Thiết lập bản đồ gen rầy nâu trên quần thể f2 cây lúa (oryza sativa)

THIẾT LẬP BẢN ĐỒ GEN RẦY NÂU TRÊN QUẦN THỂ F2 CÂY LÚA (ORYZA SATIVA) Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu Viện Lúa Đồng Băng Sông Cửu Long I. MỞ ĐẦU Tính kháng sâu, bệnh hại lúa là mục tiêu quan trọng trong chương trình cải tiến giống lúa. Tuy nhiên, tính kháng sâu bệnh thường bị phá vỡ sau vài năm giống được đưa ra sản xuất. Chiến lược chồng gen kháng nhờ sự giúp đỡ của Chỉ thị ADN, với nguồn gen được khai thác từ lúa hoang, lúa địa phương đang được khuyến khích. Chúng ta vẫn chưa biết hết những bí ẩn của tương tác giữa ký sinh và ký chủ, sự phá vở tính kháng do sức ép chọn lọc cao. Thí dụ như tính kháng rầy nâu và bệnh đạo ôn được điều khiển bởi gen đơn, nhưng sự thể hiện tính kháng này vô cùng phức tạp, người ta phải sử dụng thuật ngữ "complex", vì tính kháng không ổn định trong điều kiện thâm canh cao và chiến lược quản lý giống trong sản xuất không hợp lý, sự biến dị trong pathogen hoặc loại hình sinh học (biotype). Việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật marker phân tử trong chọn giống lúa chống chịu sâu bệnh hại chính đang được phát triển. Với sự thuận lợi của những chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật PCR, chúng ta đã giảm rất nhiều chi phí nghiên cứu so với sử dụng RFLP.Tuy nhiên để chọn lựa chỉ thị nào liên kết với một gen kháng bệnh, bản đồ di truyền của gen phải được thiết lập. Lập bản đồ di truyền trên cây lúa bằng chỉ thị phân tử Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ liên kết gen trên cây lúa đầu tiên với RFLP bao gồm 135 loci. Bản đồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng 1.389 cM trên hệ gen cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (javanica). Ba năm sau đó, bản đồ thứ hai được thiết lập từ quần thể IRAT117(japonica) và Apura (indica) (Mc Couch 1991, Tanksley và ctv 1991). Một nhóm tác giả khác là Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ di truyền dựa trên cặp lai Kasalath (indica) và Fl134 (japonica) với 347 chỉ thị RFLP, phủ trên 12 nhiễm sắc thể, với chiều dài tổng cộng 1.836 cM trên hệ gen cây lúa. Causse và ctv (1994) thiết lập một bản đồ khác dùng chỉ thị RFLP để xây dựng bản đồ di truyền từ quần thể hồi giao (backcross) giữa O.sativa (dạng hình indica) và O..longistaminata. Chúng bao gồm những chỉ thị từ hệ gen cây lúa với ký hiệu RG và RZ , từ lúa mì với ký hiệu CDO và lúa mạch với ký hiệu BCD. Tổng số 600 chỉ thị phủ trên 12 nhiễm sắc thể. Kurata và ctv (1994) dùng quần thể F2 của Nipponbare (japonica) và Kasalath (indica) để thiết lập lập bản đồ di truyền. Bản đồ được bao phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng chiều dài 1.575 cM. Vịệc thiết lập bản đồ trên tâm động (centromere) cũng được thực hiện với 170 chỉ thị RFLP (Singh và ctv. 1996). Lập bản đồ cho gen rầy nâu Đối với rầy nâu, việc dùng chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật PCR, để lập bản đồ gen rất phức tạp và khó khăn. Ishii và ctv. (1994) đã