Tính đa hình thái đơn RS2294008 gen PSCA và nguy cơ với ung thư dạ dày

TCNCYH 115 (6) - 2018 25 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN RS2294008 GEN PSCA VÀ NGUY CƠ VỚI UNG THƯ DẠ DÀY Trần Văn Chức, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Đặng Thị Ngọc Dung, Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội Gen PSCA (Prostate sterm cell antigen) mã hóa cho một protein bề mặt tế bào thuộc họ protein Thy-1/Ly -6, có vai trò trong sự bám dính và tăng sinh của tế bào. Đa hình đơn nucleotid (Single Nucleotide Polymor- phism - SNP) tại vị trí rs2294008 trên gen PSCA với sự biến đổi nucleotid C > T làm thay đổi acid amin Met > Thr đã được công bố làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định nguy cơ gây ung thư dạ dày của đa hình đơn nucleotid rs2294008 gen PSCA. 130 bệnh nhân ung thư dạ dày và 130 người nhóm chứng được lựa chọn vào nghiên cứu. Kết quả cho thấy kiểu gen rs2294008 TT làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày 2,81 lần so với kiểu gen CC (95% CI = 1,02 - 7,74) và làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày 2,69 lần (95% CI = 1,01 - 7,18) so với kiểu gen CC + CT. Kết luận có sự tương quan giữa đa hình đơn nucleotid rs2294008 của gen PSCA với nguy cơ ung thư dạ dày ở người dân miền Bắc Việt Nam. Từ khóa: Ung thư dạ dày, đa hình rs2294008, gen PSCA I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày là bệnh lý ác tính, đứng thứ năm trong các ung thư thường gặp và đứng thứ ba trong các nguyên nhân gây tử vong do ung thư [1]. Việt Nam nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao, với tỷ lệ mắc ung thư dạ dày chuẩn hóa theo tuổi ở nam là 23,7/100000 và ở nữ 10,2/100000. Cơ chế bệnh sinh ung thư dạ dày là một bức tranh phức tạp, có nhiều yếu tố nguy cơ liên quan như nhiễm Helicobacter pylori được cho là nguyên nhân chính gây ung thư dạ dày, được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào tác nhân gây ung thư dạ dày nhóm I, ngoài ra còn liên quan đến tình trạng sử dụng rượu, thuốc lá, chế độ ăn, yếu tố genM[2]. Mặc dù có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị ung thư dạ dày, nhiều yếu tố nguy cơ với ung thư dạ dày đã được nghiên cứu, tuy nhiên việc chẩn đoán ung thư dạ dày vẫn thường diễn ra ở giai đoạn muộn nên hiệu quả điều trị chưa cao. Vì vậy trong y học hiện đại việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh phân tử, tìm ra các yếu tố nguy cơ do nhân tố di truyền (các đột biến, đa hình đơn nucleotid) liên quan đến bệnh là rất cần thiết, giúp tìm ra hướng mới trong phòng bệnh, chẩn đoán sớm và điều trị bệnh. Gen PSCA nằm trên nhiễm sắc thể 8q24.3, mã hóa cho protein gồm 123 acid amin. PSCA là một protein màng tế bào, thuộc họ Thy-1/Ly -6. Các kết quả nghiên cứu cho thấy PSCA có liên quan đến nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư tiền liệt tuyến, bàng quang, túi mật, phổiM [3; 4]. Đối với ung thư dạ dày, PSCA được dự đoán có vai trò như gen ức chế sinh ung thư [5]. Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu mối liên quan giữa các đa hình đơn nucleotid của gen PSCA với nguy cơ ung thư dạ dày, trong đó tập trung vào đa hình đơn nucleotid rs2294008 được nghiên cứu nhiều và có ý nghĩa nhất [5]. Đa hình đơn nucleotid rs2294008 nằm trên exon 1 của gen PSCA, Địa chỉ liên hệ: Đặng Thị Ngọc Dung, Bộ môn Hóa Sinh, Trường Đại học Y Hà Nội. Email: ngoczung@hmu.edu.vn Ngày nhận: 24/9/2018 Ngày được chấp thuận: 22/10/2018 26 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC sự thay đổi nucleotid C > T làm biến đổi bộ ba ACG mã hóa cho acid amin threonin thành bộ ba mở đầu ATG mã hóa cho acid amin me- thionin, việc thay đổi nucleotid C > T làm giảm phiên mã gen PSCA ở tế bào ung thư dạ dày [6] [7]. Nhiều nghiên cứu trên quần thể người Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Châu ÂuM đã khẳng định sự thay đổi alen rs2294008 C > T là yếu tố nguy cơ gây ung thư dạ dày [5; 8 - 10]. Nghiên cứu chúng tôi được tiến hành nhằm xác định nguy cơ mắc ung thư dạ dày liên quan đa hình đơn nucleotid rs2294008 trên người Việt Nam. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Nhóm bệnh (n = 130): Gồm những bệnh nhân chẩn đoán xác định mắc ung thư dạ dày được theo dõi và điều trị tại các bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viện K. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân - Có triệu chứng ung thư dạ dày dựa trên lâm sàng, hình ảnh nội soi dạ dày. - Phải có bằng chứng kết luận ung thư dạ dày về mô bệnh học hoặc tế bào học. Tiêu chuẩn loại trừ - Có tiền sử ung thư cơ quan khác hoặc ung thư dạ dày di căn từ cơ quan khác. - Nhóm chứng (n = 130): Gồm những người khỏe mạnh khám sức khỏe tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, nội soi dạ dày chỉ có tổn thương viêm cấp, không tổn thương loét, không có tổn thương tiền ung thư. Nhóm chứng không có sự khác biệt về tuổi, giới so với nhóm bệnh. 2. Phương pháp - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu bệnh có đối chứng. - Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học Trường Đại học Y Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2016 đến tháng 9/2018. Phương pháp phân tích mẫu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu được lấy 2 ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông EDTA (1mg/ ml). - Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu thep phương pháp tách cột silica. - Xác định kiểu gen rs2294008 bằng phương pháp RFLP - PCR (Restriction Frag- ment Length Polymorphism - PCR) + Khuếch đại vùng gen chứa rs2294008 của gen PSCA bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu: F: 5’ - TAG GCT CTG TCC TCC AGA G - 3’. R: 5’ - TCT GTC TAC CTG CCC CCT AG - 3’. + Phân tích RFLP: Sản phẩm PCR được ủ với enzym cắt giới hạn NlaIII ở điều kiện 370C từ 8 đến 10 giờ. Sản phẩm sau khi cắt enzym được điện di trên gel agarose 1,5% cùng với thang chuẩn 100 bp ở 130V trong 30 phút. Các băng DNA được nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system. Khi enzym NlaIII cắt đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA, kiểu gen TT cho 2 băng kích thước 335 bp, 210 bp; kiểu gen CT cho 3 băng kích thước 545 bp, 335 bp, 210 bp; kiểu gen CC cho 1 băng kích thước 545 bp. - 5% số mẫu sản phẩm PCR khuếch đại được kiểm tra lại ngẫu nhiên bằng kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger trên máy giải trình tự tự động. TCNCYH 115 (6) - 2018 27 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm SPSS 16.0, tính toán tỷ suất chênh OR, 95% CI, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05. 