Tình hình nhiễm vi khuẩn listeria monocytogenes trên rau xà lách ở Nha Trang

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 36  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG TÌNH HÌNH NHIỄM VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES TRÊN RAU XÀ LÁCH Ở NHA TRANG INCIDENCE OF LISTERIA MONOCYTOGENES ON SALAD GREENS IN NHA TRANG ThS. Nguyễn Thị Thanh Hải1, CN. Nguyễn Thị Thảo My2, TS. Nguyễn Minh Trí3 TÓM TẮT Tần suất nhiễm Listeria monocytogenes trên các mẫu rau xà lách thu thập ở một số khu vực nhà vườn Nha Trang được khảo sát bằng phương pháp MPN. Tỷ lệ các mẫu rau nhiễm L. monocytogenes là 72,2 %, mức độ nhiễm là 31,64 MPN/gam rau. Tưới rau bằng nước giếng hoặc nước ngầm, mật độ nhiễm L. monocytogenes thấp hơn so với khi tưới bằng nước ao hồ (p<0,05). Cách rửa rau thông thường (rửa dưới vòi nước chảy, rửa và ngâm nước muối 0,85%, rửa và ngâm dung dịch thuốc tím 10 ppm) làm giảm mật độ L. monocytogenes nhiễm (p<0,05). Trong đó phương pháp rửa và ngâm bằng thuốc tím 10 ppm đạt hiệu quả giảm tỷ lệ nhiễm xuống còn 25% tổng số mẫu kiểm tra. Tuy vậy, vẫn còn số lượng L. monocytogenes nhất định trong mẫu nhất là mẫu có mật độ vi khuẩn này ban đầu cao. Kết hợp giữa tưới rau bằng nước giếng (hoặc nước ngầm) và cách rửa rau có ngâm thuốc tím 10 ppm, chỉ còn 1/12 mẫu (8,3%) nhiễm ở mức phát hiện trên 25 g mẫu. Sự kết hợp này cho thấy làm giảm tối đa nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cho người tiêu dùng. Từ khoá: Listeria monocytogenes, rau xà lách, rửa rau ABSTRACT Survey incidence of Listeria monocytogenes on salad greens samples collected in several gardens in Nha Trang was done with the MPN method. Rate of samples contaminated with L. monocytogenes was 72.2%, average of contamination density was 31.64 MPN/g. The contamination density of L. monocytogenes on the vegetables irrigated with well water or groundwater was lower than that on vegetables irrigated from ponds signifi cantly (p<0.05). The way to wash vegetables generally (washing under running water; washing and soaking in salt solution of 0.85%, washing and soaking in 10 ppm solution of potassium permanganate) to reduce signifi cantly the contamination density of L. monocytogenes (p<0.05). The way of washing and soaking with 10 ppm potassium permanganate effectively reduce the prevalence to 25% of samples. But the contamination density of L. monocytogenes in high density samples given is still high. Combine vegetables irrigated with well water (or groundwater) and washing and soaking in 10 ppm potassium permanganate, only 1/12 samples (18.3%) detected at the sample of 25g. This combination will minimize the risk of L. monocytogenes contamination to the consumers. Key words: Listeria monocytogenes, salad greens, washing vegetables 1, 3 Khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang 2 Cựu SV khoá 49 Ngành Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang hiếm gặp nhưng nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong cao (20-30%) so với các tác nhân gây bệnh lây qua thực phẩm khác, như vi khuẩn Salmonella [4]. L. monocytogenes thường ảnh hưởng đến những người có sức đề kháng yếu như ở người suy giảm miễn dịch, HIV/ AIDS, bệnh mãn tính như xơ gan; phụ nữ mang thai, trẻ chưa sinh hoặc vừa mới sinh; và người già [4]. Đây là tác nhân gây ra một số lớn các vụ dịch THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Listeria monocytogenes là một trực khuẩn Gram dương, chịu lạnh, gây nhiễm ở người và động vật [13]. Vi khuẩn xâm nhập vào vật chủ chủ yếu qua ruột khi ăn phải thức