Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm Alfacef 1g

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 2013  116 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHẾ PHẨM ALFACEF 1G  Bùi Tùng Hiệp*, Nguyễn Hoàng Thu Trang**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Ceftazidime là một cephalosporin thế hệ 3, kháng sinh diệt khuẩn và có tác động chống lại nhiều  vi khuẩn Gram dương và Gam âm, đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa. Thị trường dược phẩm tại Việt nam  hiện có hơn 60 chế phẩm chứa hoạt chất trên, bao gồm những biệt dược và thuốc gốc của nhiều quốc gia trên thế  giới. Đề tài nhằm nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn in‐vitro của thuốc gốc Alfacef 1g (Pymepharco,  Việt nam).  Phương pháp: xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng trên các vi khuẩn chuẩn Gram dương và  Gram  âm  thông  dụng  của  thuốc  gốc Alfacef  1g  (Pymepharco, Việt nam),  so  sánh  với  biệt  dược Fortum  1g  (GlaxoSmithKline, Úc).   Kết quả: các nồng độ tối thiểu ức chế tăng trưởng của thuốc gốc Alfacef 1g trên 10 loại vi khuẩn chuẩn  thông dụng, bao gồm 3 vi khuẩn Gram âm và 7 vi khuẩn Gram dương: Klebsiella pneumoniae CF 104, Bacillus  subtilis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC 9341, Enterococcus faecalis ATCC 51299, E. coli ATCC 25922,  Pseudomonas  aeruginosa ATCC  27853, Staphylococcus  aureus ATCC  25923, Staphylococcus  aureus ATCC  29213, Enterococcus  faecalis ATCC 29212 và Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696; cho thấy hoàn toàn  không khác biệt với thuốc biệt dược Fortum. Điều này giúp giảm chi phí điều trị và  lệ thuộc vào thuốc ngoại  nhập, hưởng ứng chủ trương: “Người Việt Nam dùng hàng Việt Nam”.  Kết luận: Hoạt tính kháng khuẩn của 2 kháng sinh thử nghiệm trên các vi khuẩn chuẩn thông dụng hoàn  toàn tương đương.    Từ khoá: Nồng độ tối thiểu ức chế, phương pháp pha loãng trong môi trường thạch  ABSTRACT  THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF GENERIC DRUG ALFACEF 1G  Bui Tung Hiep, Nguyen Hoang Thu Trang  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 116 ‐ 120  Objectives: Ceftazidime is a third‐generation cephalosporin antibiotic. Ceftazidime is bactericidal in action,  exerting  its effect by  inhibition of enzymes responsible  for cell‐wall synthesis. It  is active against many Gram‐ positive  and Gram‐negative  bacteria,  especially Pseudomonas  aeruginosa. Pharmaceutical maket  in Viet nam  show more than 60 drugs contain this active ingredient, including various brand names and generic names of  many countries in the world. The aim of this study to investigate the in‐vitro antimicrobial activity of generic  drug Alfacef 1g (Pymepharco, Viet nam).   Material and method:  determining  the minimum  inhibitory concentrations on common Gram‐positive  and Gram‐negative standard bacteria, compared with a brand name (Fortum 1g, GlaxoSmithKline, Australia).   