3. Đạo đức trong nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. Nghiên cứu hoàn toàn vì mục đích khoa học. III. KẾT QUẢ 1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Bảng 1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Đặc điểm Nhóm bệnh Nhóm chứng p n % n % Giới Nam 83 63,8 72 55,4 0,164 Nữ 47 36,2 58 40,6 Tuổi trung bình 56,81 ± 11,33 56,03 ± 12,47 0,547 + Tuổi trung bình của nhóm bệnh là 56,81 ± 11,33 khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhóm chứng là 56,03 ± 12,47, p > 0,05. Tỷ lệ nam/nữ nhóm bệnh là 1,76/1. Tỷ lệ nam/nữ của 2 nhóm bệnh - chứng khác biệt không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05. 2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP rs2294008 Kết quả khuếch đại đoạn gen chứa rs2294008 của gen PSCA 545 bp Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen chứa rs2294008 M: Thang chuẩn 100 bp; B1 đến B10: Mẫu sản phẩm PCR bệnh nhân; (-): Chứng âm Mẫu chứng (-) không lên vạch. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tốt, hình ảnh điện di cho một băng rõ nét, không có sản phẩm phụ, kích thước tương đương 545 bp của đoạn gen cần khuếch đại, đủ tiêu chuẩn cho phản ứng cắt enzym. 28 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen mang rs2294008 bằng enzym NlaIII M: Thang chuẩn 100 bp; B1 đến B10: Mẫu cắt sản phẩm PCR bệnh nhân; (+): Chứng dương Mẫu chứng dương gồm 2 băng kích thước 335 bp, 210 bp mang kiểu gen TT chứng tỏ phản ứng xảy ra hoàn toàn. Mẫu B1, 2, 3, 4, 6, 8 gồm 1 băng kích thước tương đương 545 bp: Kiểu gen CC. Mẫu B5 gồm 2 băng kích thước tương đương 335 bp, 210 bp: Kiểu gen TT. Mẫu B7, 9, 10 gồm 3 băng kích thước tương đương 545 bp, 335 bp, 210 bp: Kiểu gen CT (Hình 2). Kết quả giải trình tự kiểm tra Kết quả cắt enzym giới hạn được kiểm tra lại bằng kĩ thuật giải trình tự gen Kết quả giải trình tự DNA của bệnh nhân cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả cắt enzym giới hạn (hình 3). Hình 3. Hình ảnh giải trình tự sản phẩm PCR chứa rs2294008 của gen PSCA tương ứng kiểu gen CC, CT, TT 3. Mối tương quan giữa tính đa hình rs2294008 của gen PSCA ở bệnh nhân ung thư dạ dày và người bình thường Bảng 2. Tần số kiểu gen SNP rs2294008 và tỷ số nguy cơ mắc ung thư dạ dày Đa hình thái Nhóm bệnh Nhóm chứng Tỷ số nguy cơ (0R) (95%CI) n % n % Kiểu gen CC 56 43,08 63 48,46 1,00 CT 59 45,38 61 46,92 1,09 (0,66 - 1,81) TT 15 11,54 6 4,62 2,81 (1,02 - 7,74) So sánh TT với CC + CT CC + CT 115 88,46 124 95,8 1,00 TT 15 11,54 6 4,62 2,69 (1,01 - 7,18) TCNCYH 115 (6) - 2018 29 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả phân tích kiểu gen rs2294008 theo hai nhóm ung thư dạ dày và không ung thư dạ dày được sử dụng tỷ suất chênh hay tỷ số nguy cơ (OR) để xác định nguy cơ mắc bệnh của kiểu gen TT so với kiểu gen CC và CC + CT. Kết quả cho thấy kiểu gen TT của rs2294008 làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày 2,81 lần so với kiểu gen CC, 95% CI 1,02 – 7,74, tăng nguy cơ ung thư dạ dày 2,69 lần so với kiểu gen CC + CT, 95% CI 1,01 - 7,18. Chưa tìm thấy mối liên quan giữa alen T so với C trong nguy cơ ung thư dạ dày (95 % CI chứa 1). IV. BÀN LUẬN Trong nghiên cứu của chúng tôi, kiểu gen TT làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày hơn so với kiểu gen CC và CC + CT lần lượt 2,81 lần (95% CI 1,02 - 7,74) và 2,69 lần (95% CI 1,01 - 7,18). Kết quả này của chúng tôi tương tự như nghiên cứu của tác giả Song [8] nghiên cứu trên quần thể người Hàn Quốc với 3245 bệnh và 1245 chứng kiểu gen TT tăng nguy cơ so với kiểu gen CC 1,71 lần (95% CI 1,43 - 2,04), nghiên cứu của Matsuo