Phân lập và thiết lập chất đối chiếu isoquercitrin

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 150 PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ISOQUERCITRIN Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Ngọc Trái*, Hoàng Anh Việt*, Nguyễn Thị Phương Trang*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mục tiêu: Phân lập và xây dựng chất chuẩn isoquercitrin từ lá Trinh nữ hoàng cung (TNHC) để làm chất đối chiếu. Phương pháp: Isoquercitrin được chiết xuất và phân lập từ lá TNHC bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi là cồn 70%. Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel được tẩm đệm pH 3-4. Độ tinh khiết, điểm chảy của chất phân lập được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quét nhiệt vi sai. Cấu trúc hợp chất tinh khiết được xác định bằng các kỹ thuật phổ UV, IR, MS và NMR. Kết quả và bàn luận: Qui trình phân lập isoquercitrin từ lá TNHC được báo cáo và độ tinh khiết của isoquercitrin là 98,14% (tính trên nguyên trạng) được xác định bằng HPLC. Qui trình thiết lập chất đối chiếu được thực hiện theo hướng dẫn của WHOvà ASEAN(3,5). Giá trị ấn định, độ lệch chuẩn, độ không đảm bảo đo chuẩn được tính toán theo hướng dẫn của ISO 13528(2).Isoquercitrin đạt yêu cầu của một chất chuẩn sử dụng trong công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng nguyên liệu TNHC và sản phẩm có nguồn gốc từ nguyên liệu này. Từ khóa: trinh nữ hoàng cung, flavonoid, isoquercitrin, chất đối chiếu, thiết lập, phân lập. ABSTRACT ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF THE REFERENCE STANDARD FOR ISOQUERCITRINE FROM THE LEAVES OF CRINUM LATIFOLIUM L. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Ngoc Trac, Hoang Anh Viet, Nguyen Thi Phương Trang, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 150 - 156 Objectives: Isolation and establishment of the reference standard (RS) for isoquercitrine from the leaves of Crinum latifolium L. (Amaryllidaceae). Methods: The total flavonoid from the leaves of Crinum latifolium L. was extracted by percolation extraction with 70% ethanol. The total extracts were separated by CC on buffer-coated sillica gel at pH 3-4. The structure of pure compound was identified by UV, IR, MS and NMR spectrometry. Thepurity,meltingpointof isolated compound were determined by HPLC and DSC, respectively. Results and Conclusions: A procedure for isolation of isoquercitrine from the leave of Crinum latifolium was reported. The content of isolated compound was 98.14% by HPLC. Establishment of the reference standard for isoquercitrine was carried out by general guidelines of WHO and ASEAN(3,5).The standard uncertainty, assigned value, standard deviation were calculated by ISO 13528(2). Isoquercitrine can be accepted as a RS for quality control of materials and products containing Crinum latifolium L. Keywords:crinum latifolium L., flavonoid, isoquercitrin, reference standard, estabishment, isolation. ĐẶT VẤN ĐỀ Isoquercitrin là 1 flavonoid phổ biến trong dược liệu nhưng hiện tại hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia như Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM vẫn chưa cung cấp isoequercitrin như một chất đối chiếu. Trong khi đó thuốc có nguồn gốc từ dược liệu ngày càng được các ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên hệ: DS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 0903838274 Email: nguyenhuulacthuy@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 151 công ty dược và cả người tiêu dùng quan tâm do những tính năng đặc biệt. Các phương pháp phân tích như phương pháp quang phổ, sắc ký, điện di đều cần có chất chuẩn để so sánh và đánh giá mẫu thử. Vì vậy, việc chiết xuất - thiết lập chất chuẩn từ dược liệu