ăn bị nhiễm mầm bệnh này [15]. L. monocytogenes là một tác nhân gây bệnh nội bào cơ hội đã trở thành một nguyên nhân quan trọng của nhiễm trùng lây qua thực phẩm ở người trên toàn thế giới [11]. Đây là bệnh tương đối Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  37 bệnh truyền qua thực phẩm ở Bắc Mỹ và Châu Âu. Trung gian truyền bệnh trong các trường hợp này là các loại rau, các sản phẩm sữa, hoặc hải sản [13]. Vì vậy, đã có mối quan tâm lớn về tỷ lệ vi khuẩn này trong việc cung cấp thực phẩm. Đã có nhiều đề tài nghiên cứu tần suất nhiễm của L. monocytogenes trong sản phẩm tươi sống [9], hải sản [7], các loại thịt [2,3,5], sữa [6,12], và nhà máy sản xuất [8]. Nhiều nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của L. monocytogenes trên nhiều loại rau sống hoặc ít qua chế biến. Do vậy, nếu người tiêu dùng sử dụng rau này chắc chắn họ sẽ bị nhiễm L. monocytogenes, dù nhiễm vi khuẩn này trên rau với số lượng thấp [10]. Ở Việt nam, nghiên cứu về tình hình nhiễm L. monocytogenes trên rau chưa được đề cập. Với người Việt Nam, xà lách thật sự quen thuộc, hầu như luôn có mặt trong các bữa ăn hàng ngày. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát tần suất nhiễm L. monocytogenes trên rau xà lách trồng tại Nha Trang nhằm cung cấp số liệu về vệ sinh an toàn thực phẩm, cũng như đánh giá ảnh hưởng của cách rửa rau đến lượng vi khuẩn này trên rau. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu 1.1. Rau xà lách - Vị trí lấy mẫu: 18 mẫu xà lách lấy tại các vườn rau thuộc khu vực phía Bắc thành phố Nha Trang (vườn rau Vĩnh Hải + Phú Sương), phía Nam thành phố Nha Trang (vườn rau Phước Hải + Đồng nai) và khu vực huyện Diên Khánh (vườn rau Diên Phú1 + Diên Phú2) (Hình 1) - Xử lý mẫu: Xà lách (5 ¸ 7 cây) sau khi lấy tại vườn rau, cắt bỏ gốc đựng trong túi lấy mẫu, được đưa ngay về phòng thí nghiệm, tiến hành tách từng lá và trộn đều, chia đều 4 phần. Chú ý tránh gây tạp nhiễm trong quá trình xử lý. Các phần rau được xử lý như sau: • Đối chứng: Không xử lý. • Cách rửa 1: Rửa kỹ dưới vòi nước chảy, tránh làm trầy, dập lá. • Cách rửa 2: Rửa trong thau nước, ngâm trong nước muối 0,85% trong 10 phút. • Cách rửa 3: Rửa trong thau nước, ngâm trong thuốc tím 10 ppm trong 10 phút. 1.2. Hóa chất, môi trường Nước muối sinh lý, BLEB (Buffered Listeria Enrichment Broth Base), OXA (Môi trường Oxford), Môi trường di động SIM, TSAye (Trypticase soy agar with 0,6% yeast extract), TABye (Trypticase soy broth with 0,6% yeast extract), canh thang cơ bản lên men carbohydrate (chứa 0,5% dextrose, manitol, rhamnose, xylose, maltose), tác nhân chọn lọc, thuốc nhuộm Gram, môi trường thạch máu cơ bản. Các hóa chất, môi trường sử dụng trong thí nghiệm là của hãng Merck. 2. Phương pháp phân tích 2.1. Định lượng Listeria monocytogenes Mẫu (25 g) đã được cắt nhỏ và đồng nhất trong 225ml môi trường làm giàu BLEB. Pha loãng bậc 10 với nước muối sinh lý. Chọn 3 nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ cấy vào 5 ống nghiệm chứa môi trường làm giàu BLEB, mỗi ống BLEB được cấy 1 ml mẫu ở nồng độ pha Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 38  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG loãng đã chọn và nuôi cấy ở 300C trong 48 giờ. Xác nhận ống nghiệm (+) với L. monocytogenes: Phân lập L. monocytogenes từ các ống nghiệm trên vào môi trường chọn lọc chứa esculin (Oxford Listeria Selective Agar), chọn khuẩn lạc điển hình (Hình 2) kiểm tra tính chất định danh: di động, khả năng sử dụng đường (Manitol -, Rhamnose+, Xylose -) và có hoạt tính tan máu [1] Thử nghiệm hoạt tính tan huyết: Hoạt tính tan huyết của các chủng khác nhau được xác định bằng thạch máu. Hồng cầu cừu rửa (3%) đã được đưa vào môi trường thạch tương TSA, bổ sung 0,6% chất chiết nấm men. Các chủng đã được cấy chấm trên thạch máu và ủ ở 37 °C qua đêm. Kết quả ghi nhận có hoạt tính tan máu hay không [14]. Đọc kết quả : Ghi nhận số ống (+), tra bảng Mac Crandy. 