Tình trạng sâu răng và Streptoccocus mutans trong nước bọt học sinh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 318 TÌNH TRẠNG SÂU RĂNG VÀ STREPTOCCOCUS MUTANS TRONG NƯỚC BỌT HỌC SINH Trần Thu Thủy*, Haruo Nakagaki** TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu được thực hiện để khảo sát sự hiện diện và số lượng streptococci và Streptoccocus mutans trong nước bọt và tìm hiểu mối liên quan giữa số lượng vi khuẩn và tình trạng sâu răng. Phương pháp: Mẫu nước bọt kích thích được thu thập từ học sinh lớp 1 trường tiểu học Huỳnh Kiến Hoa quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. Đánh giá tình trạng sâu răng bằng chỉ số smt-r (WHO, 1997). DNA của vi khuẩn trong nước bọt được phân ly bằng bộ chiết lọc DNA QIAam DNA Mini Kit (Qiagen). DNA của toàn bộ vi khuẩn, của streptococci và của Streptoccocus mutans được định lượng bằng Taqman TaqMan real-time PCR (7900HT, Applied Biosystems) và chuyển đổi sang số lượng vi khuẩn/ml nước bọt. Kết quả: Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn giữa các cá thể giao động trong 1 biên độ rộng. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về số lượng toàn bộ vi khuẩn, số lượng liên cầu khuẩn và tỷ lệ liên cầu khuẩn giữa nhóm không sâu răng (n=28, smt-t=0) với nhóm có bị sâu răng (n=66, smt-t≥1). Có 5 mẫu nước bọt không phát hiện sự hiện diện của S.mutans với giới hạn định lượng là 20 tế bào vi khuẩn trong hỗn hợp phản ứng PCR. Số lượng trung bình S.mutans (tế bào/ml nước bọt) ở nhóm không sâu răng là 8,5x105 (SD 13,2x105) và nhóm sâu răng là 1,28x107 (SD 2,61x107). Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhóm ở cả số lượng S.mutans và tỷ lệ S.mutans trong tổng số vi khuẩn và trong tổng số liên cầu khuẩn (Mann-Whitney test, p=0,00). Kết quả cho thấy có mối liên quan thuận giữa chỉ số smt-t với cả số lượng S.mutans (r=0,517) và tỷ lệ S.mutans trong tổng số vi khuẩn (r=0,550) và trong tổng số streptococci (r=0,589) (Spearman’ rank test, p=0,00). Kết luận: Các kết quả gợi ý về một sự kết hợp giữa vi khuẩn S.mutans và tình trạng sâu răng ở dân số nghiên cứu. Từ khóa: Streptoccocus mutans, sâu răng, nước bọt ABSTRACT CARIES EXPERIENCE AND STREPTOCOCCUS MUTANS IN SALIVA OF VIETNAMESE SCHOOLCHILDREN Tran Thu Thuy, H. Nakagaki* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 2 - 2013: 318 - 322 Objective: The aim of this study was to quantify oral streptococci and Streptococcus mutans in saliva and to evaluate the association of the amounts of bacteria with caries experience. Methods: 94 6-year-old schoolchildren in Ho Chi Minh City, Vietnam, were examined for caries status (dmf-t, WHO 1997) and stimulated saliva samples were collected. Genomic bacterial DNA was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). The DNA level of total bacteria, oral streptococci and S.mutans were quantified using TaqMan real-time PCR (7900HT, Applied Biosystems) with absolute standard curve method and converted to bacterial cells/ml saliva. Results: The results showed that the levels of bacteria varied widely among subjects. There was no * Khoa Răng hàm Mặt