Results: The minimum inhibitory concentrations of Alfacef 1g on 10 common standard bacteria, including  three Gram‐negative bacteria and seven Gram‐positive bacteria: Klebsiella pneumoniae CF 104, Bacillus subtilis  ATCC  6633, Micrococcus  luteus  ATCC  9341,  Enterococcus  faecalis  ATCC  51299,  E.  coli  ATCC  25922,  Pseudomonas  aeruginosa ATCC  27853, Staphylococcus  aureus ATCC  25923, Staphylococcus  aureus ATCC  29213,  Enterococcus  faecalis  ATCC  29212,  and  Corynebacterium  diphtheriae  ATCC  51696;  have  been  * Bệnh viện Cấp cứu Trưng Vương  ** Đại học Y Dược Tp.HCM  Tác giả liên lạc: PGS.TS. Bùi Tùng Hiệp  ĐT: 0914187054   Email: buitunghiep@yahoo.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 2013  117 demonstrated  the equivalence of antimicrobial activity, compared with  those of brand name Fortum. That can  save  the  substantial  cost  of  patients’s  treatment  and  the  dependence  on  foreign  drugs,  according  to  the  govermental policy: “Vietnamese people use vietnamese products”.  Conclusion:  The  antibacterial  activity  of  two  antibiotics  on  bacteria  testing  formal  standards  fully  equivalent.   Key words: Minimum inhibitory concentration, agar dilution method  ĐẶT VẤN ĐỀ  Ceftazidime  là một  cephalosporin  thế hệ  3,  kháng sinh diệt khuẩn, đề kháng với hầu hết các  enzym bêta‐lactamase phổ hẹp và  có  tác  động  chống  lại  nhiều  vi  khuẩn  gram  âm  và  gram  dương.  Do  có  phổ  kháng  khuẩn  rộng,  ceftazidime có thể được dùng đơn độc như một  thuốc đầu tay, trong khi chờ đợi kết quả của các  thử nghiệm  tính nhạy cảm. ceftazidime có  tính  diệt  khuẩn,  tác  động  gây  sự  ức  chế  tổng  hợp  vách tế bào vi khuẩn. Bên cạnh những biệt dược  của những hãng dược phẩm nổi  tiếng  trên  thế  giới  như  Fortum  (GlaxoSmithKline‐  Úc)  hoặc  Tazidime  (Eli  Lilly‐  Mỹ)  thì  thị  trường  dược  phẩm tại nước ta cũng có hiện diện đến hơn 60  thuốc gốc  chứa hoạt  chất  trên với  sự  tham gia  của  rất  nhiều  hãng  của  những  quốc  gia  khác  nhau, thuốc do Việt nam sản xuất rất ít. Có thể  kể  đến  Cefitin  (Lyka‐Ấn  độ),  Ceftazidime  Sodium  Inj  (Austin  Pharma‐  Hong  Kong),  Bitazid (Sanavita‐Đức), Lacdi ceftazidime (Hebei  Zhangjiakou  Pharm  Co.,  Ltd  –  Trung  Quốc),  Ceftazidime  Injection  (Aurobindo  Pharma‐  Ấn  độ),  Bectozid  (Cadila Healthcare  Ltd‐  Ấn  độ),  Ceftazidime‐1000  (Flamingo  Pharmaceuticals  Ltd‐  Ấn  độ),  Orzid  (Orchid  Chemicals  &  Pharmaceutical Ltd‐ Ấn độ), Betazidim  (Strides  Arcolab‐  Ấn  độ),  Biocetum  (Bioton‐  Ba  Lan),  Cefdim  (Korea  United  Pharm‐  Hàn  Quốc),  Bicefzidim  (Bidiphar‐  Việt  nam)  và  Alfacef  (Pymepharco‐ Việt nam) v...v...Thử nghiệm hoạt  tính kháng khuẩn in‐vitro hoặc xác định hoạt lực  thuốc trên vi sinh vật cần phải nghiên cứu trước  hết  để  sàng  lọc, kiểm  tra, kiểm nghiệm những  kháng  sinh  mới  hoặc  thuốc  kháng  sinh  do  những nhà sản xuất khác nhau, thể hiện thật sự  khả  năng  kháng  khuẩn,  điều mà  các  phương  pháp  Lý‐Hoá  không  xác  định  được(2,4,6).  Đề  tài  nhằm  chứng minh hoạt  tính kháng khuẩn  của  chế phẩm Alfacef chứa 1g hoạt chất ceftazidime  qua  việc  xác  định  nồng  độ  tối  thiểu  ức  chế  (Minimum  Inhibitory  Concentration‐MIC)  trên  các  vi  khuẩn  chuẩn  thông  dụng,  so  sánh  với  thuốc biệt dược Fortum (GlaxoSmithKline‐ Úc).  