Thí nghiệm chuyên đề công nghệ tách chiết hợp chất thiên nhiên

Hợp chất thiên nhiên (natural product), phân tửsinh học tựnhiên (biological molecule) là chất biến dưỡng thứcấp được tạo ra bởi cơthểcủa một sinh vật, chất biến dưỡng thứ cấp có thểcần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho cơthểsinh vật. Các chất biến dưỡng thứcấp của thực vật thường thuộc các nhóm sau: alcaloid, quinonoid, steroid, terpenoid, iridoid, flavonoid, glycosid . Nếu những chất đại phân tửcó trọng lượng phân tửlớn, tính chất hóa học tương đối đồng nhất, người ta có thể đềxuất được một sốqui trình tổng quát đểchiết tách cô lập chúng thì các hợp chất thiên nhiên có trọng lượng phân tửnhỏ, tính chất hóa học đa dạng, khác biệt nên không có qui trình tổng quát nào có thểáp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một sốphương pháp khác nhau. Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tựnhiên Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem những chất này có hoạt tính sinh học gì? Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp chất đạt độtinh khiết >95% mới có thểkhảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp quang phổhiện đại. Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thửnghiệm cho kết quảhấp dẫn thì sẽxem xét có thểtổng hợp hóa học hợp chất đó đểcó sốlượng nhiều hơn.

15 trang | Chia sẻ: lamvu291 | Lượt xem: 1868 | Lượt tải: 4

Bạn đang xem nội dung tài liệu Thí nghiệm chuyên đề công nghệ tách chiết hợp chất thiên nhiên, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

THÍ NGHI M CHUYÊN CÔNG NGH TÁCH CHI T H P CH T THIÊN NHIÊN GV: ThS. Hoàng Minh H o KS. Nguy n Bình Kha TÀI LI ỆU THAM KH ẢO [1]. Nguy n Kim Phi Ph ng (2007), Ph ươ ng pháp cô l ập h ợp ch ất h ữu c ơ, NXB H Qu c Gia TP. HCM. [2]. Nguy n Khác Qu nh C (1999), Bài gi ảng chi ết xu ất d ược li ệu. B môn d ưc li u. H Y-Dưc TP. H Chí Minh, 45-97. BÀI 1: M U Hp ch t thiên nhiên (natural product), phân t sinh h c t nhiên (biological molecule) là ch t bi n d ưng th c p ưc t o ra b i c ơ th c a m t sinh v t, ch t bi n d ưng th cp có th c n thi t ho c nhi u khi không c n thi t cho c ơ th sinh v t. Các ch t bi n d ưng th c p c a th c v t th ưng thu c các nhóm sau: alcaloid, quinonoid, steroid, terpenoid, iridoid, flavonoid, glycosid…. Nu nh ng ch t i phân t có tr ng l ưng phân t l n, tính ch t hóa h c t ươ ng i ng nh t, ng ưi ta có th xu t ưc m t s qui trình t ng quát chi t tách cô l p chúng thì các h p ch t thiên nhiên có tr ng l ưng phân t nh , tính ch t hóa hc a dng, khác bi t nên không có qui trình t ng quát nào có th áp d ng chung cho t t c các nhóm, mà m i lo i nhóm ph i có m t s ph ươ ng pháp khác nhau. Mục đích c ủa vi ệc tách chi ết, cô l ập h ợp ch ất t ự nhiên Kh o sát thành ph n hóa h c c a m t cây m i, tr ưc ó ch ưa ai nghiên c u và xem nh ng ch t này có ho t tính sinh h c gì? Mu n bi t ưc iu này c n ph i cô l p h p ch t t tinh khi t >95% m i có th kh o sát c u trúc hóa h c b ng ph ươ ng pháp quang ph hi n i. Cn có thêm l ưng m u m t h p ch t ã bi t