lượng tế bào thu được Tỷ lệ sống (%) % Lympho T MS01 2,04 x 106 97,42 80,39 MS02 0,5 x 106 96,54 84,39 BN01 8,34 x 106 97,47 50,5 BN02 2,16 x 106 93,86 58,8 BN03 3,54 x 106 96,98 58,8 BN08 9,18 x 106 98,55 46,2 BN10 6,8 x 106 97,32 68,2 BN16 7,02 x 106 98,7 54,6 BN20 4,64 x 106 96,71 58,4 BN23 7,08 x 106 98,26 65,1 ± SD (5,13 ± 2,97) x 106 97,18 ± 1,38 62,54 ± 12,27 X TCNCYH 115 (6) - 2018 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 2. Đặc điểm tế bào thu được sau nuôi cấy hoạt hóa Mẫu Số lượng tế bào thu được Tỷ lệ sống (%) Hệ số nhân lên MS01 5,8 x 109 92,13 2843 MS02 1,0 x 109 87,4 2000 BN01 3,3 x 109 87,21 396 BN02 4,04 x 109 90,44 1870 BN03 6,22 x 109 93,24 1757 BN08 3,2 x 109 90,53 349 BN10 3,71 x 109 90,98 546 BN16 3,36 x 109 90,23 479 BN20 4,4 x 109 91,4 948 BN23 4,0 x 109 90,13 565 ± SD (3,9 ± 1,45) x 109 90,37 ± 1,88% 1175,3 ± 874,16 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt của các tế bào thu được sau nuôi cấy tế bào tách từ máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi Bảng 3. Tỷ lệ các quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy hoạt hóa Mẫu Tỷ lệ các quần thể tế bào (%) CD3+ CD3+CD8+ CD3+CD4+ CD19+ CD16+CD56+ MS01 98,03 55,24 33,92 4,75 0,81 MS02 92,51 48,88 35,74 0,12 3,44 BN01 97,9 65,0 31,0 0 3,0 BN02 98,8 87,0 11,0 0 0 BN03 97,9 74,0 21,0 0 1,0 BN08 98,62 74,17 23,75 0,01 1,03 BN10 95,8 56,1 9,76 0 4,0 BN16 95,15 69,38 24,98 0 4,39 BN20 95,6 64,76 18,91 0,03 7,65 BN23 82,85 66,58 10,91 0 16.83 ± SD 95,32 ± 4,80 66,11 ± 11,02 22,01 ± 9,59 0,49 ± 1,5 4,22 ± 4,98 X X 12 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Các tế bào thu được sau nuôi cấy chủ yếu là lympho T với tỷ lệ 95,32 ± 4,80% và một tỷ lệ nhỏ các tế bào NK (?): 4,22 ± 4,98%. Trong đó, quần thể tế bào TCD8 chiếm đa số với 66,11 ± 11,02%, TCD4 chiếm 22,01 ± 9,59%. 4. Đánh giá tính an toàn của tế bào miễn dịch sau nuôi cấy Không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, mycoplas và endotoxin trong các môi trường sau nuôi cấy tế bào. IV. BÀN LUẬN Trên thế giới hiện nay, liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào lympho T thích ứng (Adoptive T cell therapy) mà chủ yếu là các lympho TCD8 đã có những tiến bộ vượt bậc và đang trở thành hướng tiếp cận chính cho điều trị nhiều loại ung thư hiện nay trong đó có ung thư phổi. Nhiều quy trình nuôi cấy và hoạt hóa tế bào lympho T đã được thiết lập và đưa vào sử dụng dựa vào vị trí thu nhận tế bào cho điều trị. Trong đó, liệu pháp sử dụng tế bào lympho T tách chiết từ máu ngoại vi (CTL ther- apy) là một phương pháp có nhiều ưu điểm như ít xâm lấn, ít ảnh hưởng đến quá trình sinh hoạt, công việc của bệnh nhân. 10 ml máu tĩnh mạch bệnh nhân được thu thập vào ống chống đông EDTA để tách chiết tế bào lympho sử dụng cho nuôi vấy. Trong nghiên cứu này, phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll được sử dụng để tách chiết các tế bào lympho. Đây là phương pháp hiệu quả với số lượng tế bào thu được, tỷ lệ sống và chức năng của tế bào sau khi tách chiết cao hơn các phương pháp khác. Nguyên lý của phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll dựa vào tỷ trọng của Ficoll và tỷ trọng của tế bào máu: tỷ trọng của Ficoll là 1,077, cao hơn tỷ trọng của bạch cầu lympho nhưng lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Khi ly tâm, hồng cầu và bạch cầu hạt lắng xuống đáy ống ly tâm, còn bạch cầu lym- pho và bạch cầu đơn nhân khác nằm ở trên lớp Ficoll. Thu hoạch lớp tế bào ở trên lớp Ficoll rất giàu tế bào Lympho. Trong quần thể tế bào thu được, tế bào Lympho chiếm đa số với tỷ lệ trung bình > 60%. Số lượng tế bào của các mẫu sau khi tách đều ≥ 4 x 106 tế bào, riêng mẫu bệnh nhân mã số BN02, do vừa trải qua 1 giai đoạn điều trị bằng hóa chất nên số lượng tế bào tách được thấp hơn so với các mẫu còn lại. Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%. Các tế bào lympho T tách chiết từ máu ngoại vi phần lớn không tiếp xúc trực tiếp với các tế bào ung thư do đó chúng có thể ở trạng thái chưa hoạt hoá và ít có tính đặc hiệu với kháng nguyên ung thư cũng như không đủ số lượng cần thiết cho điều trị. Chính vì vậy, sau khi được thu thập, các tế bào lympho T được nuôi cấy tăng sinh hoạt hóa và tăng độ mẫn cảm với các tế bào ung thư [12]. Bên cạnh đó, nhằm tăng sinh các tế bào lympho T đạt số lượng lớn đủ cho điều trị, đồng thời vẫn bảo toàn được các đặc tính, chức năng miễn dịch của tế bào, môi trường nuôi cấy tế bào cần phải bổ sung thêm các cytokin như IL-2, IL-15 và IL-21. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kháng thể kháng CD3/CD28 và bổ sung thêm IL-2. Việc gắn kết của kháng thể kháng CD3 với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào kích thích hoạt hoá tế bào không phụ thuộc TCNCYH 115 (6) - 2018 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC kháng nguyên với sự trung gian của phức hợp đồng kích thích/ thụ thể tế bào lympho T thông qua con đường tín hiệu NF-kB [13]. Quá trình này cung cấp các tín hiệu mạnh mẽ cho sự biệt hoá, tăng trưởng và phát triển tế bào, biến chúng từ những tế bào chưa hoạt hoá trở thành các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Kháng thể kháng CD3 cung cấp tín hiệu đầu tiên cho các tế bào lympho giúp chúng biệt hoá và tăng trưởng. Tuy nhiên, nếu chỉ có sự cung cấp tín hiệu thông qua thụ thể CD3 thì các tế bào lympho T sẽ dừng sự phát triển ở giai đoạn trước trưởng thành và sau đó đi vào con đường chết theo chương trình tế bào. Chính vì vậy kháng thể kháng CD28 cung cấp tín hiệu thứ 2, tín hiệu bổ sung cho sự hoạt hoá tế bào và giúp các tế bào lympho T phát triển đến giai đoạn trưởng thành và nhờ đó tránh được hiện tượng chết theo chương trình tế bào. Trong khi đó, IL-2 có vai trò kích thích phân bào, tăng cường sự sống sót đồng thời duy trì tác dụng của các tế bào lympho T tại tổ chức ung thư thông qua phức hợp thụ thể trimeric (αβγ) trên bề mặt các tế bào này. Để xác định các điều kiện tối ưu cho nuôi cấy tăng sinh tế bào lympho với kháng thể kháng CD3/CD28, một số nghiên cứu đã chứng minh được tác động của việc bổ sung cytokine lên tỷ lệ tăng sinh tế bào. Teschner và cộng sự (2011) nhận thấy các tế bào tăng sinh gấp 15 - 17 lần khi nuôi cấy trong 2 tuần nuôi cấy với các hạt phủ kháng thể kháng CD3/CD28 có bổ sung IL-2 so với chỉ nuôi cấy với IL-2 [14]. Nghiên cứu của Cornish và cộng sự báo cáo rằng IL-2 gây ra sự biệt hóa các tế bào lympho TCD8 hiệu ứng và sự kích thích IL-2 gây ra tổng hợp protein cần thiết cho sự phân bào và tăng kích thước tế bào [15]. Sau 14 ngày nuôi cấy hoạt hóa, số lượng tế bào thu được cũng như tỷ lệ tế bào sống đều đạt yêu cầu với trung bình là (3,9 ± 1,45) x 109. Kết quả này thấp hơn so với trong báo cáo của Zhang và cộng sự năm 2015 [16]. Tuy nhiên hệ số nhân lên của tế bào so với trước nuôi cấy là 1175,3 ± 874,16, lại cao hơn so với 555,78 ± 142,01 trong nghiên cứu trên. Sự khác biệt này có thể do sai khác về nồng độ IL-2 cùng như kháng thể kháng CD3 và kháng thể kháng CD28 sử dụng trong nghiên cứu. Tỷ lệ tế bào sống ở tất cả các mẫu đều đạt trên 90%. Mẫu bệnh nhân BN02, do vừa trải qua 1 đợt điều trị hóa chất nên số lượng tế bào cũng như tỷ lệ tế bào sống thu được thấp hơn so với các mẫu khác. Sau nuôi cấy, hoạt hoá và tăng sinh quần thể tế bào thu được gồm gần như hoàn toàn là các tế bào lympho T, tế bào NK chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ, còn tỷ lệ các tế bào lympho B gần như không đáng kể. Trong quần thể tế bào lympho T, tế bào T độc TCD8 chiếm ưu thế với tỷ lệ từ 48,8 - 87,0%. Kết quả này tương cũng tương tự như trong nhiều nghiên cứu khác với tỷ lệ TCD8 thu được sau nuôi cấy trên 60% [16; 17]. Nguyên nhân là do môi trường nuôi cấy là môi trường chọn lọc cho sự phát triển của các tế bào lympho, đặc biệt là lympho TCD8. Để đánh giá tính an toàn, sự có mặt của vi khuẩn, mycoplasma và nội độc tố Endotoxin trong môi trường nuôi cấy tế bào được kiểm tra. Kết quả, không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, myplasma và nội độc tố Endotoxin trong các môi trường sau nuôi cấy tế bào. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tế bào TCD8 từ bệnh 14 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nhân ung thư phổi: Tế bào thu được sau nuôi cấy đảm bảo đủ số lượng, chất lượng, không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, my- coplasma và endotoxin trong các môi trường sau nuôi cấy tế bào. Lời cảm ơn Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ (Dự án hay đề tài cấp Bộ như đã nói ở trên) “Tiếp nhận và nghiên cứu phát triển công nghệ nền tế bào miễn dịch trong điều trị ung thư từ Nhật Bản về Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn những bệnh nhân đã đồng ý tham gia nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Torre L.A., Bray F., Siegel R.L et al (2015). Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 65, 87 - 108. 2. Siegel R.L., Miller K.D. and Jemal A. (2017). Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin, 67, 7 - 30. 3. Li Yang., Liping Wang. and Yi Zhang. (2016). Immunotherapy for lung cancer: ad- vances and prospects. Am J Clin Exp Immu- nol, 5, 1 - 20. 4. Li K., Zhang Q., Zhang Y et al (2015). T-cell-associated cellular immunotherapy for lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol, 141, 1249 - 1258. 5. Mingjun Wang., Bingnan Yin., Helen Y Wang et al (2014). Current advances in T-cell -based cancer immunotherapy. Immunother- apy, 6, 1265 - 1278. 6. Tao Z., Li S., Ichim T.E et al (2017). Cellular immunotherapy of cancer: an over- view and future directions. Immunotherapy, 9, 589 - 606. 7. Martínez-Lostao L., Anel A., Pardo J (2015). How Do Cytotoxic Lymphocytes Kill Cancer Cells? Clin Cancer Res, 21, 5047- 5056. 8. Ratto G.B., Cafferata M.A., Scolaro T., et al (2000). Phase II study of combined im- munotherapy, chemotherapy, and radiother- apy in the postoperative treatment of ad- vanced nonsmall-cell lung cancer. J Immuno- ther, 23, 161 - 167. 9. Zhong R., Han B., Zhong H. (2014). A prospective study of the efficacy of a combina- tion of autologous dendritic cells, cytokine- induced killer cells, and chemotherapy in ad- vanced non-small cell lung cancer patients. Tumour Biol, 35, 987 - 994. 10. Li R., Wang C., Liu L et al (2012). Autologous cytokine-induced killer cell immu- notherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother, 61, 2125 -2133. 11. Dagur P.K. and McCoy J.P Jr (2015). Collection, Storage, and Preparation of Hu- man Blood Cells. Curr Protoc Cytom, 73, 1 - 20. 12. Rosenblatt J., Wu Z., Vasir B et al (2010). Generation of Tumor-specific T Lym- phocytes Using Dendritic Cell/Tumor Fusions and Anti-CD3/CD28. J Immunother, 33, 155- 166. 13. Monks C.R., Freiberg B.A., Kupfer H et al (1998). Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature, 395(6697), 82 - 86. 14. Teschner D., Wenzel G., Distler E et al (2011). In vitro stimulation and expansion of human tumour-reactive CD8+ cytotoxic T lym- phocytes by anti-CD3/CD28/CD137 magnetic beads. Scand J Immunol, 74(2), 155 - 164. 15. Cornish G.H., Sinclair L.V. and Cantrell D.A. (2006). Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15. Blood, 108, 600 - 608. TCNCYH 115 (6) - 2018 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary EXPANSION, ACTIVATION OF TCD8 FROM LUNG CANCER PATIENTS Autologous T lymphocyte-based immunotherapy is an efficacious and safe treatment for various types of cancer including lung cancer. The observational study included 10 lung cancer patients where TCD8 was extracted, expanded and activated. The total number of mononuclear cells isolated from 10ml of peripheral blood was (5.13 ± 2.97) x 106. The total number of cells, after culturing, averaged (3.9 ± 1.45) x 109 cells and the cell survival rate was 90.37% ± 1.88%. The cultured lymphocytes consisted of 22.1% ± 9.59% TCD4 and 66.11% ± 11.02% TCD8. Har- vested, expanded, and activated autologous lymphocytes are free of bacterium, mycoplasma and endotoxin. Key words: Cellular immunotherapy, autologous T lymphocytes, lung cancer 16. Guo-Qing Zhang., Fang Li., Sheng- Jie Sun et al (2015). Adoptive Immunotherapy for Small Cell Lung Cancer by Expanded Acti- vated Autologous Lymphocytes: a Retrospec- tive Clinical Analysis. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 16, 1487 - 1494. 17. Kazuro Iwai., Kenzo Soejima., Shoji Kudoh et al