Phương pháp thực hiện karyotype

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN KARYOTYPE Ths.Bs.Huỳnh Minh Tuấn ĐẠI HỌC Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH BỘ MÔN MÔ-PHÔI-DI TRUYỀN-GPB ĐẠI CƯƠNG VỀ DI TRUYỀN 1. QUÁ TRÌNH PHÂN BÀO - NGUYÊN PHÂN: 1 tế bào 2n  2 tế bào 2n - GIẢM PHÂN: 1 tế bào 2n  4 tế bào n 2. CHU TRÌNH TẾ BÀO: 4 pha G1-S-G2-M - Pha G1: tổng hợp protein chuẩn bị cho pha S. - Pha S: tổng hợp ADN. - Pha G2: tổng hợp protein cho pha M. - Pha M (Mitose): phân bào. Cấu trúc NST Chất nhiễm sắc ( chromatine) : Thông tin di truyền. Caryotype: Bộ NST đặc trưng cho từng loài Di truyền tế bào: Kỹ thuật cho phép quan sát bộ NST của một cá thể. Caryotype cho phép phát hiện hai loại bất thường NST + Bất thường số lượng NST + Bất thường cấu trúc NST - Nhân tế bào gian kỳ: Nhiễm sắc chất. - Nhân tế bào vào giai đoạn phân chia: Nhiễm sắc thể. - Quan sát NST rõ nhất vào kỳ giữa khi tế bào bước vào phân chia. - Mục đích của phương pháp là có được một số lượng lớn tế bào ở giai đoạn phân bào * Lấy từ mô mà tế bào ở giai đoạn phân chia mạnh - Tuỷ xương - Gai nhau - Ối - Mô ung thư * Kích thích phân bào bằng tác nhân phù hợp - Lympho T Phương pháp: 4 bước vô trùng - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy. - Nuôi cấy. - Ngưng phân bào. - Sốc nhược trương. 7 bước tiếp theo - Cố định. - Nhỏ Lame. - Biến tính bằng nhiệt. - Nhuộm. - Chụp hình cụm phân bào. - Sắp xếp. - Phân tích và trả kết quả. Kỹ thuật nhuộm band - Band G (Giemsa – Trypsine) - Band R (Heat – Giemsa) - Band C (Centromeric) - Band T (Telomeric) - Band A ( Acridine) - Band Q ( Quinacrine) Band G -Trypsine 0,3  0,05% - PBS/ Sorensen’s Buffer. - Giemsa 5  20%. Các bước tiến hành sắp xếp Dựa vào 3 chỉ tiêu: - Kích thước NST - Vị trí tâm động - Đặc điểm band riêng biệt của từng NST Kích thước NST - Giảm dần từ nhóm A đến nhóm G - Nhóm A có kích thước lớn nhất - Nhóm G có kích thước nhỏ nhất - Nhóm C  F kích thước trung bình đến dưới trung bình Vị trí tâm động - Chỉ số tâm động Ic (Indice centromérique/ centromeric index) Ic = 0,5 Tâm giữa 0,25 < Ic < 0,5 Tâm gần giữa ≤ 0,25 Tâm lệch Ic < 0,1 Tâm đầu. Phân loại nhiễm sắc thể Kích thước nhiễm sắc thể - Chỉ tiêu đầu tiên trong phân loại NST. - Dựa vào kích thước, NST được phân làm 3 nhóm: + Nhóm A, B : kích thước lớn. + Nhóm C, D: kích thước trung bình hay dưới trung bình. + Nhóm E,F,G: kích thước nhỏ. Vị trí tâm động Dựa vào Ic, ta có 3 nhóm NST - Nhiễm sắc thể có tâm giữa hoặc gần giữa : Nhóm A, C, E, F - Nhiễm sắc thể tâm lệch : Nhóm B - Nhiễm sắc thể tâm đầu : Nhóm D, G Band chuyên biệt cho từng NST Band : những vùng sáng tối luân phiên xen kẽ nhau trên NST. Nhiễm sắc thể của cùng 1 cặp có đặc điểm band giống nhau. NST 1 • Lớn nhất, metacentric • p: band sáng ở đoạn xa • q: band tối dưới centromère, 2 band tối rõ NST 2 • Lớn nhất submetacentric • p: 1 band tối gần centomere, 3 band tối gần đoạn xa • q: 1 band tối gần centomere, 2 band tối ở đoạn xa (có thể band kép) NST 3 • Metacentric, kích thước tương tự nhóm B, lớn hơn nhóm C • p: 1 band tối gần đầu tận, 1 band tối đầu tận • q: cánh ngắn đủ để xác định NST 4 • Submetacentric nhiều, lớn hơn nhóm C • p: 1 band tối ở