c u trúc hóa h c, mu n kh o sát thêm v ho t tính sinh h c c a ch t ó. N u vi c th nghi m cho k t qu h p d n thì s xem xét có th t ng h p hóa h c h p ch t ó có s l ưng nhi u h ơn. Tìm hi u m t h p ch t ã bi t và xem ch t này ưc s n sinh ra t b ph n nào c a sinh v t (s sinh t ng h p). Tìm hi u s khác bi t c a nh ng ch t bi n d ưng th c p ưc s n sinh ra t cùng m t ngu n t nhiên nh ưng không cùng iu ki n sinh thái: thí d tìm hi u xem hai th c v t cùng h (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng m c hai n ơi có di u ki n khí h u, t ai th nh ưng khác nhau có ch a cùng nh ng h p ch t t nhiên và nh ng ch t này có cùng hàm l ưng hay không? Có nhi u ph ươ ng pháp tách chi t, cô l p h p ch t t nhiên t cây c : S c ký c t, s c ký l p m ng, s c ký gel, s c ký khí, s c ký l ng hi u n ng cao. Trong h ưng h p ch t thiên nhiên, vi c cô l p ch t ph c t p h ơn vì không bi t ưc cây ang kh o sát có ch a các h p ch t v i c u trúc hóa h c nh ư th nào. Bi t r ng cây c c n kh o sát có ch a nhi u lo i h p ch t h u c ơ, t lo i không phân c c n lo i r t phân c c, vì th n u mu n cô l p h p ch t mà áp d ng s c ký c t tr c ti p ngay trên cao thô ban u s r t khó t ưc k t qu mong mu n. Vì v y, ng ưi ta th ưng chu n b m t lo t các cao chi t có tính phân c c t ng d n, nh ư th m i lo i cao chi t ch a tươ ng i ít h p ch t, giúp cho quá trình cô l p h p ch t tinh ch t d dàng. Mu n có các lo i cao có phân c c khác nhau, s d ng các dung môi chi t có phân c c khác nhau, d a trên nguyên t c chung là “các ch t gi ng nhau s hòa tan nhau”: dung môi không phân c c hòa tan t t các h p ch t không phân c c, dung môi có tính phân c c trung bình s hòa tan các h p ch t có tính phân c c trung bình và dung môi phân c c m nh s hòa tan t t các h p ch t phân c c. BÀI 2: S C LÝ L P M NG VÀ NH TÍNH S HI N DI N C A MT S NHÓM H U C Ơ I. M c ích Trang b nh ng k n ng, thao tác khi kh o sát các h p ch t t cây c b ng k thu t s c ký l p m ng. Sinh viên có th nh tính s hi n di n c a m t s nhóm h p ch t h u c ơ b ng ph ươ ng pháp v t lý và hóa h c. II. C s lý thuy t Sc ký l p m ng (SKLM) ( Thin Layer Chromatography (TLC)) còn g i là s c ký ph ng (planar chromatography), d a ch y u vào hi n t ưng h p thu, trong ó pha ng là m t dung môi hay m t h n h p dung môi, di chuy n qua m t pha t nh là m t ch t h p thu tr ơ. Thí d : silica gel hay oxit alumin. Pha t nh này ưc tráng thành m t l p m ng, u, ph lên m t n n ph ng nh ư t m ki ng, t m nhôm ho c t m plastic. Do ch t h p thu ưc tráng thành m t l p mng nên ph ươ ng pháp này g i là s c ký l p m ng. Bình s c ký: M t ch u, h , l …b ng th y tinh, có n p y. Pha t nh: M t l p m ng kho ng 0,25 mm c a m t lo i ch t h p thu thí d nh ư silica gel, alumin…. Mu phân tích: M u ch t c n phân tích th ưng là h n h p g m nhi u h p ch t v i phân c c khác nhau. Pha ng: Dung môi ho c h n h p hai dung môi, di chuy n ch m ch m d c theo t m lp m ng và lôi kéo m u ch t i theo nó. III. Cách ti n hành 1. Các b c chu n b tr c khi SKLM 1.1 Chu n b vi qu n Dng c ng vi qu n èn c n Kp L th y tinh