ĐH Y Dược Tp.HCM, ** Trường Nha, ĐH Aichi-Gakuin, Nagoya, Nhật Bản Tác giả liên hệ: Trần Thu Thủy, ĐT: 0913115959, Email: tranthuthuyrhm@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 319 significant difference in the number of total bacteria, oral streptococci and the proportion of oral streptococci between caries free (n=28, dmf-t=0) and caries group (n=66, dmf-t≥1). S.mutans was not detected in saliva of 5 subjects with a detection limit of approximately 20 bacterial cells in the PCR reaction mixture. The mean amount of S.mutans (cells/ml saliva) in caries free and caries group was 8.5x105 (SD 13.2x105) and 1.28x107 (SD 2.61x107), respectively. Significant difference was found between caries free and caries subjects in both the number and the proportion of S.mutans to total bacteria and to oral streptococci (Mann-Whitney test, p=0.00). There was a positive correlation of dmf-t with both the number of S.mutans (r=0.517) and the proportion of S.mutans to total bacteria (r=0.550) and to oral streptococci (r=0.589) (Spearman’ rank test, p=0.00). Conclusion: The results suggested that S.mutans seems to be associated with caries experience in the studied population. Key words: Dental caries, Streptoccocus mutans, saliva ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ sâu răng cũng như mức độ trầm trọng của sâu răng đã giảm đáng kể trong các thập kỷ gần đây, đặc biệt ở các nước công nghiệp hóa. Bất chấp các tiến bộ trong nha khoa phòng ngừa đã được áp dụng dựa trên nền tảng sâu răng là bệnh đa yếu tố, sâu răng vẫn là một trong những bệnh phổ biến nhất cùng với sự tồn tại của một nhóm sâu răng rất cao. Streptococcus mutans được cho là vi khuẩn chủ yếu gây bệnh sâu răng do khả năng sinh acid và chịu đựng được môi trường acid. Nhưng có nhiều loại vi khuẩn khác trong miệng cũng tạo ra acid và chịu đựng được acid. Kết quả của các nghiên cứu vi khuẩn học gần đây cho thấy các Streptococci non-mutans cũng đóng vai trò quan trọng trong bệnh sâu răng(2). Một số nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa số lượng và mật độ Streptococci mutans với tình trạng sâu răng. Một số khác lại báo cáo sâu răng xảy ra mà không cần có sự hiện diện của S. mutans và các cá thể có mức độ S. mutans cao không nhất thiết bị sâu răng(1). Vì thế thông tin chi tiết về số lượng và thành phần vi khuẩn trong miệng có liên quan đến bệnh sâu răng sẽ đóng góp thêm thông tin về vai trò của các vi khuẩn trong bệnh sâu răng, nhận diện nhóm nguy cơ cao và có thể đóng góp trong việc lượng giá nguy cơ sâu răng của một cá thể. Với sự phát triển trong lãnh vực sinh học phân tử, Real-time PCR đã cung cấp một công cụ chuyên biệt, tương đối nhanh với độ nhạy cao để nhận diện và định lượng chính xác vi khuẩn so với phương pháp cấy khuẩn kinh điển(3). Ứng dụng tiện ích của Real-time PCR, để hiểu rõ hơn về quần thể vi khuẩn trong miệng chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm khảo sát sự hiện diện và số lượng streptococci và Streptoccocus mutans trong nước bọt và tìm hiểu mối liên quan giữa số lượng vi khuẩn với tình trạng sâu răng. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu Mẫu nước bọt nghiên cứu được thu thập từ học sinh lớp 1 trường tiểu học Huỳnh Kiến Hoa, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh, ở những học sinh phụ huynh đồng ý cho con tham gia chương trình nha học đường. Học sinh được khám và ghi nhận tình trạng sâu răng theo hướng dẫn của WHO (1997). Để thu thập mẫu nước bọt, học sinh được hướng dẫn nhai 1 viên paraffin và đùn nước bọt ra ly thu thập trong vòng 3 phút. Với mỗi mẫu, 1ml nước bọt được hút và chuyển sang eppendorf polypropylene tube 2ml (loại chuyên biệt cho PCR), bảo quản trong đá và chuyển ngay sang tủ đông -20°C. Các mẫu nước bọt sau đó được đông khô tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm phía Nam để bảo quản cho đến khi sử dụng cho phân tích. Ly trích DNA Đầu tiên, mẫu nước bọt đông khô được rửa với 1000 µl dung dịch PBS rồi trải qua quy trình Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 320 xử lý chuyên biệt dành cho các vi khuẩn Gram (+) để đảm bảo ly trích DNA hiệu quả. Cụ thể, thêm vào mỗi tuýp chứa mẫu 180 µl dung dịch enzyme (20mM tris-HCl, 2mM EDTA, 1% triton X-100, pH 8; 20mg/ml Lysozyme) và 5 µl Mutanolysin (2000U/ml). Hỗn hợp được ủ ở 37°C trong 2 giờ. Sau đó genome của vi khuẩn trong mẫu được tách chiết và tinh lọc bằng bộ chiết lọc DNA làm sẵn (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA sau khi tách được đánh giá độ tinh khiết và nồng độ bằng spectrophotometer (NanoDrop ND- 1000, USA) và bảo quản ở -85ºC cho đến khi phân tích. Real time PCR định lượng vi khuẩn DNA của toàn bộ các loại vi khuẩn (Uni) trong mẫu nước bọt, của streptococci (Strep) và S.mutans (Smu) được định lượng bằng TaqMan Real-time PCR (7900HT Fast Real-time PCR, Applied Biosystems) với phương pháp tính toán trực tiếp từ nồng độ chuẩn. Với PCR định lượng toàn bộ vi khuẩn và streptococci, DNA ly trích từ S.mitis GTC 1101 được dùng để làm chuẩn. Với định lượng S.mutans chuẩn là DNA của S.mutans ATCC 25175. Nồng độ DNA chuẩn cho định lượng toàn bộ vi khuẩn là 3,5 - 0,14ng, tỷ lệ pha loãng 1/5. Nồng độ DNA chuẩn cho định lượng streptococci là 12,8-12,8x10-4ng, cho S.mutans là 4,5-4,5x10-5ng với cùng tỷ lệ pha loãng 1/10. Các cặp primer và TaqMan Probe sử dụng trong nghiên cứu đã được mô tả trong các nghiên cứu trước(6) (Bảng 1) và đặt hàng Applied Biosystems sản xuất. Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích 25 µl gồm 12,5 µl Master Mix, 500 nM cho mỗi primer, 200 nM probe, 5 µl DNA ly trích từ mẫu/DNA chuẩn. Định lượng PCR được thực hiện lặp 3 lần cho tất cả DNA chuẩn và mẫu. Phản ứng PCR thực hiện theo quy trình: 50ºC trong 2 phút, 95ºC trong 10 phút và 60 chu kỳ 95ºC trong 15 giây rồi 58ºC trong 1 phút. Bảng 1: PCR primer và TaqMan probe. Primer và Probe Vi khuẩn chung (Uni) 5’-CGC TAG TAA TCG TGG ATC AGA ATG-3’ 5’-TGT GAC GGG CGG TGT GTA-3’ 5’- FAM-CAC GGT GAA TAC GTT CCC GGG C-TAMRA -3’ Streptococci (Strep) 5’- AGA TGG ACC TGC GTT GTA TTA GCT -3’ 5’- TAC TGC TGC CTC CCG TAG GA -3’ 5’- FAM-CAC ACT GGG ACT GAG ACA CGG CCC-TAMRA -3’ S. mutans (Smu) 5’-GCC TAC AGC TCA GAG ATG CTA TTC T-3’ 5’-GCC ATA CAC CAC TCA TGA ATT GA-3’ 5’-FAM-TGG AAA TGA CGG TCG CCG TTA TGA A-TAMRA -3’ Kết quả định lượng DNA của mẫu được chuyển đổi sang số lượng tế bào vi khuẩn/ml nước bọt theo cách tính toán của Kuboniwa(4), dựa trên số liệu kích thước genome của mutans streptococci là tương đương 2,6 fg DNA, tương tự S.mitis là 2,31fg DNA. Xử lý thống kê Sử dụng kiểm định Mann-Whitney để so sánh số lượng và tỷ lệ vi khuẩn giữa các nhóm, kiểm định Spearman’ rank để khảo sát mối liên quan giữa tình trạng sâu răng và lượng vi khuẩn. KẾT QUẢ Tổng cộng đã phân tích vi khuẩn trong 94 mẫu nước bọt, trong đó có 28 mẫu từ học sinh không bị sâu răng và 66 mẫu của học sinh có ít nhất 1 răng sâu. Số trung bình smt-r ở nhóm sâu răng là 5,3 ± 3,3 (trung bình ± độ lệch chuẩn), với biên độ 1 - 13 răng sâu/cá thể. Mật độ vi khuẩn trong nước bọt thay đổi rất lớn giữa các cá thể trong nghiên cứu. Bảng 2 trình bày số lượng vi khuẩn trong mẫu nghiên cứu. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về số lượng toàn bộ vi khuẩn, số lượng streptococci và tỷ lệ streptococci giữa nhóm không sâu răng với nhóm có bị sâu răng. Có 5 mẫu nước bọt không phát hiện sự hiện diện của S.mutans. Tỷ lệ hiện diện của S.mutans trong nhóm không sâu răng là Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 321 85,7% (24/28), nhóm sâu răng là 94,1% (65/66). Bảng 3 trình bày tỷ lệ streptococci và S.mutans trong nước bọt. Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhóm ở cả số lượng S.mutans và tỷ lệ S.mutans trong tổng số vi khuẩn và trong tổng số streptococci (Mann-Whitney test, p=0,00). Bảng 2: Số trung bình vi khuẩn trong nước bọt. Vi khuẩn (tế bào/ml) Không sâu răng (TB ± ðLC) Sâu răng (TB ± ðLC) Uni 4,87x108±3,78x108 5,04x108±3,46x108 Strep 1,69x108±1,44x108 1,89x108±1,66x108 Smu* 8,50x105±13,2 x105 1,28x107±2,61x107 *: Kiểm định Mann-Whitney p=0,00. Bảng 3: Tỷ lệ streptococci và S.mutans. Vi khuẩn (%) Không sâu răng (TB ± ðLC) Sâu răng (TB ± ðLC) Strep/Uni 35,21 ± 14,00 33,50 ± 15,91 Smu/Uni* 0,24 ± 0,42 2,18 ± 3,96 Smu/Strep* 0,62 ± 1,00 5,78 ± 8,57 *: Kiểm định Mann-Whitney p=0,00. Có mối liên quan thuận giữa chỉ số smt-r với cả số lượng S.mutans (r = 0,517) và tỷ lệ S.mutans trong tổng số vi khuẩn (r = 0,550) và trong tổng số streptococci (r = 0,589) (Spearman’ rank test, p = 0,00). BÀN LUẬN Sâu răng là bệnh đa yếu tố, là hệ quả của mối tương tác giữa vi khuẩn trong miệng, chế độ ăn, hàm răng và môi trường miệng(5). Về mặt vi khuẩn, S.mutans là vi khuẩn trong nhóm có kết hợp với sâu răng thường được phân lập nhất. Vì thế S.mutans được coi là một dấu hiệu gợi ý có giá trị của bệnh sâu răng, nhưng không nhất thiết là yếu tố bệnh căn(1). Số liệu trong nghiên cứu cũng đưa ra các nhận xét tương tự với việc nhận diện S.mutans ở trên 85% cá thể trong nhóm không sâu răng và gần 95% cá thể ở nhóm sâu răng, tương tự với kết quả của các tác giả khác. Hơn thế nữa kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về cả số lượng S.mutans và tỷ lệ của vi khuẩn này trong tổng số vi khuẩn trong miệng và trong tổng số streptococci trong miệng. Kết quả này cho thấy vai trò