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP  Vi khuẩn thử nghiệm   Tổng  cộng  10  vi  khuẩn  chuẩn  được  thử  nghiệm, bao gồm 3 vi khuẩn chuẩn Gram âm và  7  vi  khuẩn  Gram  dương:  Klebsiella  pneumoniae  CF 104, Bacillus subtilis ATCC 6633, Micrococcus  luteus  ATCC  9341,  Enterococcus  faecalis  ATCC  51299,  E.  coli  ATCC  25922,  Pseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853,  Staphylococcus  aureus  ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 29213,  Enterococcus  faecalis  ATCC  29212  và  Corynebacterium  diphtheriae  ATCC  51696  được  cung  cấp  tại  Bộ  môn  Vi  sinh‐Ký  sinh‐  Khoa  Dược‐ Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh.  Chế  phẩm  Alfacef  1g  (Pymepharco  ‐  Việt  nam),  lô 14810, hạn sử dụng đến 06/08/2013 và  biệt dược Fortum 1g (GlaxoSmithKline  ‐ Úc),  lô  0017, hạn  sử dụng  đến 31/08/2013  được  chúng  tôi sử dụng trong nghiên cứu.  Phương pháp xác định MIC  Áp dụng phương pháp pha loãng trong môi  trường  thạch  theo quy  trình chuẩn của NCCLS  2006  (National  Committee  for  Clinical  Laboratory Standard)(5).   Cân chính xác lượng kháng sinh ceftazidime  (Alfacef hoặc Fortum), hòa tan trong đệm pH 7  vô  trùng  (hoà  tan  42,59g  Na2HPO4  khan  với  27,22g KH2PO4 trong 1 lít nước) để pha giai mẫu  kháng sinh có nồng độ giảm đi ½, có nồng độ  cuối  từ  1024  –  0,125  μg/ml  trong  25  ml  môi  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 2013  118 trường thạch Mueller‐Hinton. Trộn đều, tạo bản  thạch bằng cách đổ ra hộp Petri đường kính 90  mm, để đặc lại trên mặt phẳng ngang để có bản  thạch độ dày là 4 mm.   Các vi khuẩn thử nghiệm được cấy phân lập  trên môi  trường Tryptic soy agar,  ấp ở 37oC  từ  18‐24 giờ. Chọn 3‐5 khóm vi khuẩn thuần khiết  để  tạo  thành  huyền  dịch  vi  khuẩn  trong môi  trường lỏng Mueller‐Hinton hay nước muối sinh  lý   vô  trùng  để  có  độ  đục  tương  đương  McFarland  0.5  (~108  colony  forming  unit  (CFU)/ml). Cũng  có  thể  nuôi  cấy  lắc  vi  khuẩn  trong môi trường Mueller‐Hinton lỏng trong nồi  cách  thủy  từ 3‐5 giờ ở 37oC, sau đó điều chỉnh  tạo lượng huyền dịch vi khuẩn tương đương độ  đục McFarland 0.5. Thực hiện đếm sống để đảm  bảo lượng vi khuẩn chuẩn ban đầu như sau: E.  coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae, B. subtilis và M.  luteus từ 3.1‐ 5.5 x 108 CFU/ml; enterococci, 3.5‐  6.0 x 108 CFU/ml; C. diphtheriae, staphylococci từ  4‐  5.5  x  108  CFU/ml.  Pha  loãng  vi  khuẩn  thử  nghiệm  1/10  bằng  môi  trường  lỏng  Mueller‐ Hinton hay nước muối sinh lý  vô trùng và chấm  lên bản thạch (đã có kháng sinh) từ 1‐2 μl (~104  CFU trên vết chấm)(3).  Đọc kết qủa sau khi ấp ở 37oC từ 18‐24 giờ,  quan sát bất cứ hiện diện của sự phát  triển vi  khuẩn trên vết chấm. Xác định nồng độ MIC là  nồng độ kháng sinh  đầu  tiên  thấp nhất mà  ở  đó vi khuẩn bị ức chế hoàn toàn quan sát được  bằng mắt thường. Thử nghiệm được thực hiện  lặp  lại  ít nhất  3  lần  cho mỗi  chủng  vi  khuẩn  khi xác định MIC. Giá trị MIC của các chủng vi  khuẩn chuẩn được so sánh  từng cặp giữa chế  phẩm thử và chế phẩm đối chiếu, được xem là  không khác biệt khi các giá trị này không khác  biệt quá 4 lần(1,3,4).  