Gi y th m Aceton Cách ti n hành Dùng 2 tay c m 2 u ng vi qu n, h ơ nóng on gi a c a vi qu n n khi m m d o. em vi qu n tránh kh i ng n l a r i kéo t t hai u ng ra xa. Gi yên cho n khi th y tinh c c ng l i. Ti n hành r a vi qu n ã kéo b ng cách ch m vào l th y tinh có ch a aceton, l y vi qu n ra và ch m vào gi y th m rút b aceton. Làm l i vài l n vi qu n ưc s ch. 1.2 . Ch m m u lên t m bn m ng 1.2.1. SKLM b n nh Dng c : Tm b n m ng th ươ ng m i 20x20cm Kéo c t Th ưc Bút chì Vi qu n ã kéo Mu ã ch m b n m ng Máy s y Hóa ch t: eter d u h a, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, n ưc c t Cách ti n hành Mu là ch t l ng, l y m u và ch m tr c ti p trên b n m ng. M u là ch t r n thì ph i hòa tan m u trong dung môi h u c ơ phù h p, n ng 2-5%, dung môi hòa tan m u không nh t thi t là dung môi gi i ly. Ct t m b n m ng nh (5x2cm), dùng vi t chì k m t ưng th ng phía d ưi b ng cao 1cm làm m c xu t phát. M t ưng th ng phía trên b n m ng cao 0.5cm làm ti n tuy n dung môi. Ch m vi qu n nhúng vào dung d ch m u, chm nh u vi qu n vào t m b n m ng t i vch xu t phát. Nhanh chóng nh c vi qu n r i kh i t m b n m ng v t ch m ch lan r ng ra thành v t tròn có ưng kính 2-5mm. Sau khi ch m xong, s y nh dung môi bay ra kh i v t ch m r i nhúng vào dung d ch gi i ly. Nu c n kh o sát m t l ưt nhi u m u khác nhau, chu n b và ch m m i m u m t v t trên bn m ng. V t này cách v t kia 1cm. Hai v t ngoài bìa ph i cách b c nh 1,5cm. 1.2.2. S c ký l p m ng iu ch (20x20cm) Vi SKLM iu ch , dung d ch m u ch t s ưc ch m lên thành m t ưng dài, u, d c theo v ch xu t phát b ng cách dùng vi qu n kéo m t ưng dài d c theo v ch xu t phát. 1.3. Gi i ly b n m ng 1.3.1. Chu n b bình gi i ly b n m ng Dng c Bình gi i ly (bình ph i có n p y) Gi y l c (c t sao cho b v a vào bình gi i ly) ng ong 10ml, 100ml a th y tinh Hóa ch t: Eter d u h a, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, n ưc c t 1.3.2. Gi i ly b n m ng Cách ti n hành Pha dung môi (h dung môi) phù h p cho vào bình gi i ly có t s n m t t m gi y th m (gi y l c), nghiêng o nh dung môi th m ưt t gi y l c (làm cho dung môi trong bình ưc bão hòa). t t m b n m ng vào bình gi i ly, c nh áy c a b n m ng ch m vào áy c a bình và ng p vào dung môi. Các v t ch m m u không ưc ng p vào dung môi. Khi dung môi n m c ti n tuy n (v ch phía trên) b n m ng thì ng ưng quá trình gi i ly. Ly b n m ng ra, s y khô dung môi. Ti n hành hin hình m u th b ng các thu c th c tr ưng. 2. Hi n hình các v t sau khi gi i ly Sau khi gi i ly xong, các h p ch t có màu s ưc nhìn b ng m t th ưng, nh ưng ph n l n các ch t h u c ơ không có màu nên mu n nhìn th y các v t c n s d ng các ph ươ ng pháp hóa hc ho c v t lý. 2.1. Ph ng pháp v t lý Phát hi n b ng tia t ngo i (UV) Dng c : èn chi u UV Vi t chì Cách ti n hành : Bn mng sau khi gi i ly xong, s y khô, t b n m ng vào èn UV, quan sát màu, n u quan tâm thì dung vi t chì khoanh l i. 2.2. Ph ng pháp hóa h c: Phát hi n b ng các thu c th c tr ưng Dng c : Kp Máy s y Cu n b ng keo Kéo Hóa ch t I2 Dd FeCl 3 Dd H 2SO 4 50% Thu c th