giữa, không phân biệt được với NST số 5 • q: phân biệt bằng band tối ở ngay dưới tâm động NST 5 • Submetacentric nhiều, lớn hơn nhóm C • p: 1 band tối ở giữa, không phân biệt được với NST số 5 • q: 3 band tối giữa, 1 band tối gần đầu tận và band sáng ở đầu tận NST 6 • Submetacentric, lớn nhất trong nhóm C • p: band sáng ở giữa, band tối ở gần trên và dưới tâm động • q: 2 band tối giữa dễ phân biệt NST 7 • Submetacentric, nhỏ hơn NST 6 • p: dể nhận bằng band tối gần đầu tận, và band sáng ở đầu tận • q: 2 band tối giữa dể phân biệt NST 8 • Submetacentric nhiều, giống như NST 10,12 • p: 2 band tối có kích thước bằng band sáng giữa chúng • q: 1 band tối ở giữa nhạt màu, 1 band tối ở đoạn xa đậm màu NST 9 • Thay đổi từ submetacentric ít đến nhiều • p: 1 band tối ở trung tâm • q: 1 vùng nhạt màu ở tâm động (secondary constriction), 1 band tối gần tâm động, 1 band tối kép ở đoạn xa NST 10 • Submetacentric, giống NST 8 • p: 1 band tối ở trung tâm • q: 1 band tối đặc trưng ở đoạn gần, 1 band tối kép ở đoạn xa NST 11 • Submetacentric, nhưng là metacentric nhất trong nhóm C, có thể có secondary constriction • p: 1 band tối ở trung tâm • q: 1 band tối đặc trưng (lớn đậm màu) ở đoạn gần để phân biệt với NST 9. NST 12 • Submetacentric nhiều • p: 1 band tối ở trung tâm, cánh ngắn ngắn nhất nhóm C • q: 1 band tối ở đoạn gần thường hẹp hơn band của NST 11 NST 13 • Acrocentric lớn, không phân biệt được với NST 14,15 • p: vệ tinh • q: 1 band tối hẹp chia nữa đoạn gần làm đôi, 2 band tối rộng chia bởi 1 band sáng hẹp, đầu tận sáng có 1 band tối hẹp NST 14 • Acrocentric lớn, không phân biệt được với NST 13,15 • p: vệ tinh • q: 2 band tối đặc trưng, 1 ở đoạn gần, 1 ở gần đầu tận NST 15 • Acrocentric lớn, không phân biệt được với NST 13,14 • p: vệ tinh • q: 2 band tối như NST 14, 1 ở gần trung tâm cánh dài hơn, 1 ở đầu tận nếu có NST 16 • Thay đổi từ metacentric đến submetacentric • p: 1 band tối hẹp ở trung tâm, chủ yếu là band sáng • q: tâm động bắt màu, 1 band tối dưới tâm động, 1 band tối có vẻ ở đầu tận NST 17 • Giống NST 18 nhưng ít submetacentric hơn • p: 1 band tối ở trung tâm • q: tâm động bắt màu, cánh dài sáng với 2 band tối gần đầu tận NST 18 • Giống NST 17 nhưng submetacentric hơn, thường giống với NST Y • p: sáng • q: 2 band tối đặc trưng 1 ở đoạn gần 1 ở đoạn xa NST 19 • Metacentric nhỏ nhất, khó phân biệt với NST 20 • p: sáng, 1 band tối hẹp giữa • q: sáng, 1 band tối hẹp ở đoạn gần có thể xem như 1 phần của tâm động. Tâm động bắt màu NST 20 • Metacentric nhỏ nhất, khó phân biệt với NST 19 • p: 1 band tối gần đầu tận • q: 2 band tối hẹp NST 21 • Acrocentric, khó phân biệt với NST 22 • p: vệ tinh • q: 1 band tối đoạn gần, band sáng ở telomere NST 22 • Acrocentric, khó phân biệt với NST 22 • p: vệ tinh • q: Centomere bắt màu, cánh dài sáng kèm với 1 band ở giữa NST X • Submetacentric, kích thước như NST 7 • p: 1 band tối đậm ở giữa • q: 1 band tối đậm đối xứng với band cánh ngắn NST Y • Submetacentric nhiều, cánh dài thay đổi tuỳ thuộc vào đoạn heterochromatin, có thể ngắn như NST 21 hay dài như NST 13 • p: sáng • q: sáng màu ở dưới centomere, band tối đậm ở đầu tận, kích thước band phụ thuộc nhiều vào số lượng heterochromatin