thiết lập bản đồì RFLP và xác định gen Bph- 10 kháng biotype 2 và 3, định vị trên nhiễm sắc thể 12 liên kết với RG457. Cặp primer được thiết kế từ RG457 (chỉ thị STS ) đã phát hiện được gen kháng rầy nâu Bph-10 với khoảng cách di truyền 1.7 cM trên quần thể lúa hoang Oryza australiensis và những dòng con lai có xuất xứ từ loài lúa hoang này (Lang và ctv. 1999). Trong báo cáo này, chúng tôi muốn trình bày tính khả thi của việc sử dụng vật liệu lúa địa phương để xây dựng quần thể con lai, áp dụng trong kỹ thuật thiết lập bản đồ liên kết gen với chỉ thị phân tử trên cơ sở kỹ thuật PCR, nhằm phát hiện gen kháng rầy nâu, kháng bệnh đạo ôn và bạc lá, phục vụ chiến lược MAS (chọn giống nhờ chỉ thị phân tử) II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Quần thể con lai từ những vật liệu sau đây để nghiên cứu tính kháng rầy nâu Thanh lọc rầy nâu : quần thể con được thử và đánh gía kháng rầy nâu + Nguồn rầy nâu thu thập tại Viện Lúa Ô Môn. + Các dụng cụ nuôi rầy và thanh lọc rầy , trong nhà lưới. + Giống lúa mùa Tài nguyên và TN1 được cung cấp làm thức ăn cho rầy Thanh lọc theo phương pháp hộp mạ của IRRI,ba lần nhắc lại, giống TN 1, IR 64 làm chuẩn nhiễm và PTB 33, Hoa Lài làm chuẩn kháng. Khi cây mạ ở giai đoạn 2 đến 3 là, tiến hành thả rầy tuổi 1 đến 3, mật số 4-6 con / cây. Quan sát lúc giống TN 1 cháy rụi (cấp 9), đánh giá cấp hại đối với vật liệu thí nghiệm theo thang điểm 9 cấp của IRRI. Phương pháp phân tích PCR-based MAS Chỉ thị STS theo phương pháp Lang 2002 Microsatellite: Sản phẩm PCR được chuẩn bị trong 10mM Tris-HCl (pH 8), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1 unit của TAKARA Taq, 4 nmol dNTP, 10pmol primer và 50ng ADN. Sử dụng thermal cycler 9600 (Perkin-Elmer), chu kỳ nhân gen được thiết kế như sau: tách dây đơn ở 95oC trong 5 phút, tiếp theo đó là 35 chu kỳ: 94oC trong 60 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giây. Lần kéo dài phản ứng cuối là 72oC trong 5 phút. Sau khi thực hiện PCR, chúng tôi thêm vào 13l dung dịch đệm (98% formamide, 10mm EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol. Mức độ đa hình của sản phẩm PCR được phát hiện nhờ ethidium bromide sau khi điện di trên 5% agarose gel. Microsatellite marker được ghi nhận sự có băng kháng và nhiễm theo số 1 (chống chịu mặn) và 2 (nhiễm). Thiết lập bản đồ: nhờ phần mềm MAPMARKER version 3.0 III.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU IV.1. Xây dựng các tổ hợp lai và quần thể con lai Vật liệu bao gồm các giống lúa địa phương cổ truyền, giống lúa cải tiến trong chương trình lai, với giống đối chứng kháng quốc tế là PTB33 giống chuẩn nhiễm là TN1. Sử dụng quần thể F2 của tổ hợp lai IR64 / HOALAI. Thu hoạch hai hạt trên mỗi bông của mỗi cá thể F2 để theo dõi sự phân ly ở F3. Quần thể F2 của tổ hợp lai IR54742/IR31917, PTB33 / TN1 được phân tích kiểu gen với chỉ thị STS và quần thể ì F2 của IR 64 / Hoa Lài được phân tích với microsatellite marker. Rầy nâu dung chỉ thị STS Quần thể F2 của tổ hợp lai ì PTB33 / TN1 được phân tích kiểu gen với chỉ thị STS Bản đồ liên kết gen RFLP đã đánh dấu gen Bph-10 với chỉ thị RG457 trên nhiễm sắc thể 12 (Ishi và 1994). Sau đó, một loạt các cặp primer đã được thiết kế để sử dụng PCR trong việc tìm kiếm gen kháng ở quần thể con lai (Lang và ctv.1999). Giống PTB33 có nguồn gốc từ ấn Độ, kháng rầy nâu biotype 2 và 3. Giống TN1 nhiễm rất nặng đối với tất cả biotype của rầy nâu được biết.