Màu c a v t Hp ch t H ơi I 2 Vàng ho c nâu Hp ch t h u c ơ nói chung H2SO 4 Vàng m n da cam Flavon, Flavonol H2SO 4 Màu ho c xanh d ươ ng – Chalcon, auron H2SO 4 Màu cam n Flavonoid FeCl 3 Xanh l c n xanh en Sesquiterpen Màu s m ( max : 545nm) Màu xanh d ươ ng en (max : 595nm) H2SO 4 Màu tím Triterpen Cách ti n hành: B n m ng sau khi gi i ly xong, s y khô. N u hi n hình b ng h ơi I 2 thì t bn m ng trong bình ch a I 2. N u hi n hình b ng dung d ch FeCl 3, hay H2SO 4 thì nhúng t m bn m ng vào l ch a dung d ch ó, l y ra và l c nh cho thu c th ch y xu ng h t. Ti n hành nưng bn m ng bng máy s y hay b p in, các v t màu s hi n lên, dùng b ng keo dán t m bn m ng l i t m b n m ng không b v ti n cho quan sát l n sau. Trên t m b n m ng ph i ghi rõ dung môi ho c h dung môi gi i ly. BÀI 3: CHI T XU T TINH D U I. M c ích: Giúp sinh viên n m ưc ph ươ ng pháp tách chi t tinh d u b ng ph ươ ng pháp lôi cu n h ơi nưc. II. C s lý thuy t Mu n kh o sát tinh d u trong cây nên ti n hành vi c lôi cu n h ơi n ưc trên m u cây t ươ i, tránh th t thoát tinh d u vì tinh d u có tính bay h ơi cao. Nưc khi b un nóng s b c thành h ơi bay lên, h ơi n ưc bay lên mang theo tinh d u. Dng c , hóa ch t và cách ti n hành Dng c Bình c u, erlen Bp un, ng ng ưng h ơi Các ng n i b ng th y tinh Hóa ch t Nưc V b ưi, v chanh Cách ti n hành Mu ưc c t nhuy n, ưc t vào bình c u, cho n ưc c t vào bình sao cho ph n th tích ca c m u và n ưc ch chi m t i a hai ph n ba th tích bình c u. L p h th ng và c m b p in un nóng. Nưc trong bình c u khi b un nóng s b c thành h ơi bay lên, h ơi n ưc bay lên mang tinh d u, h ơi này b ng ng ưng h ơi làm l nh, ng ưng t tr thành th l ng, r ơi xu ng ng g n. Trong ng g n, dung d ch tách thành hai l p g m l p n ưc và l p tinh d u. Tùy theo tinh du nh h ơn n ưc hay nh h ơn n ưc, khi ráp h th ng s l a ch n ng g n cho phù h p. V n ti p t c un nóng h th ng, l p n ưc trong ng g n càng lúc càng nhi u, s ưc tr v bình cu nh ng nhánh ngang thông nhau. Nh ng này mà không c n ph i ti p thêm n ưc cho h th ng trong quá trình ch ưng c t. Lúc này ch c n m khóa ng g n là có th thu l y tinh du. BÀI 4: S C KÝ C T I. Mc ích ây là m t trong nh ng k thu t nh m phân on cao thô ban u (cao etanol, metanol, butanol) ra thành các phân on cao nh h ơn, có phân c c khác nhau, hoc cô l p ra h p ch t tinh khi t t m t phân on cao nh . II. C s lý thuy t S s c ký là m t ph ươ ng pháp v t lý tách m t h n h p g m nhi u lo i h p ch t ra riêng thành t ng lo i ơn ch t, d a vào tính ái l c khác nhau c a nh ng lo i h p ch t ó i vi m t h th ng (h th ng g m hai pha: m t pha ng và m t pha t nh). Vi c tách hai h p ch t nào ó ra riêng có t ưc k t qu t t hay không là tùy vào h s phân chia. B t k m t h p ch t nào khi t vào m t h th ng g m hai pha (hai pha: l ng- lng ho c r n-lng), lúc t n tr ng thái cân b ng, h p ch t ó s phân b vào m i pha v i mt t l n ng c nh, t l này thay i tùy vào các tính ch t ng h c c a h p ch t và ca c hai pha. Cng t ươ ng t , m t h n h p g m nhi u lo i h p ch t khác nhau khi ưc t vào h th ng g m hai