đạt yêu cầu chuẩn quốc gia là rất cần thiết để đẩy mạnh việc tiêu chuẩn hóa, nâng cao chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu – Trang thiết bị Lá TNHC (Crinum latifolium L.,) họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) thu hái tại tỉnh Bình Định vào tháng 4/2012năm 2012, được định danh bởi PGS. Võ Thị Bạch Huệ - Khoa Dược, Đại học Y Dược TpHCM. Lá được rửa sạch, phơi khô, xay đạt yêu cầu chiết xuất và bảo quản trong túi nhựa chống ẩm trước khi thử nghiệm, độ ẩm khoảng 12%. Các chất phân lập bằng bằng sắc ký cột dùng chất hấp phụ sillicagel pha thường cỡ hạt 0,04- 0,063 mm (Merck) có tẩm đệm pH 3-4. Độ tinh khiết được xác định bằng hệ thống HPLC Alliance 2695-2996 và thiết bị DSC Q20.Các phổ khối được thực hiện trên máy LC- MS hiệu Micro Quattro API ESCi Multi-mode Ionization (Micromass). Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FTNMR Spectrometer (Viện hóa học và Công nghệ Việt nam).Tủ đóng ống Labconco Protector Glove Box (Viện KN thuốc TPHCM). Phương pháp nghiên cứu Chiếtxuất,phânlập,tinhchế Isoquercitrin được phân lập từ cao polyphenol toàn phần chiết từ lá TNHC.Các kỹ thuật được sử dụng như sắc ký cột, thay đổi dung môi, kết tinh lại để đạt độ tinh khiết cao nhất. Xác định độ tinh khiết, xây dựng bộ dữ liệu chuẩn Chất phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, quét nhiệt vi sai. Bộ dữ liệu chuẩn được xây dựng gồm: điểm chảy, phổ UV, IR, MS, 13C-NMR và 1H-NMR. Thiết lập và phân tích đánh giá chất chuẩn Đóng gói, đánh giá độ đồng nhất lô và đánh giá liên phòng thí nghiệm.Các phòng thí nghiệm được chọn đánh giá phải đạt GLP hoặc ISO. Đánh giáđồng nhất lô: các lọ được lấy ngẫu nhiên, số lọ cần là N + 1 lọ, N là tổng số lọ đóng được. Mẫu được xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC, mỗi lọ kiểm tra 2 lần. Đánh giáđộ đồng nhất liên phòng thí nghiệm: thành phẩm sau khi đạt yêu cầu đánh giá đồng nhất lô thì được tiếp tục đánh giá đồng nhất liên phòng thí nghiệm độc lập. Mẫu được đánh giá ở 3 phòng thí nghiệm độc lập đạt ISO/IEC 17025 hoặc GLP. Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được 6 lọ ngẫu nhiên và qui trình đánh giá. Kết quả đánh giá đồng nhất được tính bằng phương pháp thống kê phân tích phương sai một yếu tố ANOVA. Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm Xác định giá trị tái lập của phương pháp phân tích giữa các PTN bằng phương pháp thống kê phân tích phương sai một yếu tố ANOVA. Khi giá trị tái lập đạt yêu cầu, tiến hành xác định giá trị ấn định x*(n), độ lệch chuẩn thực s*(n), độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên chứng chỉ theo hướng dẫn của ISO 13528(2). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chiết xuất cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt Dược liệu sau khi chiết SFE được làm ẩm và chiết ngấm kiệt với dung môi cồn 70%. Dịch chiết cồn được loại tạp và thu hồi dung môi đến còn 1/3 thể tích. Dịch chiết sau đó được acid hóa Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 152 bằng acid hydrocloric 1% đến pH khoảng 3 - 4. Dịch acid được chiết với ethylacetat đến khi dịch chiết không còn phản ứng của polyphenol. Dịch ethyl acetat được thu hồi dung môi đến cao (cao polyphenol). Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc: Tách phân đoạn từ cao polyphenol toàn phần bằng sắc ký cột với các điều kiện: cột thủy tinh kích thước 9 x 30 (cm), silicagel có tẩm đệm pH 3-4, mẫu phân tích: 50 g cao polyphenol toàn phần, dung môi khai triển: n-hexan, ether dầu hỏa, cloroform, ethyl acetat, aceton với độ phân cực tăng dần. Thể tích mỗi phân đoạn: 500 ml. Thu được 10 phân đoạn được đặt tên là P1 đến P10. Phân đoạn PL-10 (1200 mg) có thành phần giàu isoquercitrin được thể hiện trên sắc ký lớp mỏng. Do vậy phân đoạn này được sử dụng để phân lập, tinh chế isoquercitrin. Kết tinh từ phân đoạn PL-10 được hoà tan trong cloroform, để kết tinh lại ở nhiệt độ khoảng 25 0C trong 24 giờ. Lọc kết tinh qua phễu thủy tinh xốp. Sau đó rửa bằng ether ethylic và kết tinh lại trong ethyl acetat, thu được 900 mg chất kết tinh có màu vàng, đặt tên là PL-10. Dữ liệu phổ NMR cho kết luận PL-10 là isoquercitrin. Kiểm tra độ tinh khiết và nhiệt độ nóng chảy của PL-10 Phương pháp quét nhiệt vi sai Độ tinh khiết và nhiệt độ nóng chảy của các chất phân lập được kiểm tra bằng thiết bị DSC Q20. Isoquercitrincó nhiệt độ nóng chảy là 2260C và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết là 98,51%. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Qui trình đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH (2005), các kết quả đều nằm trong giới hạn cho phép. Điều kiện triển khai HPLC: cột C8; (250 x 4,6) mm; đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 256 nm; nhiệt độ cột: 40 0C; pha động: acetonitril-acid phosphoric pH 3 (25: 75). Mẫu thử: pha kết tinh trong pha động có nồng độ 100 µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tính phù hợp hệ thống: với điều kiện sắc ký đã lựa chọn Kết quả được tính qua 6 lần tiêm liên tiếp. Hệ thống sắc ký đạt yêu cầu với độ lệch chuẩn không quá 2%, hệ số đối xứng không quá 1,5. Độ phân giải so với các pic tạp lân cận lớn hơn 1,5. Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng. Hình 2: Sắc ký đồ của isoquercitrin. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 153 Hình 3:Sắc ký đồ xác định tạp chất của isoquecitrin Hình 4: Phổ UV của isoquercitrin. Kết quả: độ tinh khiết sắc ký của isoquercitrin là 98,14% tính trên tổng diện tích pic trên chế phẩm nguyên trạng. Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn Tính chất Quan sát bằng cảm quan, isoquercitrin là chất kết tinh màu vàng. Điểm chảy Xác định bằng phương pháp quét nhiệt vi sai 227,94 ± 2 0C. Phổ UV Pha dung dịch isoquercitrin nồng độ 100 µg/ml trong methanol. Quét phổ UV vùng bước sóng từ 200 đến 800 nm, mẫu thử có cực đại hấp thụ ở 255 và 355 (nm). Phổ IR Các dao động của isoquercitrin gồm 3219, 1662,5 và 1060,8 (cm-1). Phổ MS Chất kết tinh isoquercitrin có đỉnh(M+Na)+ = (M+23)+ = 487,33 => M= 464,33. Phổ NMR Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân cho dữ liệu phổ trình bày trong Bảng 1 đã khẳng định cấu trúc của PL-10 là isoquercitrin, công thức phân tử C21H20O12 (M = 464) khi so sánh với dữ liệu phổ của tài liệu(1). Bảng 1: Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C- NMR (125 MHz)/DMSO của PL-10 và isoquercitrin1H-NMR và 13C NMR (DMSO-d6, 300 MHz). C DEPT Isoquercitrin(1) PL-10 δC (ppm) δH (ppm; m) δC (ppm) δH (ppm;m) 2 >C= 156,0 - 156,3 - 3 >C= 133,2 - 133,3 - 4 >C= 177,2 - 177,4 - 5 >C= 161,0 - 161,2 - 6 -CH= 98,6 6,18; d 98,6 6,20; d 7 >C= 164,0 - 164,1 - 8 -CH= 93,5 6,38; d 93,5 6,40; d 9 >C= 156,1 - 156,2 - 10 >C= 103,9 - 103,9 - 1’ >C= 121,0 - 121,1 - 2’ -CH= 116,1 7,56; br 116,2 7,58; d 3’ >C= 144,6 - 144,8 - 4’ >C= 148,3 - 148,4 - 5’ -CH= 115,1 6,83; d 115,2 6,84; d Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 154 C DEPT Isoquercitrin(1) PL-10 δC (ppm) δH (ppm; m) δC (ppm) δH (ppm;m) 6’ -CH= 121,5 7,58; d 121,5 7,57; dd 1” >CH- 100,8 5,45; d 100,9 5,46; d 2” >CH- 74,1 - 74,1 3,16; m 3” >CH- 76,5 - 76,5 3,24; m 4” >CH- 70,0 - 69,9 3,08; m 5” >CH- 77,5 - 77,5 3,08; m 6” -CH2- 61,0 - 62,0 3,56; d - 3,32; m Hình 5: Cấu trúc hóa học của isoquercitrin. Đóng gói vàđánh giáđộ đồng nhất Đóng gói: việc đóng gói được thực hiện trong Glove-box (môi trường khí trơ N2 99,99%, độ ẩm tương đối 10%). Chất phân lập được đóng trong lọ thuỷ tinh nâu, nút có lớp đệm teflon và được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ ổn định 2-8 0C. Khối lượng isoquercitrin đóng trong mỗi lọ là 5 mg. Số lọ đóng được là 100 lọ. Đánh giáđồng nhất lô:số lọ đánh giá là 111100 =+=N lọ. Bảng 2: Kết quả đánh giá đồng nhất lô. Số thứtự mẫu Độ tinh khiết sắc ký isoquercitrin (%) Mẫu thử Độ tinh khiết sắc ký isoquercitrin (%) Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 1 98,01 98,03 7 98,13 98,17 2 98,06 98,08 8 98,14 98,08 3 98,07 98,15 9 98,17 98,12 4 98,09 98,16 10 98,13 98,15 5 98,10 98,07 11 98,13 98,15 6 98,11 98,08 Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: không có giá trị bất thường.Phân tích phương sai một yếu tố ANOVA: Ftn = 1,659< Ftc = 3,020.Như vậy, điều kiện đóng gói ổn định, các lọ đồng nhất trong quá trình đóng gói. Đánh giáđồng nhất liên phòng thí nghiệm Các ống chuẩn được gởi đánh giá tại Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường thuộc Viện kiểm nghiệm thuốc TpHCM và Phòng vật lý đo lường, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc Vĩnh Long. Mỗi phòng thí nghiệm nhận 6 lọ chất đối chiếu và qui trình đánh giá. Kết quả đánh giá từ các phòng thí nghiệm được đánh giá bằng phân tích ANOVA một yếu tố: Ftn=2,445≤ Flt=3,682
độ tinh khiết sắc ký không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Bảng 3: Kết quả đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm Số thứ tự mẫu Độ tinh khiết sắc ký (%) PTN1 PTN2 PTN3 1 98,16 98,15 98,15 2 98,15 98,15 98,18 3 98,14 98,09 98,09 4 98,16 98,07 98,08 5 98,16 98,11 98,18 6 98,15 98,11 98,16 Bảng 4:Kết quả xác định giá trị ấn định độ tinh khiết sắc ký của isoquercitrin. Chu kỳ 0 1 2 3 δ - 0,022 0,012 0,012 x*-δ - 98,13 98,12 98,12 x*+δ - 98,17 98,17 98,17 Trung bình 98,14 98,15 98,15 98,15 SD 0,034 0,016 0,016 0,016 x * 98,15 98,15 98,15 98,15 s * 0,015 0,018 0,018 0,018 Theo hướng dẫn của ISO 13528, từ 18 kết quả trên, chất đối chiếu isoquercitrin được xác định giá trị ấn định là 98,16% với độ lệch chuẩn 0,018, độ không đảm bảo đo là 0,005 và giá trị công bố của chất đối chiếu isoquercitrin có độ tinh khiết sắc ký là 98,16% tính trên chế phẩm nguyên trạng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 155 Hình 6: Nhiệt đồ của mẫu isoquercitrin. Hình 7: Phổ MS của isoquercitrin. Hình 8:Phổ1H-NMR (500 MHz) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 156 Hình 9: Phổ 13C-NMR (125 MHz)/DMSO của isoquercitrin. KẾT LUẬN Chúng tôi đã xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của isoquercitrin và thiết lập được 100 lọ chất đối chiếu. Mỗi lọ chứa 5 mg isoquercitrin có độ tinh khiết sắc ký là 98,16% theo chế phẩm nguyên trạng. Chất đối chiếu đang được bảo quản và theo dõi độ ổn định theo chu kỳ 6, 9, 12, 24, 36 tháng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Deepralard K et al. (2009), “Flavonoidglycosidesfromtheleavesof Uvaria rufawithadvancedglycationend-productsinhibitoryactivity”, Thai J.Pharm. Sci.,33, pp.84-90. 2. International Organisation for Standardization 13528 (2005)- Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. 3. Committee on Asean reference substances (2005), Guidelines for the establishment, handling, storage and use of Asean reference substances, Thailand, pp.2-12. 4. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang (2011),“Isolation and identification of isoquercitrine from the leaves of Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceedingof the 7th Indochina conference on pharmaceutical sciences, pp. 604-606. 5. WHO (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, the WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations met in Geneva from 16 to 20 October 2006, forty- first report, (WHO Technical Report Series, No. 934, Annex 3), pp.59-82. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014