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Bằng cách quan sát bất cứ hiện diện của sự  phát  triển  vi  khuẩn  trên  vết  chấm  bằng  mắt  thường,  theo  quy  trình  chuẩn  của  NCCLS,  chúng tôi đã xác định được nồng độ kháng sinh  đầu tiên thấp nhất mà ở đó vi khuẩn bị ức chế  hoàn toàn, đó chính là giá trị của MIC (Hình 1)   Hình 1. Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng  trong  thạch  F  và  A:  Bản  thạch  chứa  Fortum  và  Alfacef  cùng  nồng  độ.  Ô  1:  chấm  vi  khuẩn  Klebsiella pneumoniae CF 104. Ô 5: chấm vi khuẩn  Bacillus  subtilis  ATCC  6633.  Ô  6:  chấm  Micrococcus  luteus  ATCC  9341.  Ô  9:  chấm  Enterococcus faecalis ATCC 51299. Ô 11: chấm E.  coli  ATCC  25922.  Ô  12:  chấm  Pseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853.  Ô  13:  chấm  Staphylococcus  aureus ATCC  25923. Ô  14:  chấm  Staphylococcus  aureus ATCC  29213. Ô  15:  chấm  Enterococcus  faecalis  ATCC  29212.  Ô  16:  chấm  Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696.  Nhìn  chung,  kết  qủa MIC  trên  cả  2  kháng  sinh thử nghiệm phù hợp với thông tin của nhà  sản xuất biệt dược. Có một số thay đổi về giá trị  MIC nhưng không có ý nghiã khác biệt(1,3,4). Hoạt  chất ceftazidime cho thấy tác động rất tốt trên vi  khuẩn Gram âm  (E.coli, Klebsiella pneumoniae và  Pseudomonas aeruginosa); MIC của những chủng  này từ 0.25‐ 1 μg/ml. Ngược lại, giá trị MIC của  ceftazidime  trên  các  vi  khuẩn  Gram  dương  (Bacillus  subtilis  ATCC  6633, Micrococcus  luteus  ATCC  9341,  Enterococcus  faecalis  ATCC  51299,  Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus  aureus ATCC  29213,  Enterococcus  faecalis ATCC  29212  và  Corynebacterium  diphtheriae  ATCC  51696)  cao hơn, MIC  của những  chủng này  từ  0.25 cho đến 1024 μg/ml.   F A Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 2013  119 Bảng 1. MIC của vi khuẩn thử nghiệm với Alfacef  Thuốc gốc Alfacef Mã số Vi khuẩn thử nghiệm MIC (µg/ml) 1 Klebsiella pneumoniae CF 104 0.25 5 Bacillus subtilis ATCC 6633 8 6 Micrococcus luteus ATCC 9341 2 9 Enterococcus faecalis ATCC 51299 1024 11 E. coli ATCC 25922 0.5 12 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1 13 Staphylococcus aureus ATCC 25923 16 14 Staphylococcus aureus ATCC 29213 16 15 Enterococcus faecalis ATCC 29212 1024 16 Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696 16 Bên cạnh đó, so sánh tác động kháng khuẩn  của thuốc Alfacef 1g và Fortum 1g đều cho thấy  kết qủa hoàn  toàn  tương  đồng. Trên vi khuẩn  Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus  aureus  ATCC  29213  và  Corynebacterium  diphtheriae ATCC 51696 cho thấy giá trị MIC của  hai  kháng  sinh  thử  nghiệm  hoàn  toàn  bằng  nhau, tất cả là 16 μg/ml. Enterococcus faecalis mặc  dù không nằm trong các vi khuẩn nhạy cảm với  ceftazidime  cũng  được  nhiều  tác  giả  thử  nghiệm(3).  Trong  khảo  sát  của  chúng  tôi, MIC  của  Enterococcus  faecalis ATCC  51299  và ATCC  29212 đều rất cao, nhưng mặt khác không có sự  khác biệt giữa 2 kháng sinh thử nghiệm, cả hai  kháng sinh đều cho MIC cao tới 1024 μg/ml. Đối  với Bacillus subtilis ATCC 6633, trên Alfacef cho  MIC  là 8 μg/ml,  thấp hơn  so với 16 μg/ml của  Fortum.  