pha, vì th s có t ươ ng tác m nh/y u khác nhau i v i pha t nh. H qu là m i lo i h p ch t s di chuy n ngang qua pha t nh v i m t v n t c khác nhau, nh v y, k thu t sc ký có th tách riêng các lo i h p ch t. Sc ký c t h ưc ti n hành iu ki n áp su t khí quy n. Pha t nh th ưng nh ng h t có kích th ưc t ươ ng i l n (50-150µm), ưc n p trong m t c t b ng th y tinh. M u ch t c n phân tích ưc t phía trên u pha t nh, có m t l p bông th y tinh t lên trên b m t không b xáo tr n l p m t. Dung môi gi i ly ươ c ư a ra và h ng trong nh ng l nh phía dưi c t, r i em i cô quay ui dung môi, dùng s c ký l p m ng theo dõi quá trình gi i ly. Trong loi sc ký c t v i pha t nh là silica gel lo i th ưng, h p ch t không phân c c ưc gi i ly ra kh i c t tr ưc, h p ch t phân c c ưc gi i ly ra sau: Bng 1 : Các lo i h p ch t có tính phân c c t ng d n Lo i h p ch t Th t gi i ly ra kh i c t Hydrocarbon Alken Eter Hydrocarbon R-H Hp ch t th ơm Ceton Aldehyde Ester Alcol Amin Acid carboxylic Các h p ch t ki m m nh Ch m nh t, c n dung môi phân c c III. Dng c , hóa ch t Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography) Dng c Ph u l c x p b ng th y tinh v i x p c a l thu c lo i 2 ho c lo i 3 dòng ch y c a dung môi ưc thu n l i, ưng kính trung bình c a l x p 41-100µm. Chén s và chày nh Bình tam giác H th ng t o chân không nh b ng vòi n ưc (máy b ơm). 2 cái mu ng Bông gòn, kéo 5 l th y tinh (100ml) Hóa ch t Silica gel khô (c h t 15-40 µm) Eter d u h a, cloroform, etyl acetat, metanol, n ưc c t, aceton. Sắc ký c ột h ở (open-column chromatography) Dng c Ct th y tinh ( ưng kính 1.5cm, cao 60cm) 2 cái k p 1 giá (gi c t) 1 becher 100ml, a th y tinh ng ong 100ml Bông gòn th m n ưc Ph u th y tinh nh , các l th y tinh (100ml, 50ml) Hóa ch t Silica gel (50-150µm) Eter du h a, chloroform, etyl acetat, metanol, acetone, nưc. IV. Cách ti n hành Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography) a) Nạp ch ất h ấp thu vào c ột Ráp h th ng g m ph u l c x p g n trên bình tam giác, bình này n i v i m t máy b ơm hút t o chân không, cho máy b ơm ho t ng. Múc t ng l ưng nh silica gel khô cho vào ph u, dùng mu ng nén nh silica gel xu ng áy ph u, m i l n m i ít, t ng l p, t o thành mt kh i r n, ng nh t, ch t ch , có b m t b ng ph ng. Chi u dày l p silica gel kho ng 5cm. N u cn tách m t l ưng m u ch t nhi u h ơn thì s d ng ph u to h ơn, có ưng kính ln h ơn. Bng 2: M i liên quan gi a l ưng m u và kích th ưc ph u trong s c ký-nhanh c t khô. Lưng m u ưng kính trong Chi u cao l p h p Phân on dung ca ph u (cm) thu dch gi i ly (ml) <100 mg 0,5-1,0 4 10-15 0,5-1,0 g 2,0-3,0 4 20-30 1,0-10,0 g 5 5 30-50 10,0-20,0 g 10 5 50 b) Cân b ằng c ột s ắc ký Sau khi n p pha t nh xong, ch nh l p b m t pha t nh cho b ng ph ng, t m t l p bông gòn dày lên b m t c t b o v l p m t. Cân b ng c t b ng lo i dung môi ít phân c c nh t, lo i dung môi dùng gi i ly u tiên. Cho m t l ưng l n dung môi lên u c t, m máy b ơm, dung môi s ưc hút xu ng bình tam giác. Th c hi n vài l n, n khi ch t h p thu ng nh t trong c t thì d ng, c t ưc cân b