(hình 1) Kết qủa đánh giá kiểu hình cóí 12 / 50 cây kháng, 11/50 cây nhiễm và 27/50 cây kháng trung bình, theo tỉ lệ phân ly Mendel ở F2 là 1:2:1 Hình 1 Đánh giá kiểu hình trên hộp mạ rầy nâu, bố, mẹ và con lai F2 Kết quả phân tích kiểu gen nhờ chỉ thị STS thể hiện ở hình 2 Hình 2: Kết qủa PCR với primer RG457L-L được thiết kế từ RG 457 nhằm phát hiện gen Bph-10 A: tổ hợp IR54742/IR31917 và quần thể F2 , với primer RG457L-L , đường 1: giống nhiễm IR31917 với 2 băng, đường 2: giống kháng IR54742 với 3 băng, đường 3 đến 21: con lai F2, đường 8 và 17, con lai dị hợp tử, đường 10: con lai đồng hợp tử kháng B: tổ hợp PTB33/TN1 và quần thể F2 , với primer RG457B-L, đường 1 giống nhiễm TN1 với 2 băng, đường 2: giống kháng PTB33 với 2 băng, đường 3 đến 22: con lai F2, đường 9-16: con lai dị hợp tử, đường 17 đến 21: con lai đồng hợp tử mang gen kháng rầy nâu Dự đoán mức độ chính xác trong phân tích genom được trình bày trong bảng 3. Số cây kháng rầy nâu đồng hợp tử trội có gía trị ước đoán là 72,27%, cây dị hợp tử là 85,70%, và cây nhiễm đồng hợp tử lặn là 85,70%, với tổ hợp PTB33 / TN1. Trong khi đó, quần thể con lai F2 của IR54742 / IR31917 cho mức độ chính xác cây kháng 100%, cây nhiễm 100% và cây dị hợp tử 95% (Lang và ctv.1999). Điều nầy cho phép giải thích đối với quần thể rầy nâu phân lập có 3 biotype. Có giống nhiễm với botype 1 nhưng lại kháng với biotype 2 hoặc ngược lại Bảng 2: Gíá trị ước đoán chính xác thông qua so sánh giữa kiểu gen và kiểu hình, quần thể F2 của PTB33 / TN1 Ly trích ADN của hệ gen PTB33,TN1, IR65482-4-136-2-4, ASD7, OM1570, Oryza autraliensis, để đánh giá dạng đa hình trên quần thể rầy nâu với chỉ thị RG457L-L. Tuy nhiên, kết qủa điện di đầu tiên cho thấy các kiểu gen kháng và nhiễm có khoảng cách quá gần không nhìn rõ. Chúng tôi dùng enzyme HinfI để phân cắt sản phẩm PCR này, kết qủa sau cùng cho thể đa hình rất đẹp ( Hình 3) Hình 3:Genomic của các giống 1:PTB33,2:TN1, 3:IR65482-4-136-2-4,4: ASD7,5: ọM 1570, 6:O. autraliensis .Sản phẩm PCR được dùng chỉ thị RG457B-L ,chạy trên điện di với nồng độ agarose 1,2% A: Sản phẩm PCR chạy trên điện di , trước khi phân cắt B: Sau khi phân cắt với HinfI Áp dụng chỉ thị STS này, con lai F2 cũng được tiến hành tiến hành điện di, sau khi đánh giá kiểu hình trên hộp mạ rầy nâu. Hình 3 cho thấy con lai có kiểu gen đồng hợp tử kháng, dị hợp tử, và đồng hợp tử nhiễm. Hình 4: Phân tích kiểu gen của con lai ở F2 A: PCR của tổ hợp IR54742 / IR31917 và quần thể F2 , với primer RG457L-L Phân cắt với HinfI. Lane 1 : IR31917(nhiễm) ; Lane 2:IR54742 (kháng). Lane 3-21 con lai F2. Lane 8: dị hợp tử. Lane 10: đồng