Thử nghiệm môi trường nuôi cấy vi khuẩn mutans streptococci và lactobacilli

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 210 THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN MUTANS STREPTOCOCCI VÀ LACTOBACILLI Cao Hữu Tiến*, Nguyễn Thị Thu Hiền*, Vũ Thị Lan Hương* TÓM TẮT Mục đích: Phân lập được chủng thuộc nhóm mutans streptococci và lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt lấy từ bệnh nhân sâu răng và xác định môi trường đặc trưng và chọn lọc cho các nhóm vi khuẩn này. Phương pháp nghiên cứu: Mẫu nước bọt từ bệnh nhân có sâu răng được thu thập, sau đó phân lập vi khuẩn và làm thuần. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa được khảo sát để định danh vi khuẩn, sau đó nuôi cấy thử nghiệm lên một số môi trường khác nhau. Kết quả: Phân lâp được hai chủng L1 và L2 thuộc lactobacilli và hai chủng S1 và S3 thuộc nhóm mutans streptococci. Mật độ tế bào lactobacilli trên môi trường Lactobacilli MRS Broth (1,1x109 N/ml) và môi trường Rogosa SL Broth (0,85x109 N/ml) là tương đương nhau. Mật độ khuẩn lạc trên môi trường Mitis Salivarius Bacitracin Agar nhiều hơn mật độ khuẩn lạc trên môi trường Mitis Salivarius Agar. Kết luận: Môi trường thích hợp cho lactobacilli là Rogosa SL và Lactobacilli MRS, nhưng môi trường Rogosa SL chọn lọc cho lactobacilli miệng hơn vì thành phần muối trong Rogosa SL vượt mức cho phép phân lập các lactobacilli từ sữa. Môi trường chọn lọc cho mutans streptococci là Mitis Salivarius Bacitracin Agar. Từ khóa: sâu răng, lactobacilli, mutans streptococci ABSTRACT BACTERIAL CUTURE MEDIA FOR MUTANS STREPTOCOCCI AND LACTOBACILLI Cao Huu Tien, Nguyen Thi Thu Hien, Vu Thi Lan Huong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 - 2012: 210 - 219 Objectives: To isolate strains of mutans streptococci and lactobacilli from saliva samples of patients suffering from tooth decay and determine the selective media for those group of bacteria. Methods: Bacteria are isolated from salivary samples collecting from tooth decay patients. Morphological, physiological and biochemical characteristics are observed to identify bacteria, and then inoculated to test onto variety of culture media. Results: Two strains of lactobacilli (L1, L2) and two strains of group of mutans streptococci (S1, S3) have isolated. Lactobacilli cell density on Lactobacilli MRS Broth (1,1x109 N/ml) and Rogosa SL Broth (0,85x109 N/ml) is equivalent. The density of colonies on Mitis Salivarius Bacitracin Agar is more than the density of colonies on Mitis Salivarius Agar. Conclusions: Culture media for lactobacilli are Rogosa SL and Lactobacilli MRS, however, Rogosa SL is more selective for oral lactobacilli because high salt content in Rogosa SL is not suitable for isolating lactobacilli from milk. Selective media for mutans streptococci is Mitis Salivarius Bacitracin Agar. Key words: caries, lactobacilli, mutans streptococci * Bộ môn Sức khỏe răng miệng – Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: BS. Cao Hữu Tiến, ĐT: 0909464212 Email: caohuutien@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 211 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâu răng là bệnh khởi phát một thời gian dài trước khi nhìn thấy trên lâm sàng, vì thế việc đánh giá sâu răng ở giai đoạn sớm khi sang thương chưa nhìn thấy được là rất quan trọng. Xác định được nguy cơ sâu răng của bệnh nhân sẽ giúp đảm bảo mức dự phòng và điều trị thích hợp. Một trong những phương pháp đánh giá nguy cơ sâu răng thường được sử dụng đó là đếm số lượng mutans streptococci và lactobacilli trong nước bọt. Tuy nhiên, hiện nay để làm xét nghiệm này phải dựa vào những bộ kit làm sẵn của các hãng nước ngoài với chi phí rất cao gây khó khăn cho việc ứng dụng, đặc biệt là trong nghiên cứu khoa học. Chính vì thế để có môi trường nuôi cấy chọn lọc tự làm của hai nhóm vi khuẩn này phục vụ cho các nghiên cứu nha khoa và trong ứng dụng lâm sàng là điều cần thiết. Mục tiêu của đề tài này là phân lập được chủng thuộc nhóm mutans streptococci và lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt lấy từ bệnh nhân bị sâu răng, sau đó tham khảo, tìm hiểu những môi trường mà các chủng này có khả năng hiện diện và xác định môi trường đặc trưng và chọn lọc cho chủng vi khuẩn khảo sát. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Dụng cụ Bình ủ kỵ khí Pipetman 1000, 100 Pipet 1.0ml, 10.0ml Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, kính hiển vi, kính lúp, Hóa chất Một số hóa chất cần thiết cho môi trường nuôi cấy. Anaerocult® A (của hãng MERCK KGaA) chứa các thành phần hóa học mà có thể kết hợp với oxy nhanh chóng và hoàn toàn, tạo ra một môi trường không có O2 (kỵ khí) và một bầu không khí CO2 dùng để nuôi kỵ khí. Dung dịch hydrogen peroxide 30% trong chai màu nâu, tránh ánh sáng Phẩm nhuộm Gram Môi trường Mitis Salivarius Agar (MSA) (MT1) Mitis Salivarius Bacitracin Agar (MSB) (MT2): môi trường MSA có bổ sung 20% saccharose và 0.2 units/ml Bacitracin Mitis Salivarius Bacitracin Broth (MT3) Rogosa SL Agar (MT4) Rogosa SL Agar có bổ sung 0,5% CaCO3 (MT4’) Rogosa SL Broth (MT5) Môi trường tổng hợp Lactobacilli MRS Agar (MT6) Môi trường Lactobacilli MRS Broth (MT7) Môi trường Luria-Bertani (LB) (MT8) Môi trường Phenol Red Mannitol Broth (MT9) Môi trường Blood Agar (Thạch máu) (MT10) Phương pháp thực hiện * Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm: Thu mẫu từ bệnh nhân Phân lập vi khuẩn và làm thuần Giữ giống Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Chọn chủng để thử nghiệm nuôi cấy Kết luận Mẫu nước bọt Mẫu nước bọt được lấy từ những bệnh nhân có sâu răng Cách lấy mẫu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 212 Trong vòng 90 phút trước khi thu thập nước bọt, yêu cầu nhóm đối tượng cho nước bọt không được ăn cũng như uống bất cứ thứ gì, không được nhai kẹo cao su, không đánh răng và sử dụng nước súc miệng. Thời gian lấy nước bọt vào khoảng 8 giờ 30 đến 11 giờ sáng. Các bước thực hiện: Cho đối tượng ngồi thẳng trong tư thế thoải mái, đầu nghiêng nhẹ về phía trước Ngay trước khi thu mẫu nước bọt, yêu cầu đối tượng nuốt lần cuối tất cả lượng nước bọt có trong miệng. Kích thích sự tiết nước bọt bằng cách cho nhai 1 mẫu paraffin Nước bọt được thu thập trong một ống nghiệm tiệt trùng Thời gian thu thập là 5 phút Mẫu được bảo quản trong tủ đông đá Mẫu nước bọt được pha loãng theo dãy thập phân. Phương pháp nuôi kỵ khí Xếp đĩa Petri hoặc ống nghiệm vào bình kỵ khí Lấy 35ml nước đổ lên tấm Anaerocult® A cho chảy đều, sau đó nhanh chóng bỏ vào bình kỵ khí và đậy nắp lại ngay lập tức. Chú ý không quá 15-20 giây. Anaerocult ® A có tác dụng sau 4 giờ khi màu sắc của tấm Anaerocult ® A chuyển từ màu trắng sang màu xanh dương. Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn từ mẫu nước bọt Đối với lactobacilli Pha loãng mẫu bằng nước muối 0,9% vô trùng. Dùng pipetman hút 0,1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 vào đĩa Petri có chứa môi trường MT4’, tiến hành trải bằng que gạt. Mỗi độ pha loãng trải 2 đĩa liên tiếp nhau. Ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều khiện kỵ khí (5- 10%CO2), ta thu nhận được những đĩa có khuẩn lạc mọc riêng lẻ. Quan sát và chọn những khuẩn lạc vi khuẩn rời rạc khác nhau, có vòng phân giải CaCO3 xung quanh khuẩn lạc mọc trên môi trường MT4’. Sau đó tiếp tục cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường MT4 nhiều lần cho đến khi thu được những khuẩn lạc đồng nhất về hình thái. Giữ giống trong môi trường MT10. Đối với mutans streptococci Tương tự như lactobacilli, tiến hành trải trên môi trường MT2, ủ 37±10C, 48 giờ, trong điều kiện kỵ khí (5-10%CO2). Thu nhận những đĩa có khuẩn lạc mọc riêng lẻ. Tương tự lactobacilli, cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường MT2. Giữ giống trong môi trường MT10. Phương pháp khảo sát đặc điểm của tế bào vi khuẩn đã phân lập Khảo sát khả năng di động Đối với lactobacilli, các chủng nuôi cấy lỏng trên môi trường MT5, ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều khiện kỵ khí; với mutans streptococci, các chủng nuôi cấy trên MT3, ủ 37±10C, 48 giờ, trong điều kiện kỵ khí. Dùng que cấy khử trùng lấy vi khuẩn hoặc dùng pipetman hút 1 ít huyền phù tế bào vi khuẩn được nuôi cấy 2-3 ngày, để vào giữa một miếng lame sạch, đặt miếng lamelle lên sao cho không tạo bọt khí. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x10, sau đó chuyển sang quan sát ở vật kính x40. Nhuộm Gram(1) Nhuộm bằng tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút Nhuộm Lugol trong 1 phút Rửa bằng nước Tẩy bằng alcol bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho alcol chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt alcol vừa mất màu tím Rửa bằng nước Nhuộm bổ sung Safranin hoặc Fuchsin từ 10 – 30 giây Rửa nước Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 213 Để mẫu khô tự nhiên và xem dưới kính hiển vi (x100) Thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm catalase(7) Tiến hành: Đối với lactobacilli, các chủng nuôi cấy lỏng trên môi trường MT4, ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều khiện kỵ khí. Đối với mutans streptococci, các chủng nuôi cấy trên MT2, ủ 37±10C, 48 giờ, trong điều kiện kỵ khí. Thử nghiệm trên phiến kính: dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên miếng lame sạch. Dùng pipet nhựa hút H2O2 30% rồi nhỏ một giọt lên sinh khối vi sinh vật trên lame. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Chủng dùng làm đối chứng là E.coli. Đọc kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 được tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sủi bọt khí. Thử nghiệm khả năng lên men đường Mannitol Tiến hành: Cấy chủng vào ống môi trường MT9 trong ống nghiệm đã chuẩn bị bằng que cấy vòng từ các chủng đã làm thuần trên môi trường chon lọc. Sau khi cấy, ủ 35±10C trong 72 giờ, 5-10% CO2 đối với lactobacilli và 37±10C trong 48 giờ, 5-10%CO2 đối với mutans streptococci. Đọc kết quả: Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid. Sinh acid là (+) khi môi trường với chất chỉ thị phenol đỏ chuyển thành màu vàng, ngược lại nếu môi trường có mà đỏ thì sự sinh acid (-). Phương pháp dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD550nm - Chủng đại diện cho lactobacilli đem nuôi cấy lỏng trên môi trường MT8, ủ 35±10C trong 72 giờ, 5-10% CO2 - Pha loãng huyền phù tế bào lactobacilli sao cho thu được các huyền phù có OD550nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 rồi ghi nhận các số đo thực tế. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. - Hút 0,1ml dịch vi khuẩn ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa Petri có chứa môi trường MT6 và tiến hành cấy trải. Ủ ở 35±10C, 72 giờ trong điều kiện kỵ khí (5-10% CO2). Sau đó đếm số khuẩn lạc trên đĩa Petri ở mỗi độ pha loãng để xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này, ghi nhận kết quả. - Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi giá trị OD550nm. * Cách tính: Số khuẩn lạc (N) được xác định bằng cách đếm (25 ≤ N ≤ 300). Mật độ tế bào (N/ml) là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1ml mẫu iivfnvfn N mlN   ... )/( 11 Với N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa Petri đã cấy ở độ pha loãng thứ i v: Thể tích dịch mẫu sử dụng để cấy trải vào trong mỗi đĩa (0,1ml) fi: Độ pha loãng tương ứng Tính log(N/ml) - Vẽ đường biểu diễn của log(N/ml) (trục tung) theo OD550nm (trục hoành) theo chương trình vẽ biểu đồ của Microsoft Excel 2003. Phương pháp so sánh mật độ tế bào giữa các môi trường Đối với lactobacilli Nuôi cấy lỏng lactobacilli trên hai môi trường MT5 và MT7. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng lactobacilli cấy sang ống nghiệm có chứa khoảng 15ml môi trường MT5 và MT7, ủ 35±10C, 72 giờ trong điều kiện kỵ khí (5-10%CO2). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 214 Sau đó tiến hành pha loãng dịch mẫu sao cho OD550nm có giá trị nằm trong khoảng 0,1-0,5. Ghi nhận giá trị OD550nm và hệ số pha loãng. Từ giá trị OD550nm thu được, thay vào phương tình đường thẳng được suy ra từ đồ thị. Ta được giá trị Log(N/ml). Từ Log(N/ml), ta tính N/ml Mật độ tế bào có trong 1ml = N/ml x hệ số pha loãng Đối với mutans streptococci Sử dụng đĩa Petri có ngăn phần, mỗi phần chứa một môi trường để so sánh mật độ. Nuôi cấy chủng mutans streptococci đã phân lập được trên hai môi trường MT1 và MT2. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng S1 cấy một đường thẳng lên hai môi trường trên cùng đĩa Petri có ngăn phần. Ủ 37±10C, 48 giờ trong điều kiện kỵ khí (5- 10%CO2). Sau đó quan sát sự hiện diện của khuẩn lạc trên hai môi trường. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập sơ bộ vi khuẩn từ mẫu nước bọt Phân lập lactobacilli Theo nghiên cứu của một số tác giả như Johannes Van Houte và cs (1972)(9); P.W.Caufield và cs (2007)(4), lactobacilli được phân lập từ nước bọt, mảng bám răng và trên bề mặt biểu mô miệng bởi môi trường thạch Rogosa SL. Rogosa SL là môi trường cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho lactobacilli, ngoài ra muối sodium acetate, ammonium citrate ức chế sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật, bao gồm Streptococcus. Việc bổ sung acid acetic giúp sự phát triển của lactobacilli tốt hơn và ức chế các vi khuẩn khác. Lactobacilli là trực khuẩn có khả năng sinh acid lactic nên có khả năng làm tan CaCO3. Từ những lý do trên, để phát hiện và khẳng định tốt hơn, chúng tôi phân lập lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt của bệnh nhân sâu răng trên môi trường thạch Rogosa SL có bổ sung 0,5% CaCO3. Kết quả phân lập được hai chủng có vòng phân giải CaCO3, kí hiệu L1, L2. Cả hai chủng đều có khuẩn lạc tròn, ướt. Tuy nhiên khuẩn lạc L1 lồi, có màu trắng sữa; khuẩn lạc L2 có màu trắng đục và nhô hình nón (bảng 3.1). Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc của chủng L1, L2 Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc L1 Khuẩn lạc tròn, lồi, màu trắng sữa, ướt và nhầy L2 Khuẩn lạc tròn, ở giữa nhô lên hình nón, màu trắng đục, ướt Hình 1: Khuẩn lạc chủng L1 và L2 Phân lập mutans streptococci Tương tự, chúng tôi phân lập mutans streptococci trên môi trường chọn lọc cho mutans streptococci là Mitis Salivarius Bacitracin Agar. Môi trường này có Crystal violet và Trypan blue ức chế hầu hết các trực khuẩn Gram âm và hầu hết các vi khuẩn Gram dương trừ Streptococcus, cung cấp nguồn đường (sucrose) dồi dào cho quá trình chuyển hóa, đặc biệt Bacitracin là kháng sinh cho phép chọn lọc mutans streptococci. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 215 Trên môi trường này đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn từ mẫu nước bọt, kí hiệu S1,S2, S3. Đặc điểm của 3 chủng S1, S2, S3 được mô tả ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Đặc điểm khuẩn lạc của chủng S1, S2 và S3 Chủng vi Đặc điểm khuẩn lạc khuẩn S1 Khuẩn lạc nhỏ, tròn lồi, cứng, ăn sâu vào thạch, có một lớp bóng sáng trên bề mặt của các khuẩn lạc. S2 Khuẩn lạc lớn, màu xanh nhạt, mờ đục S3 Khuẩn lạc nhỏ, cứng, tròn lồi Hình 2: Khuẩn lạc chủng S1, S2 và S3 Khảo sát đặc điểm của tế bào vi khuẩn đã phân lập Đối với lactobacilli Sau khi nuôi cấy lỏng hai chủng L1 và L2 trên môi trường MT5 ở 35±10C, 72 giờ trong điều kiện kỵ khí. Tiến hành khảo sát khả năng di động và đặc tính Gram của hai chủng L1 và L2. Nhận thấy, chủng L1 là vi khuẩn hình que, dạng chuỗi, Gram dương và có khả năng di động; chủng L2 là vi khuẩn hình que, dạng chuỗi, Gram dương và không di động (bảng 3.3). Bảng 3.3: Các đặc điểm tế bào của chủng L1 và L2 Chủng vi khuẩn Hình dạng tế bào Khả năng di động Gram L1 Hình que, dạng chuỗi + + L2 Hình que, dạng đơn - + Hình 3: Nhuộm Gram chủng L1 và L2 Đặc điểm của hai chủng L1 và L2 giống với đặc điểm của lactobacili theo lý thuyết là những trực khuẩn hình que và Gram dương. Đối với mutans streptococci Tương tự lactobacilli, sau khi nuối cấy ở 37±10C, 48 giờ trong điều kiện kỵ khí. Tiến hành khảo sát khả năng di động và đặc tính Gram của ba chủng S1, S2 và S3. Kết quả thu được cả ba Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 216 chủng đều có tế bào hình cầu, Gram dương, không di động (bảng 4). Bảng 4: Các đặc điểm tế bào của chủng S1, S2 và S3 Chủng vi khuẩn Hình dạng tế bào Khả năng di động Gram S1 Hình cầu, dạng chuỗi - + S2 Hình cầu, dạng đôi - + S3 Hình cầu, dạng chuỗi - + Hình 3.4: Nhuộm Gram chủng S1, S2 và S3 Từ kết quả khảo sát đặc điểm tế bào của các chủng S1, S2và S3, nhận thấy đặc điểm của ba chủng này phù hợp với đặc điểm của mutans streptococci theo lý thuyết là những vi khuẩn hình cầu dạng đơn, đôi hay chuỗi, Gram dương và không di động. Thử nghiệm nghiệm sinh hóa Thử nghiệm catalase Cả 2 chủng L1, L2 đều cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính. Chủng S2 cho kết quả thử nghiệm catalase dương tính. Hai chủng S1 và S3 cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính. Từ thử nghiệm Catalase cho kết quả chủng S2 dương tính. So với những đặc điểm của nhóm mutans streptococci là catalase âm tính, như vậy S2 không thuộc nhóm mutans streptococci. E.coli L1 E.coli L2 Hình 5: Thử nghiệm catalase của chủng L1 và L2 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 217 E.coli S1 E.coli S2 E.coli S3 Hình 6: Thử nghiệm catalase chủng S1, S2 và S3 Thử nghiệm khả năng lên men đường Mannitol Khả năng lên men của các chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid. Sinh acid là (+) khi môi trường với chất chỉ thị phenol đỏ chuyển thành màu vàng, ngược lại nếu môi trường có màu đỏ thì sự sinh acid (-). Cả bốn chủng L1, L2, S1, S3 đều có khả năng lên men đường mannitol sinh acid làm chất chỉ thị phenol đỏ chuyển màu vàng. Điều này chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh acid từ sự lên men đường. Từ những đặc điểm tế bào khảo sát được, kết quả của các thử nghiệm sinh hóa cùng với đặc điểm của lactobacilli và mutans streptococci theo lý thuyết, kết quả thu được: - Chủng L1 và L2 thuộc lactobacilli - Chủng S1 và S3 thuộc nhóm mutans streptococci Chọn chủng L1 đại diện cho lactobacilli và chủng S1 đại diện cho mutans streptococci để thử nghiệm nuôi cấy trên các môi trường. Thử nghiệm nuôi cấy trên các môi trường khác nhau Đối với chủng thuộc lactobacilli Chúng tôi nuôi cấy lỏng chủng L1 trên môi trường Lactobacilli MRS Broth, để dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD550nm. Kết quả đo mật độ quang của các ống nghiệm để dựng đồ thị ở bảng 3.5. Bảng 5: Kết quả đo OD550nm để dựng đường tương quan Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 OD550nm 1,275 1,381 1,469 1,587 1,693 1,778 OD 0 0,106 0,194 0,312 0,418 0,503 Ống nghiệm 1: Môi trường (MT7) Ống nghiệm 2,3,4,5,6: Dịch khuẩn pha loãng Bảng 6: Số liệu giữa OD550nm và Log(N/ml) OD Độ pha loãng Số khuẩn lạc N/ml log(N/ml) Đĩa 1 Đĩa 2 0,106 10 -4 26 29 2,8x10 6 6,45 0,194 10-4 113 127 1,2x107 7,08 0,312 10-4 285 >300 2,9x10 7 7,46 10 -5 28 32 0,418 10-5 162 176 1,7x108 8,23 0,503 10-6 70 67 6,9x108 8,84 Từ số liệu bảng 3.6, dùng chương trình vẽ đồ thị của phần mềm Microsoft Excel, dựng đồ