ng. c) Nạp m ẫu lên đầu c ột và gi ải ly c ột Nạp m ẫu thô : Dùng mu ng múc t ng lưng nh silica gel vào cao thô ban u, nghi n thành b t, sau khi nghi n thành b t m n xong, l y l p bông gòn ra kh i c t, dùng mu ng múc b t nghi n vào u c t, dùng mu ng tr i u ph n b t này có m t l p m ng, không ưc è nén l p b t này. Ly l p bông gòn lúc n y ph tr l i lên m t c t, b m t này s không b xáo tr n khi gi i ly. Cho máy b ơm ho t ng, rót m t l ưng v a ph i dung môi lên b m t ph u, khi máy bơm rút h t ph n dung môi, ng t áp su t, rót ph n dung d ch v a gi i ly ang ch a trong bính tam giác và các l có ánh s th t . G n ph u vào h th ng, rót dung môi, cho máy bơm hút ho t ng, hút ph u khô. Mi l n ph i hút khô ph u r i m i cho dung môi m i vào. Ghi chú: ôi khi m i b t u gi i ly, c t b ngh t, dung môi không hút qua ưc là do các hp ch t phân c c nào ó ã k t tinh l i khi g p dung môi ít phân c c. Gi i quy t b ng cách dùng spatule khu y x i tr n l p b m t c a c t lên kho ng 0,5cm, r i ti p t c gi i ly bình th ưng. Sắc ký c ột h ở (open-column chromatography) a) Ch ọn ch ất h ấp thu để nh ồi c ột Silica gel pha th ưng (50-150µm) b) Ch ọn dung môi cho quá trình s ắc ký c ột Tr ưc khi tri n khai s c ký c t, nh t thi t ph i s d ng s c ký l p m ng dò tìm h dung môi gi i ly cho phù h p. Các b ưc tu n t nh ư sau: + M u ch t c n s c ký ưc hòa tan trong dung môi phù h p, v i n ng 10mg/ml. G i là dd m u (A). + Chu n b 5-6 t m bn m ng (2x5cm), ch m lên nh ng t m b ng này, m i ch m kho ng 2-5µl dung d ch m u (A). + M i b ng ưc gi i ly v i các dung môi ho c h dung môi có phân c c khác nhau, ti n hành hi n hình các v t m i b ng b ng UV hay thu c th . + i v i m u cao khô chi t xu t t cây c (cao ch a các h p ch t t ít phân c c n phân cc), ch n dung môi gi i ly u tiên là dung môi có th y v t ít phân c c nh t c a cao chi t lên v trí b ng v i R f = 0,5 và ch n dung môi ch m d t s c ký c t là dung môi có th y v t phân c c nh t c a cao chi t v i R f = 0,2. c) Tỷ l ệ gi ữa l ượng m ẫu ch ất c ần tách đố i v ới kích th ước c ột - T l gi a l ưng m u c n tách và l ưng ch t h p thu s d ng: Tr ng l ưng ch t h p thu ph i l n h ơn 25-50 l n tr ng l ưng c a m u. - T l gi a chi u cao ch t h p thu trong c t và ưng kính trong c t s c ký: Chi u cao ch t h p thu: ưng kính trong c a c a c t = 10:1. d) Nạp ch ất h ấp thu d ạng s ệt vào c ột - Gi cho c t th ng ng trên giá, u ra c a c t dùng mi ng th y tinh x p ho c mi ng bông gòn ch n. - Trong m t becher ã có s n dung môi (dung môi u tiên cho quá trình gi i ly c t), cho ch t h p thu vào becher, u n m i l n m t l ưng nh , v a rót, v a khu y nh u. Lưng dung môi s d ng ph i v a h n h p không ưc quá s t, khi n cho b t khí s b b t gi trong c t và c ng không ưc quá l ng. - Nh m t phu l c có uôi dài t trên c t, rót h n h p s t vào c t, v a m nh khóa bên d ưi c t cho dung môi ch y ra, h ng vào m t becher tr ng bên d ưi c t, dung môi này ưc s d ng l i rót tr l i lên u c t. - Ti p t c rót ch t s t vào c t cho n khi h t, v a rót v a dùng m t thanh cao su gõ nh bên ngoài thành c