Với  vi  khuẩn  E.coli ATCC  25922,  thử  nghiệm  với  Alfacef  cho  MIC  cao  hơn  so  với  Fortum  (0.25  μg/ml  so  với  0.5  μg/ml). Với  tác  nhân  thường  gây  viêm  phổi  là  Klebsiella  pneumoniae và đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa,  Alfacef có giá trị MIC thấp hơn một ít hoặc hoàn  toàn tương đương với Fortum (Bảng 1 và Bảng  2). Có thể sơ bộ kết luận, hoạt tính kháng khuẩn  của 2 kháng sinh thử nghiệm trên các vi khuẩn  chuẩn thông dụng hoàn toàn tương đương. Tuy  vậy, cần  thử nghiệm  thêm các chủng vi khuẩn  lâm  sàng  và/hoặc  đa  đề  kháng  kháng  sinh  thì  mới  có  kết  qủa  đầy  đủ  và  hoàn  chỉnh  khi  so  sánh hoạt tính kháng khuẩn.   Bảng 2. MIC của vi khuẩn thử nghiệm với Fortum  Biệt dược Fortum Mã số Vi khuẩn thử nghiệm MIC (µg/ml) 1 Klebsiella pneumoniae CF 104 0.5 5 Bacillus subtilis ATCC 6633 16 6 Micrococcus luteus ATCC 9341 0.5 9 Enterococcus faecalis ATCC 51299 1024 11 E. coli ATCC 25922 0.25 12 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1 13 Staphylococcus aureus ATCC 25923 16 14 Staphylococcus aureus ATCC 29213 16 15 Enterococcus faecalis ATCC 29212 1024 16 Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696 16 KẾT LUẬN  Hoạt tính kháng khuẩn của 2 kháng sinh thử  nghiệm trên các vi khuẩn chuẩn  thông dụng  là  hoàn  toàn  tương  đương.  Tuy  vậy,  cần  thử  nghiệm  thêm  các  chủng  vi  khuẩn  lâm  sàng  và/hoặc đa đề kháng kháng sinh thì mới có kết  qủa đầy đủ và hoàn chỉnh khi so sánh hoạt tính  kháng khuẩn.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Chow AW, Bartlett KH (1981). Comparative  in‐vitro activity  of  ceftazidime  (GR  20263)  and  other  β‐lactamase  stable  cephalosporins  against Pseudomonas, effect  of  inoculum  size  and divalent  cation  supplementation. Journal of Antimicrobial  Chemotherapy 1981; 8: 345‐348.  2. Bộ Y tế (2002) Dược điển Việt nam 3  Phụ lục 10.   3. Goldstein EJC, Citron DM, et al (1985). Comparative  in vitro  inhibitory and killing activity of Cefpirome, Ceftazidime, and  Cefotaxime  against  Pseudomonas  aeruginosa,  enterococci,  Staphylococcus  epidermidis,  and  methicillin‐susceptible  and  ‐ resistant  and  tolerant  and nontolerant  Staphylococcus aureus.  Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1985; pp. 160‐162.  4. Fritsche TR, Sader HS, Jones RN (2003). Comparative activity  and  spectrum  of  broad‐spectrum  beta‐lactams  (cefepime,  ceftazidime,  ceftriaxone,  piperacillin/  tazobactam)  tested  against 12,295 staphylococci and streptococci: report from the  SENTRY antimicrobial surveillance program (North America:  2001‐2002). Diagn Microbiol Infect Dis. 2003; 47(2): 435‐40.  5. National Committee for Clinical Laboratory Standards (2006).  Performance  standards  for  antimicrobial  disk  susceptibility  tests; approved standard, 9th ed. 2006. Wayne, PA: NCCLS;  document M100‐ S16.  6. Yutaka  U,  Katsunori  K,  et  al  (2005).  In  vitro  and  in  vivo  antibacterial activities of SM‐216601, a new broad‐spectrum  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 2013  120 parenteral carbapenem. Antimicrobial Agents and Chemotherapy  2005; 49(10): 4185–4196.  Ngày nhận bài       20/08/2013.  Ngày phản biện nhận xét bài báo 29/08/2013.  Ngày bài báo được đăng:   10/10/2013