quan trọng của mật độ/số lượng vi khuẩn trong môi trường miệng, gợi ý về chiến lược dự phòng sâu răng nhắm vào việc giảm số lượng vi khuẩn trong môi trường miệng. Nhóm lứa tuổi học sinh tiểu học, 6 - 12 tuổi, là nhóm tuổi đặc trưng bởi sự tăng trưởng và phát triển. Đây là giai đoạn hàm răng hỗn hợp, có rất nhiều thay đổi tác động đến tình trạng sâu răng như rụng răng sữa và mọc răng vĩnh viễn, thay đổi chế độ ăn. Về tự nhiên, giai đoạn mọc răng từ lúc răng bắt đầu nhú vào trong xoang miệng cho đến khi đạt đến vị trí chức năng là một giai đoạn thử thách rất lớn, nguy cơ sâu răng cao. Tình trạng sâu răng đã qua của răng sữa (thể hiện qua chỉ số smt-r), theo các báo cáo trước, cũng là một dấu hiệu gợi ý có giá trị trong việc đánh giá nguy cơ, tiên lượng sâu răng trong tương lai. Nghiên cứu thực hiện ở học sinh lớp 1, lớp đầu tiên trong giai đọan tiểu học, bắt đầu được chăm sóc răng miệng thông qua chương trình nha học đường nên số liệu thu được sẽ giúp ích thiết thực cho việc hoạch định kế hoạch, nhận diện nhóm nguy cơ cao, hướng tới chương trình phòng ngừa đạt hiệu quả cao giảm thiểu chi phí. Sự kết hợp giữa tình trạng sâu răng (chỉ số smt-r) với cả số lượng và tỷ lệ vi khuẩn S.mutans trong tổng số vi khuẩn trong nước bọt trong kết quả nghiên cứu này phù hợp báo cáo của một số tác giả, tái khẳng định ảnh hưởng của trình trạng sâu răng đã qua tới nguy cơ sâu răng hiện tại và khả năng sâu răng sắp tới. Sâu răng, như đã biết, là kết quả của một tương tác đa yếu tố. Khía cạnh vi khuẩn cùng với các yếu tố khác sẽ góp phần xây dựng một chương trình sàng lọc và chăm sóc phòng ngừa sâu răng, gia tăng sức khỏe răng miệng. Kết quả của nghiên cứu gợi ý việc kiểm soát vi khuẩn trong miệng đặc biệt là S.mutans có thể góp phần phòng ngừa sâu răng đáng kể. Tuy nhiên cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa trong lãnh vực này. KẾT LUẬN Các kết quả gợi ý về một sự kết hợp giữa vi khuẩn S.mutans và tình trạng sâu răng ở dân số nghiên cứu. Các chiến lược phòng ngừa sâu răng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 322 dựa trên việc tác động vào vi khuẩn trong miệng có thể là một hướng nhiều hứa hẹn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Beighton D (2005). The complex oral microflora of high-risk individuals and groups and its role in the caries process. Community Dent Oral Epidemiol, 33(4): 248-255. 2. Takahashi N, Nyvad B (2008). Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res, 42(6): 409-418. 3. Heid CA, StevensJ, Livak KJ, Williams PM (1996). Real-time quantitative PCR. Genome Res, 6: 968-994. 4. Kuboniwa M, Amano A, Kirura KR, Sekine S (2004). Quantitative detection of periodontal pathogens using real- time polymerase chain reaction with Taqman probes. Oral Microbio Immun, 19: 168-176. 5. Marsh PD. (1999). Microbiologic aspects of dental plaque and dental caries. Dent Clin North Am, 43(4): 599-614. 6. Yoshida A, Suzuki N, Nakano Y, Kawada M (2003). Development of a 5’Nuclease-Based Real-time PCR Assay for quantitative detection of cariogenic dental pathogens. Journal of Clin Microbio, 41: 4438-4441.