2.2. Đánh giá cảm quan Để đánh giá sự khác biệt về cảm quan giữa các cách rửa rau, các mẫu rau sau khi rửa được bảo quản ở tủ lạnh (10 - 15°C) trong 5 ngày, được đánh giá bởi hội đồng cảm quan gồm 10 thành viên. Cảm quan viên được yêu cầu đánh giá về trạng thái và màu sắc dựa trên thang điểm từ 0-5 theo mức độ hài lòng tăng dần. Đánh giá tại phòng thí nghiệm cảm quan. Mỗi cảm quan viên sẽ nhận mẫu có đánh mã ngẫu nhiên khác nhau. 2.3. Phân tích số liệu Số liệu được xử lý nhờ phần mềm MS Excel. So sánh sự khác biệt dựa vào phân tích phương sai (ANOVA), sự khác biệt có ý nghĩa với p≤0,05. Số liệu trình bày trong các bảng số liệu là giá trị trung bình ± mức tin cậy 95%. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trên xà lách từ các vườn rau tại Nha Trang Kết quả khảo sát mức độ nhiễm L. monocytogenes trên 18 mẫu xà lách thu được ở 3 khu vực: Khu vực phía Bắc thành phố Nha Trang, Khu vực phía Nam thành phố Nha Trang và khu vực huyện Diên Khánh được trình bày trên Bảng 1. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes ở các mẫu kiểm tra là 72,2%. Mức nhiễm trung bình là 31,64 MPN/g rau, mẫu rau nhiễm cao nhất là 84 MPN/g rau. L. monocytogenes được phân bố rộng rãi trong môi trường xung quanh, trên thảm thực vật cây trồng, bao gồm cả rau sống [10]. Do vậy có thể giải thích được tần suất nhiễm cao của L. monocytogenes trên các mẫu rau nghiên cứu. Bảng 1. Tình hình nhiễm L. monocytogenes ở các vùng kiểm tra Khu vực Số mẫu nhiễm/ kiểm tra Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g) * Phía Bắc thành phố Nha Trang 5/6 83,3 48,32 ± 50,33 Phía Nam thành phố Nha Trang 5/6 83,3 44,12 ± 48,24 Huyện Diên Khánh 3/6 50 2,47 ± 2,45 Tổng 13/16 72,2 31,64 Ghi chú: *: giá trị trung bình của các mẫu định lượng được Tùy theo từng vùng mà mức độ nhiễm L. monocytogenes khác nhau, từ 2,47 đến 48,32 MPN/g rau. Vùng có mức độ nhiễm thấp nhất là Diên Khánh (2,47 MPN/g rau). Tuy nhiên cũng cần lưu ý rằng, trong cùng một vùng đất nhưng nguồn nước tưới khác nhau có thể ảnh hưởng đến mật độ nhiễm L. monocytogenes trên rau khác nhau. 2. Mối liên quan giữa mức độ nhiễm Listeria monocytogenes và nguồn nước tưới tại các vườn rau liên quan tại Nha Trang Mức độ nhiễm L. monocytogenes phụ thuộc nhiều vào môi trường xung quanh. Một trong những yếu tố liên quan mức độ nhiễm khuẩn là nước tưới. Kết quả kiểm tra cho thấy có mối quan hệ chặt chẽ giữa nguồn nước tưới và số lượng, tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes (kết quả trình bày ở Bảng 2). Hiện tại, nước tưới sử dụng tại mỗi vườn rau trong vùng khác nhau. Sáu mẫu lấy tại vườn rau Vĩnh Hải và Phước Hải (quy mô trồng rau lớn) với nguồn nước tưới là nước ao hồ trong vùng dân cư, tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes đến 100% mẫu kiểm tra với số lượng trung bình 75 ± 6,83 MPN/g. Trong khi đó, các mẫu rau lấy tại vườn rau Phú Sương và Diên Phú 1 (quy mô trồng rau nhỏ) là những vườn rau tưới bằng nước giếng đều cho số lượng L. monocytogenes thấp, trung bình 2,2 ± 0,98 MPN/g rau sống được kiểm tra. Đặc biệt các mẫu lấy tại vườn rau Đồng nai và Diên Phú 2 sử dụng nước ngầm để tưới có tỷ lệ nhiễm thấp 2/6 mẫu kiểm tra với số lượng L. monocytogenes thấp 1,8 MPN/g. Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  39 3. Ảnh hưởng của các cách rửa rau đến mức độ nhiễm Listeria monocytogenes Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các cách rửa rau (xem mục 2.1) đến mức độ nhiễm L. monocytogenes, được trình bày trong Bảng 2. Kết quả cho thấy các cách rửa rau đều làm giảm số lượng L. monocytogenes trên rau xà lách. Với cách rửa 1, mẫu tưới bằng nước ao hồ có số lượng vi khuẩn nhiều giảm đáng kể từ 75 xuống còn 8,47 MPN/g rau (p<0,05). Nhưng đối với mẫu có mật độ vi khuẩn thấp vẫn còn sự hiện diện của vi khuẩn (<1,8 MPN/g). Cách rửa 2 không làm thay đổi nhiều số lượng vi khuẩn. Nhưng ở cách rửa 3, từ 13/18 mẫu nhiễm ban đầu giảm xuống còn 4/18 mẫu nhiễm, trong đó chỉ có 2 mẫu định lượng được, mật độ thấp 1,8 MPN/g. Các mẫu có mật độ vi khuẩn cao ban đầu dù bằng các cách rửa khác nhau vẫn còn tồn tại L. monocytogenes trên các mẫu rau nhiễm, do vậy nguy cơ nhiễm cho người tiêu dùng vẫn còn. Ở 7 mẫu nhiễm số lượng thấp (≤3,6 MPN/g), sau khi rửa theo cách rửa 3 cho kết quả tốt, 6/7 mẫu (86%) không phát hiện được L. monocytogenes trên 25 g, chỉ có 1/7 mẫu (14%) phát hiện được vi khuẩn nhưng không định lượng được (<1,8 MPN/g). Qua thảo luận trên, nếu kết hợp tưới rau bằng nước giếng hoặc nước ngầm với rửa rau theo cách 3 sẽ giảm tối đa nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cho người tiêu dùng. 4. Đánh giá ảnh hưởng của các cách rửa đến trạng thái bên ngoài của rau xà lách trong thời gian bảo quản. Đối với rau ăn sống, trạng thái bên ngoài của rau cũng rất quan trọng bên cạnh đảm bảo an toàn. Trong quá trình nghiên cứu đã kết hợp kiểm tra trạng thái bên ngoài của rau xà lách khi dùng các cách rửa khác nhau, kết quả trình bày trên bảng 4. Bảng 2. Tình hình nhiễm L. monocytogenes trên rau xà lách trước và sau khi rửa Nguồn nước tưới Đối chứng Cách rửa 1 Cách rửa 2 Cách rửa 3 Tỷ lệ mẫu nhiễm Trung bình (MPN/g)* Tỷ lệ mẫu nhiễm Trung bình (MPN/g)* Tỷ lệ mẫu nhiễm Trung bình (MPN/g)* Tỷ lệ mẫu nhiễm Trung bình (MPN/g)* Nước ao hồ 6/6 75±6,83 6/6 8,47±1,52 6/6 6,73±1,13 3/6 1,8±0 Nước giếng 5/6 2,2±0,98 5/6 1,9±0,18 3/6 <1,8 1/6 <1,8 Nước ngầm 2/6 1,8 ±0 2/6 <1,8 2/6 <1,8 0/6 - Ghi chú: *: Giá trị trung bình của các mẫu định lượng được; ( - ): Không phát hiện L. monocytogenes trong 25g/ mẫu; <1,8: Mẫu kiểm tra có nhiễm L. monocytogenes nhưng không định lượng được. Bảng 3. Đánh giá cảm quan về màu sắc, trạng thái bên ngoài của rau xà lách sau khi thực hiện các bước rửa và bảo quản lạnh (10 - 150C) trong 5 ngày Mẫu Quan sát Trung bình điểm cảm quan Đối chứng Bắt đầu có dấu hiệu héo và ngả màu 2,67 ± 0,31 a Cách rửa 1 Còn tươi, giữ được màu xanh ban đầu 4,42 ± 0,33 b Cách rửa 2 Còn tươi, giữ được màu xanh ban đầu 4,25 ± 0,29 b Cách rửa 3 Còn tươi, giữ được màu xanh ban đầu 4,42 ± 0,33 b Ghi chú: a, b : Kết quả phân tích ANOVA (1)Khác ký hiệu: có sự khác biệt có ý nghĩa (p≤0,05) (2)Cùng ký hiệu: không có sự khác biệt (p>0,05) Thử nghiệm cảm quan đối với 4 mẫu, mẫu đối chứng khác biệt so với 3 mẫu đã qua các cách rửa rau khác nhau. Ba cách rửa rau đều cho điểm cảm quan không khác biệt (p>0,05) và so với mẫu đối chứng, giá trị cảm quan của xà lách sau bảo quản ở lạnh 5 ngày cho thấy đánh giá cảm quan tốt hơn rõ rệt (p<0,05). IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua kết quả trên cho thấy 72,2 % mẫu rau xà lách tại một số nhà vườn tại Nha Trang nhiễm Listeria monocytogenes. Mật độ nhiễm trung bình L. monocytogenes trên rau là 31,64 MPN/g rau. Mẫu rau lấy từ vườn tưới bằng nước giếng hoặc Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 1/2012 40  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG nước ngầm cho thấy mật độ nhiễm thấp khi so với tưới bằng nước ao hồ (p<0,05). Thí nghiệm bảo quản rau 5 ngày ở 10-15°C cho thấy rửa rau có tác động tốt đến trạng thái của rau. Các cách rửa rau thường sử dụng đều làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn trên rau ở những mẫu nhiễm cao (p<0,05), nhưng vẫn còn số lượng nhất định sau khi rửa. Với các mẫu có lượng vi khuẩn L. monocytogenes ban đầu thấp (≤3,6 MPN/g), rửa, ngâm với thuốc tím 10 ppm cho kết quả tốt, chỉ còn nhiễm ở 1/12 mẫu (8,3%), ở mức phát hiện trên 25 g rau. 2. Kiến nghị Với kết quả trình bày ở trên cho thấy nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes từ rau xà lách ăn sống là rất lớn. Như vậy, đối với người suy giảm miễn dịch, việc sử dụng rau xà lách ăn sống là mối nguy nhiễm bệnh do L. monocytogenes. Tuy vậy, nếu kết hợp cách tưới rau bằng nước giếng hoặc nước ngầm với cách rửa rau có ngâm thuốc tím 10 ppm trong 10 phút sẽ làm giảm tối đa nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cho người tiêu dùng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anthony D. H. (2011) Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods, in Bacteriological Analytical Manual. FDA. 2. Bailey, J. S., Fletcher, D. L. and Cox, N. A. (1989). Recovery and serotype distribution of Listeria monocytogenes from broiler chickens in the southeastern United States. J. Food Prot. 52:148-150. 3. Brackett, R. E. (1988). Presence and persistence of Listeria monocytogenes in food and water. Food Technol. 42:162-164. 4. FAO/WHO. (2004). Risk Assessment of Listeria monocytogenes in ready–to–eat foods: Interpretative Summary. Microbiological Risk Assessment Series. 5. Farber, J. M., G. W. Sanders, and M. A. Johnston. (1989). A survey of various foods for the presence of Listeria species. J.Food Prot. 52:456-458. 6. Fenlon, D. R., and J. Wilson. (1989). The incidence of Listeria monocytogenes in raw milk from farm bulk tanks in North-East Scotland. J. Appl. Bacteriol. 66:191-196. 7. Fuchs, R. S., and P. K. Surendran. (1989). Incidence of Listeria in tropical fi sh and fi shery products. Lett. Appl. Microbiol. 9:49-51. 8. Gabis, D. A., R. S. Flowers, D. Evanson, and R. E. Faust. (1989). A survey of 18 dry dairy product processing plant environments for Salmonella, Listeria, and Yersinia. J. Food Prot. 52:122- 124. 9. Heisick, J. E., D. E. Wagner, M. L. Nierman, and J. T. Peeler. (1989). Listeria spp. found on fresh market product. Appl. Environ. Microbiol. 55:1925-1927. 10. Larry R. Beuchat. (1996). Listeria monocytogenes. Incidence on vegetables. Food Control, Vol. 7(415):223-228. 11. Liu, D. (2006). Identifi cation, subtyping and virulence determination of L. monocy-togenes, an important foodborne pathogen. Journal of Med. Microb. 55: 645-649. 12. Lovett, J., D. W. Francis, and J. M. Hunt. (1987). Listeria monocytogenes in raw milk: detection, incidence, and pathogenicity. J. Food Prot. 50:188-192. 13. McLauchlin, J. (1987). Listeria monocytogenes, recent advances in the taxonomy and epidemiology of listeriosis in humans. J. Appl. Bacteriol. 63:1-11. 14. Rodriguez, L. D., J. A. V. Boland, J. F. F. Garayzabal, P. E. Tranchant, E. Gomez-Lucia, E. F. R. Ferri, and G. S. Fernandez. (1986). Microplate technique to determine hemolytic activity for routine typing of Listeria strains. J. Clin. Microbiol. 24:99-103. 15. Sleator, R. D., Gahan, C. G. M. and Hill, C. (2003). A postgenomic appraisal of osmotolerance in L. monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology 69:1–9.