hợp tử kháng B: PCR của tổ hợp PTB33 / TN1 và quần thể F2 , với primer RG457B-L Phân cắt với HinfI. Lane 1 : TN1 (nhiễm); Lane 2:PTB33 (kháng). Lane 3-21 con lai F2. Lane 3-8: đồng hợp tử nhiễm, Lane 9-16: dị hợp tử, Lane 17-21: đồng hợp tử kháng Lang và ctv. (1999) đã sử dụng STS để phân tích sự du nhập gen lháng rầy nâu từ loài hoang dại Oryza australiensis vào giống lúa trồng Oryza sativa L. (IR31917-45-3-2). Hai dòng IR65482-4-136 và IR65482- 17-511 là kết qủa của cặp lai giữa lúa hoang với lúa trồng theo cách này được ghi nhận kháng với rầy nâu biotype 2 và 3. Đa hình được ghi nhận trong cặp primer RG457FL/RL, với kiểu gen kháng có kích thước 300, 250, 200 bp, và kiểu gen nhiễm là 500, 200 bp. Trong cặp primer RG457FL/BL, kiểu gen kháng có kích thước 500, 300 bp, và kiểu gen nhiễm là 550, 200 bp. Chỉ thị này có giá trị liên kết với gen kháng Bph-10 là 1,7 cM. Xây dựng bản đồ liên kết gen kháng rầy nâu với microsatellite marker trên quần thể IR 64 / Hoa Lài (hình 2 với 229 cá thể con lai F2, cho thấy: chỉ có 118 / 300 primer đựoc ghi nhận thể hiện đa hình, phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng là 1.298,007 cM. Gen kháng rầy nâu của vật liệu cho (giống Hoa Lài) được tìm thấy trên nhiễm sắc thể số 12, giá trị liên kết rất chặt là 0,2 cM với chỉ thị RM227 và 5,0 cM với chỉ thị RM260. Điều này cũng cho thấy nó định vị rất gần với chỉ thị RG457, xét theo bản đồ RFLP (hình 5) Hình 5 : Bản đồ di truyền gen kháng rầy nâu của IR 64/ Hoa Lài trên nhiễm sắc thể số 12 Bảng 3 cho thấy giá trị ước đoán mức độ chính xác trong sử dụng phương pháp MAS để tìm gen kháng rầy nâu trong quần thể IR64/Hoa Lài. Giá trị này có thể tin tưởng được so với tổ hợp PTB33/TN1 Bảng 3. Gíá trị ước đoán chính xác thông qua so sánh giữa kiểu gen và kiểu hình, quần thể F2 của IR64 / Hoa Lài IV. KếT LUậN Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) là một chiến lược có thể áp dụng ở Việt Nam với hiệu qủa chọn lọc tốt, thông qua kỹ thuật :fine mapping" với chỉ thị STS và microsatellite, đối với rầy nâu. Quần thể RIL và f2 có thể được khuyến cáo dùng trong sự phát triển các dòng chỉ thị với chỉ thị tương ứng. ở đây, chúng tôi tập trung các quần thể: IR 64/Hoa Lài, PTB33 /TN1, Gen kháng rầy nâu Bph-10 được phát hiện nhờ phương pháp sử dụng STS trên locus RG457 ở nhiễm thể số 12, trên cơ sở vật liệu của tổ hợp PTB33/TN1, và sử dụng microsatellite RM227 trên cơ sở của tổ hợp IR64/Hoa Lài. Hai chỉ thị RG457B-L và RG457L-L có thể được khuyến cáo để chọn lọc dòng lai kháng rầy nâu (biotype 2 và 3) Summary GENOTYPING BROWN PLANT HOPPER BY DNA MARKERS Marker-assissted selection is recommended as a key strategy in terms of detection target genes which control brown plant hopper, based on sequence tagged sites (STS) and microsatellite markers. Fine mapping is requested to have closer linkage between target genes and markers. Based on the sequence data of STS, gene Bph-10 in the population of PTB 33 / TN1 Gene Bph-10 was also detected based on microsatellite marker RM227 in the population of IR64 / Hoa Lài. TÀI LIỆU THAM KHẢO Causse MA, Fulton TM, Cho Y G, Ahn SN, Chunwongse J, Wu K, Xiao J, Yu Z, Ronald PC, Harring ton SE, Second G, McCouch SR, Tanksley S. . 