trên người Nhật Bản [11] TT làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày so với CC + CT 1,37 lần (95% CI 1,11 – 1,68), nghiên cứu trên quần thể người Châu Âu kiểu gen TT cũng làm tăng nguy cơ so với kiểu gen CC 2,02 lần (95% CI 1,49 - 2,76) [10], nghiên cứu của tác giả Li-Xin Qiu [9] tiến hành phân tích gộp dựa trên 19 nghiên cứu trước về SNP rs2294008 với ung thư dạ dày cũng có kết quả kiểu gen TT tăng nguy cơ ung thư dạ dày hơn so với kiểu gen CC 1,75 lần (95% CI 1,5 - 2,04). Kết quả chúng tôi khác so với kết quả nghiên cứu Li-xin Qiu trên người Trung Quốc [9] kiểu gen TT không làm tăng nguy cơ ung thư dạ dày so với kiểu gen CC (OR = 0,83, 95% CI 0,63 - 1,1). Chúng tôi cũng tiến hành tính tỷ suất chênh để xác định nguy cơ với ung thư dạ dày của kiểu gen CT so với CC, kiểu gen TT + CT so với CC, của alen T so với alen C tuy nhiên không tìm ra mối liên quan trong nguy cơ gây bệnh ung thư dạ dày. Kết quả này khác so với nghiên cứu đã được công bố trên quần thể khác nhau (bảng 4). Bảng 4. Nguy cơ gây ung thư dạ dày của kiểu gen CT, TT + CT so với CC, alen T so với C SNP rs2294008 trên một số quần thể Quần thể OR (95% CI) CT với CC TT + CT với CC T với C Nhật Bản [11] 2,07 (1,45 – 2,95) Hàn Quốc [8] 1,5 (1,28 – 1,76) 1,29 (1,18 – 1,41) Đa hình thái Nhóm bệnh Nhóm chứng Tỷ số nguy cơ (0R) (95%CI) n % n % So sánh TT + CT với CC CC 56 43,08 63 48,46 1,00 TT + CT 74 56,92 67 51,53 1,24 (0,76 – 2,03) Kiểu alen C 171 65,77 187 71,92 1,00 T 89 34,23 73 28,08 1,04 (0,72 – 1,49) 30 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Quần thể OR (95% CI) CT với CC TT + CT với CC T với C Trung Quốc [9] 1,58 (1,32 - 1,88) 1,37 (1,16 - 1,61) Trung Quốc [7] 1.16 (0.97 - 1.39) 1.14 (0.96 - 1.36) Châu Âu [10] 1.46 (1.12 - 1.91) Protein PSCA bình thường biểu hiện ở nhiều cơ quan trong đó có tuyến tiền liệt, bàng quang, da, gan, đặc biệt biểu hiện cao tại dạ dày [4]. Tuy nhiên protein PSCA giảm biểu hiện ở tế bào ung thư dạ dày rất nhiều lần so với tế bào biểu mô dạ dày bình thường, trong khi PSCA theo nghiên cứu của Sakamoto (2008) có tác dụng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày [5]. Sự biến đổi alen rs2294008 C > T đã được chứng minh làm giảm hoạt động phiên mã gen PSCA ở tế bào ung thư dạ dày theo nghiên cứu của tác giả Sakei (2015) [6], chính từ nghiên cứu này chúng tôi cho rằng người mang kiểu gen đồng hợp TT rs2294008 có nguy cơ ung thư dạ dày cao hơn so với kiểu gen CC, CT, phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Giải thích sự khác biệt trong nghiên cứu của chúng tôi so với các nghiên cứu khác và sự khác biệt giữa các kết quả nghiên cứu trên các quần thể khác nhau về mối liên quan giữa kiểu gen CT hoặc TT + CT so với kiểu gen CC trong nguy cơ ung thư dạ dày chúng tôi cho rằng có thể do nguyên nhân dịch tễ khác nhau giữa các quần thể hoặc do cỡ mẫu của chúng tôi trong nghiên cứu này chưa đủ lớn. V. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu ghi nhận kiểu gen đồng hợp TT đa hình đơn nucleotid rs2294008 làm tăng nguy cơ mắc ung thư dạ dày so với kiểu gen CC 2,81 lần (95% CI 1,02 – 7,74) và 2,69 lần (95% CI 1,01 – 7,18) so với kiểu gen CC + CT. Lời cám ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-YS.02- 2015.37. Nhóm nghiên cứu xin chân thành cám ơn Bộ môn Hóa Sinh, Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Torre L.A., Bray F., Siegel R.L et al (2015). Global cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians, 65(2), 87 - 108. 2. Ang T.L. và Fock K.M (2014). Clinical epidemiology of gastric cancer. Singapore medical journal, 55 (12), 621. 3. Suh Y.S., Joung J.Y., Kim S.H et al (2018). Prostate stem cell antigen mRNA in blood is a predictor of survival after radical prostatectomy in patients with high-risk pros- tate cancer. Oncotarget, 9(41), 26291. 4. Zhang W., Liang P., Wang W et al (2015). The influence of PSCA gene variation on its expression and gastric adenocarcinoma susceptibility in the northwest Chinese popula- tion. International journal of molecular sci- ences, 16(5), 11648 - 11658. 5. Sakamoto H., Yoshimura K., Saeki N et al (2008). Genetic variation in PSCA is as- TCNCYH 115 (6) - 2018 31 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC sociated with susceptibility to diffuse-type gas- tric cancer. Nature genetics, 40(6), 730. 6. Saeki N., Ono H., Yanagihara K et al (2015). rs2294008T, a risk allele for gastric and gallbladder cancers, suppresses the PSCA promoter by recruiting the transcription factor YY 1. Genes to Cells, 20(5), 382 - 391. 7. Lu Y., Chen J., Ding Y et al (2010). Ge- netic variation of PSCA gene is associated with the risk of both diffuse‐and intestinal‐type gastric cancer in a Chinese population. Inter- national journal of cancer, 127(9), 2183 - 2189. 8. Song H.R., Kim H.N., Piao J.M et al (2011). Association of a common genetic vari- ant in prostate stem‐cell antigen with gastric cancer susceptibility in a Korean population. Molecular carcinogenesis, 50(11), 871 - 875. 9. Qiu L.-X., Cheng L., He J et al (2016). PSCA polymorphisms and gastric cancer sus- ceptibility in an eastern Chinese population. Oncotarget, 7(8), 9420. 10. Sala N., Muñoz X., Travier N et al (2012). Prostate stem‐cell antigen gene is as- sociated with diffuse and intestinal gastric can- cer in Caucasians: results from the EPIC‐ EURGAST study. International journal of can- cer, 130 (10), 2417 - 2427. 11. Matsuo K., Tajima K., Suzuki T. , et al (2009). Association of prostate stem cell anti- gen gene polymorphisms with the risk of stom- ach cancer in Japanese. International journal of cancer, 125(8), 1961 - 1964. Summary RS2294008 POLYMOPHISM AND RISK OF GASTRIC CANCER IN VIETNAMESE POPULATION The prostate stem cell antigen (PSCA) gene, which encodes a cell surface protein belonging to the Thy-1/LY-6 family, was identifed as a gene involved in cell adhesion and proliferation. Single nucleotide polymorphism (SNP) located in rs2294008 PSCA gene with changes of nucleo- tide C > T causing alteration of the amino acid Met > Thr has been shown to be associated with gastric cancer. This study was conducted to identify the correlation of the polymorphism rs2294008 of PSCA gene in gastric cancer patients. 130 patients diagnosed with gastric cancer and 130 controls were selected. Results showed that the rs2294008 TT genotype is associated with increasing gastric cancer risk (OR = 2.81; 95%CI = 1.02 - 7.74) when compared with CC genotypes and TT genotype is asociated with increasing gastric cancer risk (OR = 2.69; 95%CI 1.01 - 7.18) when compared with CC + CT genotypes. In conclusion, we observed the correlation between polymorphism rs2294008 of PSCA gene with gastric cancer risk in Vietnam. Keywords: Gastric cancer, polymorphism rs2294008, PSCA gene