1994. Saturated molecular map of rice genome based on an interspecific backcross population. Genetics 138(4): 1251-1271. Ishii T, Brar D S, multani D,S Khush GS. 1994. molecular tagging of gene for brown planthopper resistance and earliness introgressed from O.ryza australiensis into cultivaed rice. O. .sativa. Genomie 7:217-221 Kurata, N., G. Moore, Y.Nagamura, T. Foote, M.Yano,Y.Minobe and M.Gale. 1994. A high degree of consevation of genome structure between rice and wheat Bio/Technology 12:276-278 Mc Couch ,S.R,. G. Kochert , Z.H. Yu,Z. Wang, G.S. Khush, W,R. Coffam and S.D Tanksley .1988. Molecular mapping of rice chromosomes .Theor. Apple.Genet. 76:815-829 McCouch, S.R., and M.L Abenes , R. Angleges, G.S Khush and S.D Tanksley .1991. Molecualr tagging of a recessive gene xa-5 for resistance to bacterial blight of rice. Rice Genet. Newsl .8:143-145 Mc Couch , S.R . and Stansley. 1991. Development and use restricion fragment length polymorphism in rice breeding and genetics p. 109-133. G.S khush and G.H. toenniessen. CAB international. Wallingford UK, and International Rice Research Institute, Manila Philippine McCouch et r. doerge. 1996. QTL mapping in rice . Trends in Genet. 11: 482-487 McCouch SR, SD Tanskley. 1991. Development and use of restriction fragment length polymorphism in rice breeing and genetics. P. 109-133. in: Rice biotechnology. Nematzadeh G.A.1995. Mapping gene for grain quality in rice ( Oryza sativa L) using RAPD and RFLP markers. UPLB, PH.Dthesis , 99pp Nguyễn thị Lang. 1994. Nghiên cứu ưu thế lai của một số tính trạng sinh lý và năng suất cây lúa . Luận án tiến sĩ . Viện KHKT Nông Nghiệp Việt Nam, Hà Nội Nguyen T Lang, Seiji Yanagihara, BC Buu. 2001. A microsatellite arker for a gene conferring salt tolerance on rice at vegetative and reproductive stages. SABRAO: 1-10 Nguyen thi Lang, DS Brar, Gurdev S Khush, Ning Huang and Bui chi Buu. 1999. Development of STS markers to indentify brown plant hopper resistance in a segregating population. Omonrice (7) 26-34. Nguyễn Thị Lang 2002. Phương pháp cơ bản trong công nghệ sinh học 200 trang . Nhà Xuất bản Nông nghiệp Singh ek., D.S. multani, and G.S. Khush. 1996 Secondary trismics and telotrisomics of rice: Origin, characterization and use in determining the orirentation of chromosome map. Genetics 143;517-529 Tanksley ,S.D.N, Ahn, M.causse T. coffman, T. Fulton, S.R. Mc.Couch, G. second, T. Tai,Z,.Wang, K.Wu and Z.Yu 1991. RFLP mapping of rice genome .pp. 435-442. In Rice Genetics II Prco, of the second international Rice genetic Symposium. May 1990. IRRI . Philippine. 1991 Tanksley SD, and J Hewitt.1988. Use of molecular markers in breeding for soluble solids content in tomato a re- examination. Theor. Appl. Genet. 75:811-823. Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương